Summary
בעבודה זו נסביר את ייצור ושימוש במיקסר microfluidic מסוגל ערבוב שני פתרונות ~~~HEAD=NNS 8 μs. כמו כן, אנו מדגימים את השימוש מערבלי אלה עם זיהוי ספקטרוסקופיות באמצעות הקרינה UV ותהודה הקרינה העברת אנרגיה (סריג).
Abstract
תהליך שבו חלבון מתקפל לתוך קונפורמציה המקורית שלו רלוונטי במיוחד ביולוגיה בריאות האדם אך עדיין ממעטים להבין. אחת הסיבות לכך היא מתקפלת מתרחש על פני טווח רחב של לוחות הזמנים, החל ננו שניות עד שניות או יותר, תלוי חלבון 1. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי אפשרו מדידה של קינטיקה מתקפלים החל על 1 טרשת נפוצה. פיתחנו לאחרונה מערבל microfluidic כי מדלל denaturant ~ 100 של פי ~ 8 μs 2. שלא כמו מערבל הפסיקה זרימת, מערבל זה פועל משטר הזרימה למינרית שבו מערבולות אינה מתרחשת. העדר מערבולת מאפשר סימולציה נומרית מדויקת של כל תזרימי בתוך מיקסר עם הסכם מצוין להתנסות 3-4.
זרימה למינרית מושגת על מספרי ריינולדס מחדש ≤ 100. עבור תמיסות מימיות, זה דורש מידה הגיאומטריות מיקרון. אנו משתמשים מצע קשה, כמו סיליקון או sili התמזגוCA, כדי להפוך את ערוצי 5-10 מיקרומטר רחב ו 10 מיקרומטר עמוק (ראה תרשים 1). הממדים הקטנים ביותר, בכניסה לאזור ערבוב, הם בסדר גודל של 1 מיקרומטר בגודל. השבב הוא חתום עם זכוכית דקה או coverslip סיליקה מותכת עבור גישה אופטית. טיפוסי סך הכל תזרים ליניארי הם ~ 1 מ '/ ש, Re מניב ~ 10, אבל את צריכת החלבון הוא רק ~ 0.5 NL / s או 1.8 μL / שעה. ריכוז החלבון תלויה בשיטה זיהוי: עבור טריפטופן הקרינה ריכוז טיפוסי הוא 100 מיקרומטר (לחלבון 1 / TRP) ועל סריג ריכוז טיפוסי הוא ~ 100 ננומטר.
תהליך הקיפול הוא שיזם דילול מהיר של denaturant מ ז 6 ל hydrochloride 0.06 guanidine ז. חלבון denaturant גבוה זורם במורד הערוץ המרכזי מתקיים בכל צד על אזור חיץ על ידי ערבוב ללא denaturant נע ~~~HEAD=NNS 100 פעמים מהר יותר (ראה איור 2). גיאומטריה זו גורמת התכווצות מהירה של תזרים החלבון לתוך צרהמטוס ~~~HEAD=NNS 100 ננומטר רחב. דיפוזיה של מולקולות denaturant האור הוא מהיר מאוד, תוך דיפוזיה של מולקולות חלבון כבדות הרבה יותר לאט, מתפשטים והולכים פחות מ 1 מיקרומטר 1 טרשת נפוצה. ההבדל דיפוזיה מתמדת של denaturant והתוצאות חלבון בדילול מהיר של denaturant מהנחל חלבון, הקטנת ריכוז יעיל של denaturant סביב החלבון. מטוס חלבון זורם בקצב קבוע לאורך ערוץ התבוננות הקרינה של חלבון במהלך קיפול ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת 5.
Protocol
1. ייצור של שבבי ערבוב microfluidic
איור 3 מציג את השלבים ייצור בסיסיים.
