Summary
इस अध्ययन से एक के विकास का वर्णन
Protocol
1. Electroporation के लिए पूर्व तैयारी
- Electroporation के लिए डीएनए एक मैक्सी प्रस्तुत करने का (प्रधानमंत्री या क्विएज़न) द्वारा बढ़ाना. डीएनए की एकाग्रता 1 / कुशल तेज मिलीग्राम एमएल की एक न्यूनतम होना चाहिए.
- 5 1 एक्स पीबीएस एक microcentrifuge ट्यूब में (फास्फेट बफर खारा) में 0.01% की तेजी से ग्रीन की μl के साथ डीएनए और मिश्रण की 495 μL निकालें.
2. भ्रूण हार्वेस्ट
- सीडी 1 - चूहों (Harlan) के समय matings स्थापित करना. योनि प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें और तारीख के संबंध में एक योनि प्लग भ्रूण दिन (ई) 0.5 के रूप में मनाया जाता है. भ्रूण प्लग (E11.5) visualizing के 11 दिनों के बाद काटा जाएगा.
- 70% इथेनॉल में निष्फल उपकरण रखें. कम से कम एक का उपयोग करने के लिए पहले घंटे के लिए यूवी प्रकाश के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड समझो. स्प्रे हुड, विदारक ट्रे, और 70% इथेनॉल के साथ गुंजाइश विदारक. 1 पूर्व गर्मी एक्स 37 पीबीएस डिग्री सेल्सियस
- E11.5 पर Institut द्वारा अनुमोदित की शर्तों के अनुसार महिला euthanizeional समिति देखभाल और पशु का उपयोग करें (ICCUA) के लिए. लामिना का प्रवाह हुड में विदारक ट्रे रखें. महिला के पेट के नीचे 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे.
- Peritoneal गुहा खोलें लिए और विदारक ट्रे के लिए दीवारों पिन. गर्भाशय सींग खींच इतना है कि यह peritoneal गुहा के भीतर टिकी हुई है.
- ध्यान से कटौती गर्भाशय सींग की दीवार खुला. धीरे जर्दी थैली में भ्रूण नाल से दूर दूर एक 20 मिमी चम्मच (ठीक वैज्ञानिक उपकरण) का प्रयोग करें. बाँझ 1 एक्स पीबीएस कि 2.2 में छोड़ देते हैं किया गया था के 10 एमएल के साथ एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में जगह भ्रूण प्रीफिल्ड.
- सभी वर्तमान भ्रूण के लिए दोहराएँ.
3. E11.5 भ्रूण की electroporation (चित्रा 1)
- एक 20 मिमी चम्मच का प्रयोग, एक नया 100 मिमी है कि 37 के लिए छोड़ देते हैं बाँझ 1XPBS के 10 एमएल के साथ प्रीफिल्ड पकवान डिग्री सेल्सियस के लिए पहली भ्रूण हस्तांतरण
- ध्यान से फिर से एक 0.05 x 0.02 मिमी टिप (ठीक वैज्ञानिक उपकरण) के साथ 11 सेमी संदंश का प्रयोग करेंचाल और जर्दी थैली त्यागें.
- स्थिति भ्रूण ताकि इसकी पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है ताकि यह चित्र 1 ए में कार्टून जैसा दिखता है. 7 मिमी इलेक्ट्रोड paddles के हार्वर्ड उपकरण का प्रयोग करने के लिए धीरे भ्रूण पकड़. इलेक्ट्रोड hindbrain चतुर्थ निलय के स्तर पर न्यूरल ट्यूब के दोनों ओर तैनात किया जाना चाहिए. निलय नग्न आंखों को दिखाई है लेकिन एक विच्छेदन खुर्दबीन का उपयोग कर सही चप्पू प्लेसमेंट की सुविधा कर सकते हैं. Paddles के पोजिशनिंग कि electroporated डीएनए प्राप्त क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कम पृष्ठीय भ्रूण hindbrain की तिर्यग्वर्ग का होंठ (LRL) के वांछित है, paddles, ऐसी है कि वे सीधे चौथे वेंट्रिकल खोलने की व्यापक हिस्सा flanking जगह होना चाहिए.
