Opløsning og Bio-konjugering af kvantepunkter og bakterielle Toxicity Analyser ved vækst Curve og Plate Count
Summary
Nanopartikler såsom halvleder kvantepunkter (QDs) kan anvendes til at skabe fotoaktiverbare midler til anti-mikrobielle eller anti-cancer anvendelser. Denne teknik viser, hvordan man vand-opløse cadmiumtellurid (CdTe) QDs, konjugere dem til et antibiotikum, og udføre en bakteriel inhibering assay baseret på vækstkurver og kimtal.
Abstract
Kvantepunkter (QDs) er fluorescerende halvleder nanopartikler med størrelse-afhængig emission spektre, der kan ophidset af et bredt udvalg af bølgelængder. QDs har tiltrukket stor interesse for billedbehandling, diagnostik og behandling på grund af deres klare, stabile fluorescens 1,2 3,4,5. QDs kan konjugeres til en række biologisk aktive molekyler om binding til bakterier og mammale celler 6.
QDs bliver også bredt undersøgt som cytotoksiske midler til målrettet aflivning af bakterier. Fremkomsten af multipelt resistente bakteriestammer som hurtigt bliver en folkesundhedsområdet krise, især i tilfælde af Gram-negative patogener 7. På grund af den velkendte antimikrobielle virkning af visse nanomaterialer, især Ag, er hundredvis af studier af toxicitet af nanopartikler til bakterier 8. Bakterielle undersøgelser er blevet udført med andre typer af halvleder nanopartikler så godt, especially TiO 2 9,10-11, men også ZnO 12 og andre, herunder CuO 13. Sammenligninger af bakteriestammer er blevet udført i disse undersøgelser, sædvanligvis sammenligne en Gram negativ stamme med en grampositiv. Med alle disse partikler er mekanismer toksicitet skyldes oxidation: enten photogeneration af reaktive oxygenspecies (ROS) af partiklerne eller direkte frigivelse af metalioner, der kan forårsage oxidativ toksicitet. Selv med disse materialer, varierer resultaterne af forskellige undersøgelser meget. I nogle undersøgelser af Gram positive teststamme er rapporteret mere følsom end gramnegative 10, i andre er det modsatte 14. Disse undersøgelser er blevet godt revideret 15.
I alle nanopartikel undersøgelser, kan partikel-sammensætning, størrelse, overflade kemi, prøve aldring / opdeling, og bølgelængde, magt, og varigheden af lys eksponering alle dramatisk påvirke resultaterne. Desuden synthesis biprodukter og opløsningsmidler må anses 16 17. High-throughput screening teknikker er nødvendige for at kunne udvikle nye effektive nanomedicin midler.
CdTe QDs har anti-mikrobielle virkninger alene 18 eller i kombination med antibiotika. I en tidligere undersøgelse viste vi, at kobling af antibiotika til CdTe kan forøge toksiciteten over for bakterier, men reducere toksicitet over for pattedyrceller, på grund af nedsat produktion af reaktive oxygenarter fra konjugaterne 19. Selvom det er usandsynligt, at cadmium-holdige forbindelser vil blive godkendt til anvendelse i mennesker, kan sådanne præparater anvendes til desinfektion af overflader eller sterilisering af vand.
I denne protokol, giver vi en enkel tilgang til opløseliggørelse CdTe QDs med mercaptopropionsyre (MPA). De QDs er klar til brug inden for en time. Vi derefter dokumentere kobling til et antimikrobielt middel.
Den anden del af protokollenviser en 96-brønds bakteriel inhibering under anvendelse af konjugerede og ukonjugerede QDs. Den optiske densitet aflæses over mange timer, tillader virkningerne af QD Ud og udsættelse for lys skal vurderes umiddelbart, samt efter en restitutionsperiode. Vi viser også en kimtal til at kvantificere bakteriernes overlevelse.
Protocol
Discussion
Nanopartikler repræsenterer en lovende tilgang til at skabe nye antimikrobielle midler. Vækstkurve analyse er en måde at overvåge bakteriel celledensitet, der adskiller aktivt voksende celler fra vækst-inhiberede celler. Når kombineret med plade tæller, det giver mulighed for en grundig analyse af den antibiotiske potentialet i en konjugat. 96-brønds format tillader forholdsvis højt gennemløb variationer af koncentrationen og andre tilstande, såsom lyseksponering, sidstnævnte er afgørende for lysaktiveret m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NSERC Individual Discovery programmet, NSERC / CIHR Collaborative Health Research Program (CHRP), og NSERC CREATE canadiske Astrobiology Training Program (CATP).
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Borate Buffer Component #1 | Fisher | Boric acid A-74-1 | |
| Borate Buffer Component #2 | Sigma-Aldrich | Sodium Tetraborate B9876 | |
| MPA | Sigma-Aldrich | M5801 | |
| Vivaspin 500 | GE Healthcare | 28-9322 | Various MWCO available |
| Glass vials | Fisher | 03-338C | |
| EDC | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P1004 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #1 | Fisher | NaCl S271 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #2 | BD | Tryptone 211705 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #3 | BD | Yeast Extract 211929 | |
| Lamp for light exposure | Custom | ||
| Clear-bottom 96-well plates | Fisher | 07-200-567 or 07-200-730 | |
| Fluorescence spectrometer | Molecular Devices | ||
| Absorbance plate reader | Molecular Devices | ||
| BactoAgar for solid media | Bioshop | AGR001.1 | |
| Petri dishes round | Fisher | 08-75-12 | |
| Petri dishes rectangular | Fisher | 08-757-11A |
References
- Michalet, X. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Jamieson, T. Biological applications of quantum dots. Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).
- Asokan, S. The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods. Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).
- Chan, W. C. W. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).
- Chan, W. C. W., Nie, S. M. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science. 281, 2016-2018 (1998).
- Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).
- Boucher, H. W. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).
- Morones, J. R. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).
- Mitoraj, D. Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide. Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).
- Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings. J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).
- Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).
- Nair, S. Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, S235-S241 (2009).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Rincon, A. G., Pulgarin, C. Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater. Catal. Today. 101, 331-344 (2005).
- Neal, A. L. What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).
- Kovochich, M. Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition. Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).
- Hoshino, A. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates. Nanotechnology. 22, 185101 (2011).
- Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production. Nanoscale. 2, 114-121 (2010).
- Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies. Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).
- Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. v. a. n. d. e. r. The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots. Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).