- נקו 4 אינץ' (100 מ"מ) ופלים סיליקה התמזגו עם פתרון Piranha רעננה (03:01 H 2 SO 4: H 2 O 2): א) חום חומצה גופרתית עד 130 מעלות צלזיוס ואז לשפוך על מי חמצן. שים לב, חספוס פני השטח ואת השטיחות של ופלים סיליקה התמזגו משמש תפקיד חשוב לשלב הסופי מליטה. ב) לטבול את פרוסות לפחות 30 דקות. ג) במשך 5 דקות לשטוף עם מים ויבשה. החל ציפוי (פולי) polysilicon, ~~~HEAD=NNS 1 מיקרומטר עבים לכל עומק בכל 10 נועד מיקרומטר של ערוצי microfluidic הסופי, תוך שימוש בלחץ נמוך כימי שיקוע (LPCVD) תנור.
- נקו את ופלים המסכה באמצעות פרוטוקול Piranha בשלב 1.1. לנקות את המסכה באותה דרך, ולאחר מכן לשטוף עם מתנול אצטון, ו isopropanol ופן מיידי. מייבשים את פרוסות על צלחת חמה ב 150 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (~~~HEAD=NNS להשתמש באוהל בנייר אלומיניום כדי לשמור על חלקיקים ממנו) או בתנור 120 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 120 (רצוי למשך הלילה). כדי להגביר את הידבקות photoresist, מיד לחשוף את פרוסות חמים כדי HMDS אדי במשך 5 דקות. המעיל ספין פרוסות עם שכבת 900 ~ ננומטר עבה של photoresist AZ5214 ואופים רכה על 90 מעלות צלזיוס ישירות על פלטה חשמלית דקה 1 או בתנור על 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 3, שלב 1).
- יישר את המסכה ולעשות קשר חזק ואקום. לחשוף לאור UV למשך מספר שניות (האנרגיה הכללית: ~ 103 mJ / cm 2) (איור 3, שלב 2). לפתח עם AZ400K מפתח, בדילול 04:01 עם מים די של ~ 50 שניות (עד photoresist מפותחת במלואה) בזמן בעדינות להסעיר. יש לשטוף במים במשך 2 דקות. בדוק עם תכונות המיקרוסקופ (איור 3, שלב 3). אם תכונות נפתרו כהלכה, להפשיט photoresist ולהתחיל שוב מ 1.2. קשה ואופים 115 מעלות צלזיוס ישירות על פלטה חשמלית במשך 2דקות.
- Descum ופלים עם אשר O 2 או פלזמה של 2.5 דקות בכל הכוח RF 100 W. באמצעות עמוק תגובתי יון חרט (DRIE), לחרוט את השכבה polysilicon לאורך כל הדרך כדי סיליקה התמזגו להלן. להפשיט photoresist הנותרים עם PRS2000 להתנגד חשפנית על 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. יש לשטוף ולייבש. למדוד את עומק לחרוט על מנת להבטיח זה לאורך כל הדרך ציפוי פולי (איור 3, שלב 4).
- שימוש DRIE תחמוצת מסוגל כגון חרט ULVAC NLD-6000, סיליקה מותכת לחרוט עד לעומק של ~ 10 מיקרומטר לכל עובי מיקרון של ציפוי פולי (איור 3, שלב 5). זה ציפוי פולי יהיה נשחקו במהלך תחריט, כך שהוא עשוי להיות נחוץ כדי לבדוק את שלמות הציפוי מעת לעת במהלך תהליך צריבה. אם אזורים ייחוד בכוונה של רקיק פני השטח הפכו להיות חשופה של ציפוי פולי המגן במהלך תחריט, השטח הפך ככל הנראה מגולענים כבר לא יהיה מתאים מליטהבשלבים הסופיים של הייצור. במקרה זה רקיק הוא כנראה כבר לא בת קיימא. לנקות עם מטריקס אשר במשך 4 דקות, 100 כוח W RF. להפשיט polysilicon עם 2 XeF חרט (איור 3, שלב 6). ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב 1.4 ו על שלב זה מספר פעמים כדי להסיר את כל הציפויים photoresist ו פולי.