- 1 सीसी सिरिंज का उपयोग करने के लिए प्लाज्मिड 0.01% फास्ट ग्रीन के साथ मिश्रित डीएनए आकर्षित. मिश्रण की 500 μL कम से कम 8-10 (3.5 देखें) भ्रूण की electroporation के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- धीरे पंचर roofplate ov.25G / 8 5 टुबरकुलीन 1 सीसी सिरिंज से जुड़ी सुई के साथ चौथे वेंट्रिकल erlying और निलय में डाई मिश्रण डीएनए इंजेक्षन. सफल इंजेक्शन डीएनए डाई पूरे वेंट्रिकुलर सिस्टम (चित्रा 1C) भरने के मिश्रण द्वारा विशेषता है. डीएनए डाई मिश्रण आम तौर पर इंजेक्शन की मात्रा कम से कम 50 μL है. सटीक मात्रा में भ्रूण के बीच में चर रहे हैं के रूप में मिश्रण के एक हिस्से के वेंट्रिकल की भ्रूण आसपास पीबीएस में रिसाव जाता है. डीएनए डाई मिश्रण देने का एक वैकल्पिक साधन मध्यमस्तिष्क overlying वेलुम puncturing द्वारा वेंट्रिकुलर सिस्टम तक पहुँचने के माध्यम से होगा. फिर, सफल इंजेक्शन डीएनए डाई पूरे वेंट्रिकुलर सिस्टम भरने मिश्रण द्वारा विशेषता है.
- पाँच वर्ग एक बिजली पल्स जनरेटर (BTX) और 7 मिमी इलेक्ट्रोड paddles का उपयोग दालों उद्धार. प्रत्येक नाड़ी 50 वी स्थायी 5 500 एमएस के साथ प्रत्येक नाड़ी नाड़ी प्रति के बीच एमएस है. सकारात्मक आरोप लगाया इलेक्ट्रोड के सबसे करीब ऊतक तो होगा तकप्लाज्मिड ऊपर ई.
4. भ्रूण की संस्कृति
- एक लामिना का प्रवाह हुड में, 10% से भ्रूण गोजातीय सीरम, 5% घोड़े का सीरम, glutamine के 1%, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कि छोड़ देते हैं किया गया था के साथ पूरक DMEM/F12 मीडिया की 2 एमएल के साथ 12 अच्छी तरह से एक संस्कृति डिश के बाहरी कुओं को भरने 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति शर्तों डे डिएगो और उनके सहयोगियों ने 15 से अनुकूलित किया गया.
- लामिना का प्रवाह हुड संदंश साथ midsection दिल (नीचे) पर चुटकी भ्रूण और भ्रूण के पीछे हिस्से को हटा दें. 12 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान भर कुओं में से एक के रूप में पूर्वकाल भाग रखें.
- सभी भ्रूण के लिए दोहराएँ. संस्कृतियों के संक्रमण से बचने के केवल 12 अच्छी तरह से थाली की बाहरी कुओं भरें.
- 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति भ्रूण. Electroporated प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति 24 घंटे के भीतर प्रत्यक्ष किया जाना चाहिए.
- लंबे समय तक संस्कृति बार वांछित किया जाना चाहिए, 2 की एमएल के साथ एक नया 12 अच्छी तरह से थाली के बाहर कुओं को भरनेमीडिया 4.1 में इस्तेमाल किया. एक निष्फल चम्मच के साथ नई प्लेट में अच्छी तरह से भ्रूण हस्तांतरण. 37 ° सी इनक्यूबेटर में वापस जगह है. 48 घंटा के लिए संस्कृति संभव है.
- जब वांछित संस्कृति समय तक पहुँच जाता है, विश्लेषण के लिए भ्रूण तय (देखें नीचे).
5. भ्रूण के विश्लेषण के लिए तैयार
- 1 एक्स पीबीएस में भ्रूण पांच मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में कुल्ला. दोहराएँ.
