Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate
Summary
Les nanoparticules telles que les points quantiques à semi-conducteurs (QDS) peut être utilisé pour créer des agents photo-activables pour les applications anti-microbiens ou anti-cancer. Cette technique montre comment l'eau solubiliser en tellurure de cadmium (CdTe) QDs, les conjuguer à un antibiotique, et d'effectuer un test d'inhibition bactérienne basée sur les courbes de croissance et numération sur plaque.
Abstract
Boîtes quantiques (QDS) sont des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes dont la taille dépend de spectres d'émission pouvant être excités par un choix large de longueurs d'onde. QDs ont attiré beaucoup d'intérêt pour l'imagerie, le diagnostic et la thérapie en raison de leur brillante, la fluorescence stable 1,2 3,4,5. BQs peut être conjugué à une variété de molécules bio-actives pour se lier à des bactéries et des cellules mammaliennes 6.
Les points quantiques sont également largement étudiée comme agents cytotoxiques pour assassinat ciblé des bactéries. L'émergence de multiplier les souches bactériennes résistantes aux devient rapidement une crise de santé publique, en particulier dans le cas de germes à Gram négatif 7. En raison de l'effet bien connu antimicrobienne de certains nanomatériaux, en particulier Ag, il ya des centaines d'études portant sur la toxicité des nanoparticules à des bactéries 8. Des études bactériennes ont été effectuées avec d'autres types de nanoparticules semi-conductrices ainsi, spécially TiO 2 9,10-11, mais aussi de ZnO 12 et autres, y compris CuO 13. Quelques comparaisons de souches bactériennes ont été effectuées dans ces études, généralement comparant une souche à Gram négatif avec un Gram positif. Avec toutes ces particules, les mécanismes de toxicité sont attribués à l'oxydation: soit l'photogénération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par les particules ou le rejet direct d'ions métalliques qui peuvent causer la toxicité oxydative. Même avec ces matériaux, les résultats des différentes études varient considérablement. Dans certaines études, la souche d'essai à Gram positif est censément plus sensible que les 10 à Gram négatif, dans d'autres c'est le 14 en regard. Ces études ont été étudiées en 15.
Dans toutes les études de nanoparticules, la composition des particules, la taille, la chimie de surface, l'échantillon vieillissement / ventilation, et de longueur d'onde, la puissance et la durée d'exposition de lumière peuvent tous affecter les résultats de façon spectaculaire. En outre, SYNTHESIsous-produits s et les solvants doivent être considérées 16 17. Techniques de criblage à haut débit sont nécessaires pour être en mesure de développer des agents efficaces de la nanomédecine nouvelles.
QDs CdTe ont effets anti-microbiens seuls 18 ou en combinaison avec des antibiotiques. Dans une étude précédente, nous avons montré que le couplage d'antibiotiques pour CdTe peut augmenter la toxicité pour les bactéries, mais de diminuer la toxicité pour les cellules de mammifères, en raison de la production a diminué d'espèces réactives de l'oxygène à partir des conjugués 19. Bien qu'il soit peu probable que le cadmium composés contenant sera approuvé pour utilisation chez les humains, ces préparations peuvent être utilisées pour la désinfection des surfaces ou la stérilisation de l'eau.
Dans ce protocole, nous donnons une approche simple pour solubiliser les points quantiques de CdTe avec de l'acide mercaptopropionique (MPA). Les points quantiques sont prêts à utiliser moins d'une heure. Nous démontrons ensuite le couplage à un agent antimicrobien.
La deuxième partie du protocoledémontre un test d'inhibition de 96 puits en utilisant des bactéries les boîtes quantiques conjugués et non conjugués. La densité optique est lue pendant plusieurs heures, permettant aux effets de l'ajout QD et exposition à la lumière d'être évalués immédiatement ainsi que, après une période de récupération. Nous présentons aussi un comptage des colonies pour quantifier la survie des bactéries.
Protocol
Discussion
Les nanoparticules représentent une approche prometteuse pour la création de nouveaux agents anti-microbiens. Analyse de la courbe de croissance est un moyen de contrôler la densité des cellules bactériennes qui distingue les cellules activement croissantes de-croissance des cellules inhibées. Lorsque couplée avec un nombre de plaques, il permet une analyse approfondie du potentiel antibiotique d'un conjugué. Le format de 96 puits permet des variations relativement à haut débit de concentration et d'au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le programme de découverte individuelle du CRSNG, le CRSNG / IRSC Programme de recherche concertée sur la santé (PRCS), et le CRSNG CREATE Programme canadien de formation astrobiologie (CATP).
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Borate Buffer Component #1 | Fisher | Boric acid A-74-1 | |
| Borate Buffer Component #2 | Sigma-Aldrich | Sodium Tetraborate B9876 | |
| MPA | Sigma-Aldrich | M5801 | |
| Vivaspin 500 | GE Healthcare | 28-9322 | Various MWCO available |
| Glass vials | Fisher | 03-338C | |
| EDC | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P1004 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #1 | Fisher | NaCl S271 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #2 | BD | Tryptone 211705 | |
| Bacterial growth medium (LB) Component #3 | BD | Yeast Extract 211929 | |
| Lamp for light exposure | Custom | ||
| Clear-bottom 96-well plates | Fisher | 07-200-567 or 07-200-730 | |
| Fluorescence spectrometer | Molecular Devices | ||
| Absorbance plate reader | Molecular Devices | ||
| BactoAgar for solid media | Bioshop | AGR001.1 | |
| Petri dishes round | Fisher | 08-75-12 | |
| Petri dishes rectangular | Fisher | 08-757-11A |
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