- ספין ופלים מעיל עם שכבה חדשה ~ 1 מיקרומטר של photoresist להגן על ערוצי במהלך הטיפול שלאחר מכן. הכניסה והיציאה לקידוח חורים שבב אחד באמצעות המחשב נשלט היהלום שקצהו מקדחה ידנית או עם sandblaster (איור 3, שלב 7). אם באמצעות מקדח, לעלות על פרוסות סיליקון (תכונה בצד למטה) על צלחת זכוכית הקורבן באמצעות אקווה בונד 55, מקפיד לשמור על בונדר ללא בועות. לקרר את התרגיל עם פתרון מיקרו-90 ניקוי. דבר זה שומר פיסות קטנות של זכוכית יידבקו לערוצים אשר לאחר מכן להדביק את השבבים במהלך השימוש.
- שוטפים את פרוסות סיליקון במים DI באמצעות מזרק כדי להזריק Water לתוך כל חור. משרים במי סבון למשך שעה. הסר photoresist ו בונד אקווה עם PRS 2000 על 60 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות עד משטח נקי. יש לשטוף את פרוסות סיליקון במים DI ו במי סבון חמים. יש לשטוף כל חור שוב עם המזרק, הימנעות תכונות חרוט. רקיק יבש עם חנקן בתנור ואקום להגדיר עד 120 ° C. בדוק חורים כדי לוודא שהם ללא חצץ וחזור ניקוי צעדים לפי הצורך. למדוד את עומק הערוצים עם מאבחן גם משטח אופטי או מכני (איור 3, שלב 8).
- ופלים נקיים מספר שווה ערך של 170 מיקרומטר עבים התמזגו כיסוי משקפיים עם סיליקה 1) פתרון Piranha (1-2 שעות בהתאם לנוהל ב 1.1), 2) RCA 2 (DI 05:01:01: HCl: H 2 0 2 ) פתרון במשך 10 דקות ב 75 ג, 3) RCA 1 פתרון (05:01:01 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) במשך 22 דקות בכל 75C). יש לשטוף במים DI במשך 5 דקות בין כל פתרון.
- במקום אחד תכונות פרוסות כלפי מעלה על גביערימה של מגבונים לחדרים נקיים 3-4 מונח על גבי משטח ישר וקשה, כגון חלונית קטנה של זכוכית. לייבש פרוסות היטב עם גז חנקן למשך לפחות 5 דקות. חזור על זכוכית המכסה. להרים כוס כיסוי על שפת והפוך כזה שהצד מלוטש מתקיים הפנים כלפי מטה על פרוסות סיליקון וליישר את הקצוות שטוח. לרדת בזהירות את הזכוכית המכסה על גבי פרוסות סיליקון ולאפשר לו להתיישב. הסט אופקית רק כדי להתאים את היישור. לדחוף למטה באצבע אחת על מרכז של פרוסות סיליקון. צריך לראות מול מליטה מתחילים להקרין כלפי חוץ. אם יש צורך, להפעיל לחץ נוסף לתפקידים אחרים ברחבי רקיק לקדם מול מליטה (איור 3, שלב 9).
- מניחים את פרוסות אטומים בתנור בחום גבוה מוגדר כבש מ טמפ החדר עד 800 ° C מעל 3 שעות, ולאחר מכן 800-1100 ° C מעל עוד 1.2 שעות. החזק ב 1100 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ולאחר מכן כבש לטמפרטורת החדר על עוד 1.5 שעות.
- קוביות עם חיתוך פרוסות ראה את אנישבבי ndividual (איור 3, שלב 10).
- הפרוטוקול מתאר את ייצור של ערוצים מצע חריג למדי סיליקה מותכת אשר הכרחי לגילוי UV. אבל פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם על מצע סיליקון אשר דורש רק צעד אחד תחריט 2. זכוכית (אך לא סיליקה התמזגו) זכוכית מכסה יכול להיות קשור פרוסות סיליקון באמצעות מליטה anodic.
2. הרכבה וטעינה צ'יפס
- סעפת להחזיק את השבב ערבוב פתרונות יכול להיות עשוי פלסטיק, כגון Lexan או פרספקס, או אלומיניום עבור בקרת טמפרטורה (ר 'איור 4). אם אתה משתמש אלומיניום, מאגרי הפתרון צריך להיות מצופה parylene כדי למנוע פירוק של אלומיניום על ידי פתרונות המלח המאגרים. הטמפרטורה של סעפת, פתרונות כולו השבב ניתן לשלוט עם מכשירים תרמואלקטרי רכוב על הצדדים, בקר אלקטרוני.