- 2 घंटे के लिए 1XPBS में 2% paraformaldehyde में विश्लेषण (पीएफए) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण फिक्स
- 1 एक्स पीबीएस में भ्रूण पांच मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में कुल्ला. दोहराएँ.
- 1 एक्स पीबीएस में 30% sucrose के भ्रूण को संतुलित करना रातोंरात 4 बजे डिग्री सेल्सियस
- इष्टतम काटना तापमान (अक्टूबर) एक सूखी स्नान / बर्फ और इथेनॉल का उपयोग कर परिसर में भ्रूण एम्बेड. भ्रूण -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
- 30 माइक्रोन वर्गों में (Leica) cryostat और स्लाइड्स पर माउंट (VWR, Superfrost प्लस). पर धारा भ्रूण. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
6. Immunohistochemistry विश्लेषण
- Immunohistochemistry के रूप में 16 में वर्णित किया गया था. माउस (बी.डी. बायोसाइंसेज) α-Mash1 के 1:100, खरगोश α-Ngn1 (जेन जॉनसन) 1:5000, खरगोश α-Ptf1a के (जेन जॉनसन प्राथमिक एंटीबॉडी इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया dilutions (Invitrogen) α GFP 1:2500 खरगोश शामिल ) 1:2500, खरगोश Math1 (जेन जॉनसन) 1:100. 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में एक धुंधला ट्रे पर स्लाइड फ्लैट, नमूना पक्ष सेते हैं.
- स्लाइड एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी (BX51 ओलिंप) पर विश्लेषण किया गया.
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्र 1A में एक योजनाबद्ध electroporation प्रयोग दर्शाया गया है चित्रा 1 बी एक E11.5 भ्रूण के एक बाण के समान हेरफेर करने के लिए पहले दृश्य से पता चलता है. प्लाज्मिड युक्त :: सीएजी GFP के 0.01% की तेजी से ग्रीन में इंजेक्शन के बाद एक ही भ्रूण चित्रा 1C और एक प्रतिनिधि unfixed एकतरफा GFP प्रदर्शन भ्रूण में दिखाया गया हैपृष्ठीय hindbrain 24 घंटा निम्नलिखित संस्कृति में अभिव्यक्ति चित्रा 1D में दिखाया गया है. LRL कि सफलतापूर्वक electroporated है की क्षेत्र की हद तक चर है और इलेक्ट्रोड की स्थिति पर अत्यधिक निर्भर हो गया लगता है. यह हमारे अध्ययन में पाया गया कि electroporated भ्रूण के (80%) 65 के बाहर 52 GFP सफलतापूर्वक व्यक्त. ऊतक को सफलतापूर्वक अगर यह निर्धारण और immunohistochemical विश्लेषण (देखें नीचे) के बाद स्थानीयकृत क्षेत्रों में कई वर्गों में GFP के लिए सकारात्मक था electroporated समझा था. भ्रूण कि इस मापदंड को पूरा करने में विफल रहा है electroporation में असफल प्रयासों के रूप में रन बनाए थे.
Electroporation दक्षता के आगे मूल्यांकन अनुप्रस्थ वर्गों पर GFP चौथे वेंट्रिकल के स्तर पर electroporated भ्रूण के खिलाफ प्रदर्शन immunohistochemistry द्वारा पता लगाया जा चित्रा 2 में एक एकतरफा प्रदर्शित भ्रूण से प्रतिनिधि धारावाहिक वर्गों को दर्शाता है.GFP अभिव्यक्ति 2A चित्रा. एक idealized योजनाबद्ध है कि दिखाता है कि भ्रूण के बाईं ओर सकारात्मक इलेक्ट्रोड ओर था दिखाता है. अनुप्रस्थ वर्गों के (चित्रा 2A के बीच कार्टून द्वारा प्रतिनिधित्व के स्तर पर) स्थानीय GFP अभिव्यक्ति विशेष रूप से पता चलता है hindbrain ऊतक (आंकड़े -2 सी और 2 डी) के बाईं ओर पर है. LRL की electroporated क्षेत्र न्यूरल ट्यूब की पूरी पूर्वकाल - पश्च अक्ष का विस्तार नहीं के रूप में 300 माइक्रोन विजय - स्तम्भ या चित्र 2C में पता चला है कि अधिक से अधिक वर्गों की परीक्षा व्यक्त GFP (चित्र 2B) नहीं करता था.
जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए इस परख की उपयोगिता अंतर्जात प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति डोमेन की स्थिरता पर निर्भर है. LRL अद्वितीय पूर्वज proneural प्रतिलेखन कारकों के अंतर अभिव्यक्ति (1 समीक्षा) विशेषता डोमेन रखने के रूप में लक्षण वर्णन किया गया.इन कारकों में से एक सबसेट (Mash1, Math1, Ngn1, और Ptf1a के) अपनी प्रस्तावित और / या भविष्य 16-18 के अध्ययन के एक विषय LRL के में precerebellar तंत्रिका subtypes के विनिर्देश में विशेषता भूमिकाओं के कारण, विश्लेषण के लिए चुने गए. सभी चार प्रोटीन 16-18 E11.5 में दुम का hindbrain में अत्यधिक विशेषता अभिव्यक्ति डोमेन है. हम ने कहा कि भ्रूण कि संस्कृतियों रखा गया था आकार में वृद्धि करने में विफल रहा है और भी रंजित जाल उपकला और LRL और roofplate, रूपात्मक घटनाओं है कि E11.5 और 5 E12.5 के बीच होने की invagination का उत्पादन शुरू करने में विफल रहा है. यह इन टिप्पणियों के आधार पर निर्धारित किया गया था कि इन भ्रूण में सामान्य विकास रुक गया था या निहायत देरी और सुसंस्कृत भ्रूण के लिए तुलनीय नियंत्रण असभ्य भ्रूण E11.5 पर होना चाहिए.
सुनिश्चित करें कि संस्कृति और electroporation अंतर्जात प्रोटीन के स्तर को परेशान नहीं, हम immunohistoch द्वारा चार अलग प्रोटीन का विश्लेषण34 विभिन्न भ्रूण कि electroporated गया और फिर कम से कम 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत में emistry (आईएचसी) टेबल मैं प्रत्येक मार्कर और भ्रूण का प्रतिशत का विश्लेषण है कि बनाए रखा सामान्य प्रोटीन का स्तर. चित्रा 3 प्रतिनिधि आईएचसी आंकड़ों से पता चलता है के लिए विश्लेषण किया भ्रूण की संख्या से पता चलता है से दो प्रोटीनों का विश्लेषण, Mash1 (आंकड़े 3A और 3B) और Math1 (आंकड़े 3C और 3 डी). हम ने कहा कि भ्रूण के बहुमत अभिव्यक्ति के बाद की electroporation और संस्कृति (3B आंकड़े और 3 डी) का सामान्य स्तर बनाए रखा E11.5 (आंकड़े 3A 3C और) पर नियंत्रण भ्रूण के रूप में की तुलना में. महत्वपूर्ण बात, इन प्रोटीनों की विशेषता अभिव्यक्ति डोमेन परेशान नहीं गया.
आकृति 1. E11.5 में भ्रूण की electroporation वें योजनाबद्ध (ए)ई electroporation प्रयोग. एक E11.5 भ्रूण अलग है और 0.01% की तेजी से ग्रीन में प्लाज्मिड अभिव्यक्ति चतुर्थ निलय में इंजेक्ट किया जाता है. भ्रूण तो इलेक्ट्रोड paddles के द्वारा flanked है और एक 50 वी संस्कृति में (बी) एक E11.5 भ्रूण के बाण के समान देखने के इंजेक्शन के लिए पहले रखा से पहले नाड़ी के अधीन है. (सी) एक ही E11.5 भ्रूण 0.01% की तेजी से ग्रीन में प्लाज्मिड के इंजेक्शन के बाद. (डी) GFP के एकतरफा hindbrain अभिव्यक्ति संस्कृति के 24 घंटे के बाद E11.5 भ्रूण में मनाया. एमबी मध्यमस्तिष्क, 4V चतुर्थ निलय.
