Summary
Denne studien beskriver utvikling av en
Abstract
Den rhombic leppe er en embryonisk neuroepithelium ligger i hindbrain i krysset mellom nevralrøret og roofplate av fjerde ventrikkel (anmeldt i 1). Den rhombic leppe kan deles inn i øvre rhombic overleppen (URL) som omfatter rhombomere 1 (R1) og genererer nevroner i lillehjernen og den nedre rhombic leppe (LRL) som gir opphav til ulike nevrale hjernestammen linjene 2-4. LRL derivater omfatter auditive neurons av sneglehuset kjerner og de fra precerebellar kjerner som er involvert i å regulere balanse og motorisk kontroll 5-8. Neurogenesis fra LRL skjer over et stort temporal vindu som omfatter embryonale dager (E) 9,5 til 16,5 5, 9. Ulike nevrale linjene dukke opp fra LRL som postmitotic celler (eller er født) under forskjellige utviklingsforstyrrelser dager under dette nevrogen vinduet.
Electroporation av genuttrykk konstruksjoner kan brukes tilmanipulere genuttrykket i LRL stamfedre, og kan potensielt forandre skjebnen til nevroner produsert fra denne regionen 10-12. Endre genuttrykk av LRL progenitors i musen via i utero electroporation har vært svært vellykket for å manipulere linjene født på embryonale dag E12.5 eller senere 10, 12-14. In utero electroporations før E12.5 har vært mislykket skyldes i hovedsak dødelighet assosiert med punktering av fjerde ventrikkel roofplate, et nødvendig skritt i å levere eksogene DNA som er electroporated inn i LRL. Men mange LRL avledet linjene oppstår fra LRL tidligere enn E12.5 9. Disse tidligere født linjene omfatter nevroner som utgjør den laterale retikulære, ekstern cuneate og mindreverdig olivary kjerner av precerebellar system som fungere å koble innspill fra ryggmargen og cortex til cerebellum 5. For å manipulere uttrykk i LRLav embryoer yngre enn E12.5, utviklet vi en in vitro system hvor embryoer er plassert inn i kulturen etter electroporation.
Denne studien presenterer en effektiv metode for å manipulere genuttrykket av LRL progenitors på E11.5. Embryoer electroporated med grønt fluorescerende protein (GFP) drevet fra den bredt aktive CAG promoter reproduserbart uttrykk GFP etter 24 timer med kultur. En kritisk del av denne analysen er at genuttrykk er bare endres på grunn av uttrykk for eksogene genet og ikke på grunn av sekundære effekter som resultat fra electroporation og dyrking teknikker. Det ble bestemt at de endogene genuttrykk mønstre forblir uforstyrret i electroporated og kultivert embryoer. Denne analysen kan benyttes til å endre skjebnen til celler framvoksende fra LRL av befruktede egg yngre enn E12.5 gjennom innføring av plasmider for overuttrykk eller slå ned (gjennom RNAi) av ulike pro-nevrale transkripsjonsfaktorer.
Protocol
1. Forberedelser Før electroporation
- Forsterke DNA for electroporation av en maxi prep (Prime-It or Qiagen). Konsentrasjonen av DNA skal være minimum 1 mg / ml for effektiv opptak.
- Fjern 495 mL av DNA og bland med 5 mL av 0,01% Fast Green i en X PBS (fosfat saltløsning) i en mikrosentrifuge tube.
2. Embryonale Harvest-
- Etablere tidsstyrte parringer av CD-1 mus (Harlan). Sjekk for tilstedeværelsen av vaginal plugger og betrakter dato en vaginal plugg er observert som embryonale dag (E) 0,5. Embryoet vil bli slaktet 11 dager etter å visualisere plugg (E11.5).
- Plasser steriliserte verktøy i 70% etanol. Behandle en laminær hette med UV lys i minst én time før bruk. Sprayhood, dissekere skuffen, og dissekere omfang med 70% etanol. Forvarm en X PBS til 37 ° C.
- På E11.5 avlive den kvinnelige henhold til vilkår godkjent av Institutional komité for omsorg og bruk av dyr (ICCUA). Plasser dissekere skuffen i laminær panseret. Spray ned buken av den kvinnelige med 70% etanol.
- Åpne bukhulen og pin veggene til dissekere skuffen. Trekk ut livmor horn slik at den hviler i bukhulen.
- Forsiktig kutte åpne veggen av livmor horn. Bruk en 20 mm skje (FEW vitenskapelige verktøy) for å forsiktig fjerne fosteret i plommesekken bort fra morkaken. Plasser embryo i en 100 mm vevskultur fatet fylt med 10 ml sterilt 1 X PBS som ble forvarmet i 2.2.