- השבב הוא זוגה של מאניקיפול קטן על ידי O-טבעות שנערך במקום עם טבעת שמירה המאפשר תצוגה ברורה של מרכז אופטי של השבב. את O-Ring חריצים צריך להיות רדוד יותר מהמקובל על מנת להבטיח הזדווגות טובה ללא הפעלת לחץ רב מדי על שבב, כלומר, 002 O-Ring צריך להיות 0.025 "עמוק. לאחר השבב מותקן, להוסיף פתרונות מאגרי מרכז וצד , דואג לשחרר את כל הבועות לכודים בחלק התחתון של וולס.
- בגלל הנפחים במיקסר זה הם כל כך קטנים, זרימת יכול להיות נשלט עם לחץ אוויר להחיל מעל בארות פתרון. איור 4 מראה את הסעפת בלחץ הזדווגו לחלק העליון של סעפת שבב ידי טבעות אטימה. סעפת הלחץ מחובר למחשב שבשליטת מתמרים הלחץ שיכול לשמור לחצים מ ~ 2-80 PSI. השבב תוכנן כך הלחצים שווים על ערוצי מרכז וצד לייצר ~ 100 פי היחס בין ספיקות ליניארי. ב 20 PSI, קצב הזרימה ליניארית בערוץ היציאה הוא ~ 1 מ '/ S.
- מניחים על סעפת מיקרוסקופ הפוך ולבחון ערבוב באזור עם העינית או פלט המצלמה. פנס זוהר מונח על גבי סעפת תספק מספיק אור. השתמש ראשי צבע או גבוהה של הפתרון השבירה (כלומר 6 מ guanidine hydrochloride) בערוץ במרכז לצפיה של מטוס סילון.
- בלחץ שווה על ערוצי מרכז וצד, מטוס יהיה קשה לראות בעין כדי להתחיל עם הלחץ מצד ערוץ ב 0 PSI ולאט לאט להגביר את הלחץ שווה. אם ערוץ אחד בצד סתומה, מטוס יהיה דחף מול אחד הקירות של ערוץ היציאה. אם המחסום נראה לעין, ניתן וחילצה על ידי הפעלת לחץ או ואקום לערוץ יציאה עם מזרק.
- אם חלבון או חומר אורגני אחר סותם את השבב, ניתן לנקות על ידי טבילה בתמיסת Pirhana לילה.
3. איסוף נתונים
איור 5 מראה את הפריסה הבסיסית מכשיר אופטי.
- להביא קרן לייזר collimated לתוך מיקרוסקופ מחקר בכיתה תוך שימוש במראה dichroic או בתוך או מחוץ המיקרוסקופ. יישר את הלייזר כך המיקוד ניתן לראות בעינית המצלמה או משהו קרוב באזור ערבוב.
- הקרינה מן החלבון במיקסר נאסף על ידי המטרה ושלח את המראה dichroic, התמקד על ידי העדשה כדי חריר וצילמו על הדלפק פוטון. סרוק באמצעות סורק שבבים פיזואלקטריים ב X ו-Y את התמונה באזור ערבוב (גודל צעד טיפוסי הוא 2 מיקרומטר). בחר עמדה על מטוס וסריקה ב X ו-Z כדי למצוא את המוקד במרכז ערוץ אנכית. עומק השדה של המיקרוסקופ היא הרבה פחות עומק ערוץ ספיקה אחידה בערוץ 1 מיקרומטר, למעט בתוך הקירות. לכן הפתרון הזמני של הקרינה הנצפית נקבע בעיקר על ידי גודל של נקודה confocal.
- סריקה אופקית בתוך ערוץ יציאה (אופייני בשלב זהize הוא 0.2 מיקרומטר פני סילון, 2 מיקרומטר לאורך הסילון) ב 100 מיקרומטר במרווחים לאורך הסילון, התבוננות לתפקיד ~ MS 1 דולר (ראה איור 6). להזיז את הבמה על ידי מיקרוסקופ 80-90 מיקרומטר יחד מטוס לתפוס בתקופות מאוחרות יותר.