चित्रा 2. Electroporated ऊतक में GFP की अभिव्यक्ति. (ए) बाईं तरफ के कार्टून E11.5 भ्रूण के चारों ओर इलेक्ट्रोड के स्थान दर्शाया गया है. मध्य कार्टून तेज और भ्रूण के बाईं ओर पर प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP की अभिव्यक्ति को दर्शाया गया है. सही पर कार्टून एक idealized अनुप्रस्थ अनुभाग एल में भ्रूण के माध्यम से ले लिया की योजनाबद्ध हैevels काले मध्य कार्टून में लाइनों द्वारा चिह्नित. संस्कृति के 24 घंटे के बाद एक electroporated E11.5 भ्रूण के माध्यम से अनुप्रस्थ वर्गों पर GFP के लिए immunohistochemistry (बी डी). तीर roofplate (आर.पी.) जो जाल माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत मिलता है. छवियाँ 10X बढ़ाई में लिया जाता है. दिखाया वर्गों के रिश्तेदार स्तर (ए) में मध्यम कार्टून के माध्यम से क्षैतिज लाइनों द्वारा चित्रित कर रहे हैं. एमबी - मध्यमस्तिष्क, एल 4V चौथे वेंट्रिकल, आर.पी. - roofplate.
चित्रा 3. लोअर तिर्यग्वर्ग का होंठ में अंतर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति immunohistochemistry (ए और बी) Mash1 या Math1 (सी और डी) E11.5 भ्रूण की अनुप्रस्थ वर्गों है कि सभ्य (ए, सी) भ्रूण कि सीएजी साथ electroporated थे साथ नहीं थे की तुलना के लिए. GFP और 24 घंटे (बी और डी) के लिए सुसंस्कृत. छवियाँ 10X बढ़ाई लिया.
| Proneural Transcriptiफैक्टर पर विश्लेषण | भ्रूण की संख्या का विश्लेषण | सामान्य अभिव्यक्ति पैटर्न बनाए रखने का प्रतिशत |
| Math1 | 15 | 86.7% |
| Mash1 | 12 | 83.3% |
| Ngn1 | 7 | 71.4% |
| Ptf1a | 6 | 100% |
टेबल Electroporated और संवर्धित में सामान्य LRL में Proneural प्रतिलेखन फैक्टर डोमेन को बनाए रखने के भ्रूण मैं प्रतिशत.
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Discussion
इन विट्रो electroporation इस अध्ययन में प्रस्तुत तकनीक में एक उपन्यास पद्धति कि कुशलतापूर्वक हमल के 12 दिनों की तुलना में छोटी भ्रूण में जा सकता है जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए उपयोग किया है. भ्रूण की संस्कृति में प्लेसमेंट शुरू जीन की अभिव्यक्ति परमिट और circumvents मारक मनाया जब electroporated भ्रूण vivo में रहने की अनुमति दी जाती है. इस तकनीक भ्रूण progenitors कि पहले electroporation आधारित अध्ययन के लिए दुर्गम थे में जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए अनुमति देता है.