- Gjenta for alle embryoer til stede.
3. Electroporation av E11.5 embryo (Figur 1)
- Ved hjelp av en 20 mm skje, overføre første embryoet til en ny 100 mm fatet fylt med 10 ml sterilt 1XPBS som ble forvarmet til 37 ° C.
- Bruk 11 cm tang med en 0,05 x 0,02 mm spiss (FEW vitenskapelige verktøy) til å nøye reflytte og kast plommesekken.
- Posisjon embryo slik at dorsal side er vendt opp slik at det ligner på tegneserie i figur 1A. Bruk 7 mm elektrode padleåre (Harvard Apparatus) å forsiktig holde fosteret. Elektrodene skal plasseres på hver side av nevralrøret på nivå med den hindbrain fjerde ventrikkel. Ventrikkelen er synlig for det blotte øye, men ved hjelp av en disseksjon mikroskop kan lette nøyaktig padle plassering. Plassering av elektrodene er kritisk til å bestemme regionen som mottar electroporated DNA. Dersom den nedre rhombic underleppen (LRL) av dorsal embryonale hindbrain er ønskelig, må padleårer være plass slik at de er direkte flankerer den bredeste delen av fjerde ventrikkel åpningen.
- Bruk en 1 cc sprøyte for å trekke opp plasmid DNA blandet med 0,01% Fast Green. 500 mL av blandingen bør være tilstrekkelig for electroporation minst 8-10 embryoer (se 3.5).
- Forsiktig punktere roofplate OVerlying fjerde ventrikkel med en 25G 5/8 tuberkulin nål festet til en cc sprøyte og injisere DNA-dye blandingen i ventrikkelen. Vellykkede injeksjoner er preget av DNA-dye blanding fylle hele ventrikulære systemet (figur 1C). Mengden DNA-dye blanding typisk injisert er mindre enn 50 mL. Eksakt beløp er variable mellom embryo som en del av blandingen tendens til å lekke ut av hjertekammer i PBS rundt embryo. En alternativ måte å levere DNA-dye blandingen ville være gjennom tilgang til ventrikkel systemet ved punktering av velum overliggende midbrain. Igjen er vellykkede injeksjoner preget av DNA-dye blanding fylle hele ventrikulære systemet.
- Lever fem kvadrat pulser med en elektrisk puls generator (BTX) og 7 mm elektrode padleårer. Hver puls er 50 V varig 5 ms per puls med 500 ms mellom hver puls. Vevet nærmest positivt ladet elektroden vil da Take opp plasmidet.
4. Kultur av befruktede egg
- I en laminær hette, fylle de ytre brønner på en 12-brønns kultur parabolen med to mL DMEM/F12 media supplert med 10% fosterets bovint serum, 5% hest serum, 1% glutamin, 1% penicillin / streptomycin som ble forvarmet til 37 ° C. De kultur forholdene ble tilpasset fra de Diego og kolleger. 15
- I laminær hette klype embryoer ved midsection (under hjertet) med pinsett og fjern bakre del av embryo. Plasser fremre del inn i en av de fylte brønner på 12-brønnen kultur parabolen.
- Gjenta for alle embryoer. Fyll bare de ytre brønner på 12-brønnen plate for å unngå forurensning av kulturer.
- Kultur embryo i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Uttrykk for electroporated plasmidet bør kunne observeres innen 24 timer.
- Skulle lengre kultur tider være ønsket, fylle ut brønner på en ny 12 brønn plate med 2 mLmediene som brukes i 4.1. Med en sterilisert skje overføre embryoene til en brønn i den nye platen. Sett tilbake i 37 ° C inkubator. Kultur for opptil 48 timers er mulig.
- Når ønsket kultur er nådd, fikse embryoer for analyse (se nedenfor).
5. Forberedelse av befruktede egg for analyse
- Skyll embryo i en X PBS ved 4 ° C i fem min. Gjenta.
- Fastsette embryoer for analyse i 2% paraformaldehyde (PFA) i 1XPBS for 2 timer ved 4 ° C.
- Skyll embryo i en X PBS ved 4 ° C i fem min. Gjenta.
- Stabilisere embryo i 30% sukrose i en X PBS natten ved 4 ° C.
- Integrer embryo i Optimal Cutting Temperatur (OCT) compound med en tørris / etanol bad. Embryoet kan oppbevares ved -20 ° C.
- § embryo på en cryostat (Leica) til 30 mikrometer seksjoner og montere på lysbilder (VWR, Superfrost Plus). Oppbevar ved -20 ° C.