- לחילופין, האור יכול להתגלות הספקטרוגרף ו CCD אחרי המראה dichroic באמצעות העדשה למקד את האור על סדק הכניסה. מאז איסוף הנתונים היא איטית יותר מאשר למדיניות נגד פוטון (1 2 למשרת), בדרך כלל על מטוס הוא צילמו 1 עם הדלפק פוטון ואז נקודות לאורך הסילון נמדדים עם הספקטרוגרף (ראה איור 7).
- נתוני הדלפק פוטון מנותח על ידי סיכום 3-5 פיקסלים סביב מטוס על כל עמדה כדי ליצור חלקת עוצמת לעומת המרחק. הזמן מחושב מרחוק באמצעות המהירות מחושב על סמך לחצים שימושית (ראה איור 8).
- נתוני הספקטרוגרף ניתן לנתח כמה דרכים. עבור סריג, channeLS ייעודיים כמו "התורם" ו "acceptor" יכול להיות כל אחד סיכם את יחס הקרבה E = אני / (אני D + I D) מחושב (ראה איור 9). לחלופין, פירוק ערך יחיד ניתן לבצע להסתכל על רכיבים ספקטרליים בלתי תלויים לעומת זמן, כמו שינוי בספקטרום הפליטה טריפטופן בתור קפלי חלבון.
- מרחק בתוך ערוץ יציאה ניתן להמיר הזמן לפי שער זרם בלתי פוסק נקבע מלחץ המופעל על ערוצי לוואי. בתוך 2 מיקרומטר הראשונים של ערוץ היציאה, את קצב הזרימה של סילון חלבון מאיצה ~ 100x ואת הזמנים באזור כי יש לחשב עם ניתוח אלמנטים סופיים של מייעלת (בהפקת הזמן להתוות איור 8). האצה זו מייצרת קיזוז של ~ 1-2 μs אחרי המהירות הופך להיות קבוע בדרך כלל ניתן להתעלם במדידת הקינטיקה הרבה יותר איטית מאשר ערבוב.
4. נציג תוצאות
איור 6 מציג עלילה קווי המתאר של עוצמה באזור ערבוב נמדדת הדלפק פוטון. הרקע בערוץ היציאה מחוץ מטוס צריך להיות קרוב לרצפה הרעש של גלאי, והוא בדרך כלל לא מפחיתים. הרקע גבוה יותר עשוי להצביע על תיאום לקוי או כי חלבון דבק קירות הערוץ. מטוס שנראה מפותל או עקום, במיוחד ליד אזור ערבוב, מציין לחרוט ירודה של הפיות.
איור 7 מציג את הזמן לפתור ספקטרום של חלבון acyl-אנזים מחייב חלבון (ACBP) שכותרתו עם Alexa Alexa 488 ו 647. מידע זה כבר הרקע מופחתים להסיר את החיוב כהה אותות לייזר. האות הרקע נלקח עם הלחץ במרכז הערוץ מוגדר 0 PSI.
השעה ערבוב ניתן למדוד על ידי מדידת התגובה המהירה, כי הוא הרבה יותר מהר מאשר ערבוב כגון trp הקרינה מרווה בy KI או קריסה של גדילי הדנ"א אחד, שכותרתו עם סריג צבעים, על ידי תוספת של NaCl. בגלל מטוס קטן יותר ברזולוציה אופטית של מיקרוסקופ, יש ירידה בעוצמה גדולה באזור ערבוב כמו הצורות סילון. תגובה זו המכשיר ניתן להסיר על ידי ביצוע מדידה שליטה שבו אין תנאים פתרון שינוי. איור 8 מראה את היחס בין ערבוב (אל mM 400 KI) ולא ערבוב הניסויים של הקרינה N-אצטיל אמיד טריפטופן. הקו מראה את ריכוז החזוי של KI מ סימולציות COMSOL. זמן ערבוב, כפי שהיא נמדדת במשך הזמן ריכוז להפחית 80%, הוא 8 μs.