electroporation भ्रूण के 80% में शुरू जीन की कुशल अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप तकनीक का विश्लेषण किया. चित्रा 2 में मनाया electroporated ऊतक की हद तक असतत क्षेत्रों में स्थानीयकृत है. आदेश में विशेष रूप से electroporation के लिए एक विशेष hindbrain क्षेत्र लक्षित इलेक्ट्रोड यह नियंत्रित के रूप में ध्यान रखा जाना चाहिए एक के स्थानऊतक ffected. यदि कम पृष्ठीय भ्रूण hindbrain की तिर्यग्वर्ग का होंठ वांछित है, paddles, ऐसी है कि वे सीधे चौथे वेंट्रिकल खोलने की व्यापक हिस्सा flanking जगह होना चाहिए. अगर न्यूरल ट्यूब के एक तरफ एकतरफा अभिव्यक्ति की इच्छा है तो भ्रूण ऐसी है कि न्यूरल ट्यूब की धुरी paddles के समानांतर है इलेक्ट्रोड के बीच तैनात किया जाना चाहिए. भ्रूण की झुकाना अनुचित लक्ष्यीकरण और / या द्विपक्षीय अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं. बेहतर electroporation दक्षता प्राप्त करने के लिए अनुकूलन में एक electroporation वोल्टेज भिन्न के रूप में यह कोशिकाओं कि electroporated डीएनए तेज का अनुपात बढ़ा सकता है. एक भी आगे डीएनए स्टॉक ध्यान केंद्रित सकता है. न्यूरल ट्यूब के रूप में केवल तरल पदार्थ की एक छोटी मात्रा समायोजित कर सकते हैं, और अधिक ध्यान केंद्रित नमूने प्लाज्मिड की राशि है electroporation पर कोशिकाओं में शुरू में वृद्धि करनी चाहिए. अंत में, एक paddles के व्यास को बदल सकता है. यदि एक के लिए एक छोटे लक्ष्य एक हैघ और अधिक स्थानीयकृत क्षेत्र का सबसे अच्छा यह हो सकता है लिए चप्पू आकार में कमी.
Hindbrain जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ में इस तकनीक की उपयोगिता के लिए महत्वपूर्ण सामान्य जीन और electroporation और भ्रूण की संस्कृति के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रतिधारण है. 86% के रूप में चित्रा 3 और मैं टेबल में प्रलेखित है, सामान्य proneural प्रतिलेखन कारक स्तर और पैटर्न अच्छी तरह से बनाए रखा जाता है भ्रूण के 83% Mash1 व्यक्त विश्लेषण, Math1 व्यक्त की, और 100% Ptf1a व्यक्त की. Ngn1 के स्तर के रूप में मजबूती के साथ (71%) नहीं बनाए रखा गया अन्य प्रतिलेखन कारकों के रूप में assayed है. हालांकि यह संभव है कि इस विशेष प्रतिलेखन कारक प्रतिकूल electroporation और संस्कृति प्रक्रिया से प्रभावित है कि हम मानते हैं कि वहाँ एक वैकल्पिक व्याख्या है. यह दिखाया गया है है कि पृष्ठीय hindbrain में Ngn1 अभिव्यक्ति समय के साथ भ्रूण दिन (ई) 12.5 16 से गायब स्तर के साथ, कम हो. कि पी को देखते हुएNgn1 व्यक्त भ्रूण की ercentage अन्य मूल्यांकन प्रोटीन (83% या अधिक से अधिक) यह संभव है कि भ्रूण कि पृष्ठीय Ngn1 अभिव्यक्ति में कमी कर रहे हैं कम से कम 30% के एक हिस्से में प्रगति की है के लिए सामान्य अभिव्यक्ति को बनाए रखना है उन लोगों की तुलना में कम है सामान्य विकास कार्यक्रम, Ngn1 अभिव्यक्ति बदल E11.5 में फसल और संस्कृति में नियुक्ति के बाद 24 घंटे. यह पता चलता है कि आणविक परिवर्तन कि पृष्ठीय hindbrain E11.5 और E12.5 के बीच में होते हैं भ्रूण के एक हिस्से में हो सकता है लेकिन एक अतुल्यकालिक या देरी समय सीमा पर ऐसा करता है. यह भविष्य के अध्ययन में गुण आगे विश्लेषण खोजने लेकिन इस परख के लिए उत्साह कम नहीं है. संभावना है कि भ्रूण आणविक परिवर्तन के दौर से गुजर हो सकता है कि सामान्य विकास के दौरान होने भी सूचित कैसे इस तकनीक का उपयोग अध्ययन से परिणाम व्याख्या कर रहे हैं चाहिए.