מאז איסוף הנתונים ב 100 מיקרומטר במרווחים לאורך ערוץ מיקרומטר באורך 500 יציאה, הנתונים חייבים להדביק יחדיו תצוגות מרובות. יש קיזוז קטנות מדי פעם אותות בין הדעות הללו, כנראה עקב שינויים קטנים להתמקד כמו שבב מועברת אל שלב מיקרוסקופ. על ידי העברת בשלב 80 או 90מיקרומטר לכל תצוגה, מנטרל אלה ניתן למנוע על ידי בחינת נתונים חופפים. בדרך כלל הנתונים נאספים עם לפחות שני ספיקות והנתונים בשילוב לאשר כל שינוי אות הן בשל שינויים ספקטרוסקופיות אמיתיים חלבון, ולא תופעות אופטיות או לזרום. איור 9 מראה סריג שינויים ACBP חלבון לאחר דילול denaturant מ M 6 לנתונים 0.06 מ 'זה לא צריך ניסוי השליטה מאז סריג כבר היחס והתגובה המכשיר יוסר כבר. קפיצה מהירה ליד ט = 0 מייצג את השינוי המהיר של סריג האות תוך זמן ערבוב.
באיור 1. פריסה של אזור הערבוב נמדד על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
איור 2. סכמטי של הידרודינמית ערבוב ללמוד קיפול חלבונים. חלבון,מומס denaturant גבוהה כדי לפתוח אותו, זורם במורד הערוץ לכיוון מרכז האזור ערבוב שבו היא עומדת חוצץ זורם ~~~HEAD=NNS פי 100 יותר מהר. זרימה למינרית מאלץ זרם החלבון לתוך מטוס צר שממנו מולקולות denaturant יכול לנטרל במהירות. כמו סילון זורם במורד הערוץ היציאה, החלבון ניתן לצפות עם רזולוציה מרחבית הזמן באמצעות מיקרוסקופ confocal.
איור 3. ייצור סיליקה מותכת. 1) התהליך מתחיל עם המצע מצוחצחים סיליקה בעובי 500 מיקרומטר התמזגו (א) בשכבה של polysilicon (פולי) שהופקדו על פני השטח העליונים והתחתונים (ב) ו ספין מצופה בשכבת photoresist (ג). 2) photomask (ה) מובא int o קשר חזק עם רקיק ועל photoresist נחשף לאור UV (ד). 3) רקיק ממוקם באמבטיה מפתחת דפוס מתגלה photoresist. 4) רקיק ממוקם DRIE ואת התכונות חקוקות לתוך ציפוי פולי העליון. Photoresist מוסר מכן. 5) פולי ואז מעשים כמו מסכה כאשר רקיק ממוקם חרט תחמוצת התכונות חקוקות 10-40 מיקרומטר לתוך מצע סיליקה מותכת. 6) ציפוי פולי מוסר אז חרט XeF 2. 7) רקיק הוא קשור צלחת זכוכית הקורבן עם איטום חום פעיל (ז), תכונות הצד למטה, קצת מקדח יהלום (ו) בצרימה מקדחות דרך חורי מהישבן. 8) מאבחן פני השטח (ח) ואז ישירות מודד את עומק תכונה חרוט. 9) 170 מיקרומטר coverslip עבה התמזגו רקיק סיליקה היא ערובה ישירות על המשטח העליון של פרוסות סיליקון. 10) פרוסות סיליקון הוא חתוך לקוביות לתוך שבבי microfluidic בודדים.
3976/3976fig4.jpg "/>
איור 4. סעפת מערבל. Microfluidic שבב מאובטח על סעפת פתרון עם לוחית אלומיניום במכונה ו 4 טבעות אטימה תחת ~~~HEAD=NNS 200 מאגרי μL. חור גדול הוא במכונה דרך מרכז סעפת ישירות מעל אזור ערבוב של שבב microfluidic מודבקת, המאפשר מעבר אור UV לברוח בלי, backscattering עיכוב הקרינה אוטומטי כל מן הסעפת עצמה ולאפשר תאורה ישירה של שבב בעין או המצלמה על יישור. את סעפת אוויר חותמות כל אחד המאגרים כאלה כי לחץ האוויר בכל אחד ניתן לשלוט באמצעות תיבת לחץ חיצוני השליטה.
איור 5. סכמטי של מיקרוסקופ אופטי confocal.
איור 6. העלילה קונטור של טריפטופןהקרינה במיקסר microfluidic. האזור ערבוב ממוקמת ~~~HEAD=NNS 90 מיקרומטר על ציר ה-Y.
איור 7. ספקטרום תלוי זמן ניאון נאסף בתוך מיקסר. המלבנים הירוקים והאדומים להראות את אורכי הגל המסומנים ערוצי התורם acceptor, בהתאמה.
איור 8. הזמן נמדד על ידי ערבוב מרווה הקרינה של טריפטופן של יודיד האשלגן (נקודות ו ציר מימין) מחושב על ידי ניתוח אלמנטים סופיים (קו ציר שמאלי).
איור 9. סריג השינויים שנמדדו במהלך קיפול של ACBP חלבון. העלייה המהירה ליד ט = 0 מייצג שלב פרץ בתוך זמן ערבוב עלייה איטית יותר מייצג accumula הדרגתיתtion של המבנה כמו קפלי חלבון. הנתונים נלקח בשני ספיקות שונים ויצף, המוביל צפיפויות שונות של מדידות בזמנים שונים.
Discussion
ערבוב מהיר הייתה המטרה פיתוח בתחום קיפול חלבונים במשך שנים רבות משום שהיא מוכרת מזה זמן רב כי התהליכים המולקולריים של ביומולקולות להתרחש על סולמות זמן החל picoseconds כדי שניות. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי יש פעמים המתים של 1-5 MS אשר מוגבלת בעיקר על ידי תסיסה. הסוערים מערבלי זרימה רציפה עם זמני ערבוב של 30-300 μs פותחו במהלך 15 השנים האחרונות על ידי מספר קטן של קבוצות, אך בדרך כלל דורשים ספיקות גבוהות כדי להשיג את הזמנים ערבוב ולכן משתמשים הרבה מדגם 6-8.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של שבבי ערבוב microfluidic להשיג דילול מהיר של משטר זרימה למינרית. יש יתרונות רבים על עבודה במסגרת המשטר הזה, אבל העיקרית היא היכולת לדמות את תהליך ערבוב כל עם דיוק גבוהה, אשר מאפשר לשנות את התגובה ערבוב. T-מערבלי שפותחו על ידי קבוצות אחרות עם geom פשוטהetries הוכיחו פעמים ערבוב של 100-200 μs כי היו מוגבלים בעיקר על ידי גודל של 9-10 ערוצים. לפי קנה המידה את הגודל של הערוצים כדי נייט 10 מיקרומטר הפחית את הזמן כדי ערבוב ~ 10 μs 11. יאו ו Bakajin הראו כי שינויים קטנים בגיאומטריה יכול להוביל לשיפור משמעותי בזמן ערבוב 4. עם זאת, העבודה מראה כי האצת ערבוב יכול גם להוביל בשלבים איטיים יותר גם כן. העיצוב נעשה שימוש בעבודה זו 12-13 היא פשרה בין שני העיצובים הטובים ביותר התייחסות 4 כדי למזער את הדעיכה המעריכית איטי יותר בריכוז denaturant וגם להפוך תכונה לשחזור יותר תחריט DRIE.