अनुकूलित electroporation विविधतायें और संस्कृति की स्थिति वीं में प्रस्तुतअध्ययन संभव हैं. यह पाया गया कि 50 वी ऊतक की अखंडता के लिए न्यूनतम अशांति के साथ electroporated जीन की एक मजबूत तेज दिया. electroporations के लिए वोल्टेज क्रम में व्यक्तिगत experimenter की जरूरत इस परख ठीक धुन संशोधित किया जा सकता है. संस्कृति शर्तों भ्रूण कि सीधे एक 12 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति मीडिया (ऊपर वर्णित) में रखा गया पर अनुकूलित किया गया. इस तकनीक (costar) झिल्ली है कि एक 12 अच्छी तरह से थाली की मीडिया में रखा गया है पर भ्रूण रखकर संशोधित किया जा सकता है. संवर्धन तकनीक के अनुकूलन के दौरान इस बदलाव का प्रयास किया गया था लेकिन यह काफी प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित electroporated जीन की अभिव्यक्ति या सामान्य जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की अवधारण में प्रकट नहीं किया था या तो.
इस अध्ययन में 24 घंटे के लिए भ्रूण संवर्धन पर ध्यान केंद्रित. भ्रूण के लिए सभ्य है 24 घंटे में बदल किया जा रहा है मीडिया के साथ 48 घंटे के लिए. यह पाया गया कि ऊतक की अखंडता के साथ लंबे समय गिरावटएर ऊष्मायन बार लेकिन electroporated GFP की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सकता है. अब ऊष्मायन समय (पिछले 48 घंटा) के लिए यह आवश्यक परिवर्तन संस्कृति की स्थिति होने की संभावना है और भविष्य जांच का विषय हो जाएगा हो सकता है.
परख संस्कृति के अनुकूलन के दौरान यह पाया गया अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति भ्रूण कि न्यूरल ट्यूब मीडिया पर्यावरण के लिए अधिक से अधिक जोखिम में सुधार की कि प्रतिधारण. इन अध्ययनों में इस संस्कृति में नियुक्ति से पहले का पंचर 4 वें निलय और भ्रूण के लांगुलिय भाग में हटाने के बाहरी ऊतक roofplate के द्वारा प्राप्त किया गया था. भविष्य के अध्ययन की जांच करेंगे अगर microdissected न्यूरल ट्यूब सफलतापूर्वक इन परिस्थितियों में संवर्धित किया जा सकता है.
इस अध्ययन में गर्भ के 11.5 दिनों (E11.5) में भ्रूण की electroporation पर जोर दिया. एक भविष्य की दिशा के विकास के पहले चरण के लिए तकनीक का अनुकूलन होगा. हम भ्रूण पर इस तकनीक का इस्तेमाल किया हैE10.5 पर काटा और जब तक हम अभी जमा और भ्रूण के एक महत्वपूर्ण संख्या का विश्लेषण हम GFP और भ्रूण संवर्धन शुरू करने में सफलता देखा है. गहराई आगे अध्ययन में एक और अधिक निश्चितता के साथ कहते हैं कि इस अध्ययन में इस्तेमाल तकनीक छोटी भ्रूण को लागू किया जा सकता है के लिए आवश्यक हो जाएगा. यह संभव हो सकता के भ्रूण E10.5 की तुलना में छोटी electroporate सकता है लेकिन यह करने का प्रयास नहीं किया गया है.
इस तकनीक का एक कार्यात्मक आवेदन करने के लिए overexpress या नीचे दस्तक जीन के समारोह में उनके प्रोटीन उत्पादों LRL से अलग तंत्रिका subtypes के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं जांच करने के लिए अगर हो सकता है. इस तकनीक के साथ भविष्य प्रयोगों proneural प्रतिलेखन कारकों का परिचय पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अलग तंत्रिका E11.5 पर LRL से उत्पादित हो जाना subypes का भाग्य बदल जाएगा. तकनीक भी अन्य neuroepithelial क्षेत्रों है कि सक्रिय रूप से E11.5 में न्यूरॉन्स के उत्पादन लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए Ngn1, Math1 के लिए जेन जॉनसन का शुक्रिया अदा करना होगा, और Ptf1a एंटीबॉडी और pCAG के लिए कोनी Cepko :: GFP प्लाज्मिड. इस काम एनआईएच 1R15HD059922-01 R15 द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