יש כבר כמה מחלוקות בתחום ultrarapid ערבוב על ההגדרה של זמן ערבוב. חשוב להכיר את ההבדל בין "זמן ערבוב" ו - "זמן מת". זמן מת מוגדר במיקסר סוערת עם הזמן שבמהלכו מדידותלא לא יכול להיות ויכול למעשה להיות משמעותית יותר זמן ערבוב בפועל. זה נקבע בדרך כלל על ידי ביצוע מדידות שונות של תגובה פסאודו 1 כדי bimolecular (כגון מרווה של טריפטופן הקרינה על ידי N bromosuccinate) בריכוזים שונים. דועך מעריכית הנצפות מצוידים להתכנס לפי שווי אחת מניחה כי t = 0 s ואת הזמן בין נקודה לבין הנקודה נמדד הראשון הוא זמן מת. עבור מערבלי זרימה למינרית, מדידות יכול להתבצע בתהליך ערבוב אז אין זמן מת, רק זמן ערבוב. זמן ערבוב פשוט הזמן לשלב בין שני פתרונות עד אחידות מספיק הוא הגיע. הגדרנו קודם לכן את הזמן ערבוב להיות זמן 90/10, זמן הריכוז של denaturant להפחית בין 90% ל 10% משווי נפרדות. עם זאת, את הצורה של עקומת ערבוב אינו סימטרי לחלוטין עם זנב של ריקבון שיש מרכיב מעריכי קטן. יתר על כן, יש קיפול חלבוניםביותר שאינו ליניארי תלות ריכוז denaturant כך מתקפל שניתן לעיתים קרובות להתחיל גם אם denaturant מצטמצם רק פי 2. לכן הגדרנו ולאחרונה זמן ערבוב עם הזמן להפחית את ריכוז denaturant ב -80%. בהחלט הגדרות אחרות ניתן להשתמש בהתאם לדרישות של הניסוי.
שימוש במיקסר זה ללמוד קיפול חלבונים חשף באופן עקבי תוצאות מפתיעות. קיפול של ציטוכרום C ו apomyoglobin כבר מזמן למד להיות צעדים מתקפלים מספר רב של תוצאות מוקדמות עם מערבלי זרימה רציפה הראה קריסה להתרחש ב ~ 100 μs זמנים 10,14-15. המדידות שלנו עם מערבל זה הראה שיהיו לפחות 2 צעדים על לוח זמנים זה, מהר מאוד, סביר להניח שאינו ספציפי, קריסה (כפי שנמדד על ידי שינוי הקרינה trp רפאים) תוך פרק זמן של ערבוב במערבל ואחריו שלב איטי יותר (כמו נמדד על ידי מרווה מכלל פליטת TRP), כי סביר להניח First הקמת מבנה יליד 5. ראינו גם תהליך 50 μs בתחום B1 של L חלבון, הופכת את הפרשנות המקובלת כי חלבון זה הוא תיקיה 2 המדינות 13.
היתרון של מיקסר זה מהיר הוא שהוא יכול לחקור את קיפול של חלבונים מתקפלים המהיר ביותר אשר בדרך כלל היו רק measureable על ידי T-קפיצה מכשירים שבריר שנייה. T-קפיצה בדרך כלל דורש התבוננות קיפול / התגלגלות רגיעה ליד טמפרטורת ההתכה של חלבון ולכן לא עוקב המתקפל של האוכלוסייה. עם מערבל זו אנו בחנו מתקפל של γ-repressor (λ 6-86) עם פליטת הן בסך הכל TRP ו SHIFT רפאים מצאו עדויות כי חלבון אין מחסום קיפול בתנאים מתקפלים חזקים שלא היו נגישים T הקודמות הקפיצה מדידות 12. סוף סוף יש לנו למדוד את המתקפלים של כיסוי ראש villin HP-35, אחד לאהוא המהיר ביותר שנמדד תיקיות עדיין ומצא כי שיעור מתקפל נמדד לאחר ערבוב ~ 5 פעמים לאט יותר מאשר נמדד על ידי קפיצה-T באותם תנאים 16. הדבר מצביע על כך קינטיקה מתקפלים תלוי את תנאי הפתיחה, הופכת ההנחה העיקרית בתחום.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע FIBR (NSF EF-0623664) ו IDBR (NSF DBI-0754570). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון הקרן הלאומית למדע FIBR גרנט 0623664 מנוהל על ידי המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית PHY 0120999. מחקר של ליסה לפידוס, Ph.D. הוא נתמך בחלקו על ידי פרס קריירה ממשק מדעי מהקרן בורוז ברוך הבא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A. Ruggedness in the folding landscape of protein L. Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