6. Immunohistochemistry Analyse
- Immunhistokjemi ble utført som beskrevet i 16. Primære antistoffer fortynninger som brukes for denne studien omfatter kanin α-GFP (Invitrogen) 1:2500, mus α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; kanin α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000, kanin α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500, kanin-Math1 (Jane Johnson) 1:100. Inkuber lysbilde flat, prøven siden opp på en farging brett ved 4 ° C over natten.
- Slides ble analysert på et sammensatt mikroskop (Olympus BX51).
7. Representative Resultater
En skjematisk i figur 1A skildrer electroporation eksperimentet. Figur 1b viser en sagittal visning av en E11.5 embryo før manipulasjon. Det samme embryo etter injeksjon av plasmidet inneholder CAG :: GFP i 0,01% Fast Grønn er vist i figur 1C og en representant unfixed embryo stille ensidige GFPuttrykk i dorsal hindbrain 24 timers følgende kulturen er vist i figur 1D. Omfanget av det området av LRL som er vellykket electroporated er variabel og synes å være sterkt avhengig av plassering av elektrodene. I våre studier ble det funnet at 52 av 65 (80%) av de electroporated embryoene vellykket uttrykt GFP. Tissue ble ansett for å være vellykket electroporated om det var positivt for GFP i lokaliserte regioner over flere seksjoner etter fiksering og immunhistokjemisk analyse (se nedenfor). Embryo som ikke klarte å oppfylle disse kriteriene ble scoret som mislykkede forsøk på electroporation.
Nærmere vurdering av electroporation effektivitet kan fastslås ved å utføre immunhistokjemi mot GFP på tverrgående delene av electroporated embryoer på nivå med fjerde ventrikkel. Figur 2 viser representative seriesnitt fra et embryo som viser unilateralGFP uttrykk. Figur 2A viser en idealisert skjematisk som illustrerer at venstre side av embryoet var mot den positive elektroden. Tverrgående seksjoner (på nivåer representert ved midten tegneserie av figur 2A) avslører lokalisert GFP uttrykk utelukkende på venstre side av hindbrain vev (figur 2C og 2D). Den electroporated område av LRL ikke forlenge hele anterior-posterior aksen av nevralrøret som undersøkelse av seksjonene 300 mikrometer rostral eller større enn det som vises i figur 2C ikke uttrykkelig GFP (figur 2B).
Nytten av denne analysen for manipulering av genekspresjon er avhengig av stabilitet av uttrykket domener for de endogene proteiner. Den LRL har blitt karakterisert som besitter unike progenitor domener preget av differensial uttrykk for proneural transkripsjonsfaktorer (anmeldt i 1).En undergruppe av disse faktorene (Mash1, Math1, Ngn1, og Ptf1a) ble valgt for analyse på grunn av deres foreslåtte og / eller karakterisert roller i spesifikasjonen av precerebellar nevrale subtyper i LRL, en gjenstand for fremtidige studier 16-18. Alle fire proteiner har svært karakteristiske uttrykk domener i kaudal hindbrain på E11.5 16-18. Vi observerte at embryoer som ble plassert kulturer klarte å øke i størrelse og også mislyktes i å initiere produksjon av årehinnen plexus epitel og invagination av LRL og roofplate, morfologiske hendelser som oppstår mellom E11.5 og E12.5 5. Basert på disse observasjonene ble det fastslått at normal utvikling i disse embryoer ble stanset eller grovt forsinket og sammenlignbare kontroll for de dyrkede embryoene skal være ukulturerte embryoer ved E11.5.
For å sikre at kultur og electroporation ikke forstyrr nivåer av endogene proteiner, analyserte vi fire forskjellige proteiner ved immunohistochemistry (IHC) i 34 forskjellige embryoer som ble electroporated og deretter kultivert i minst 24 timer. Tabell I viser antall embryoer analysert for hver markør og andelen av embryoene analysert som beholdt normal protein nivåer. Figur 3 viser representant IHC data fra to av de proteinene analysert, Mash1 (Tall 3A og 3B) og Math1 (figur 3C og 3D). Vi observerte at flertallet av embryoene beholdt normale nivåer av uttrykk etter electroporation og kultur (figur 3B og 3D) sammenlignet med kontrollprøvene embryoer ved E11.5 (Tall 3A og 3C). Viktigere, ble de karakteristiske uttrykket domenene til disse proteinene ikke opprørt.
Figur 1. Electroporation av embryoer ved E11.5. (A) Skjematisk av the electroporation eksperiment. En E11.5 embryo er isolert og uttrykket plasmidet i 0,01% Fast Grønn injiseres i fjerde ventrikkel. Embryoet blir deretter flankert av elektroden padleårer og utsatt for en 50 V puls før de blir plassert inn kultur (B) sagittal visning av en E11.5 embryo før injeksjon. (C) Den samme E11.5 embryo etter injeksjon av plasmid i 0,01% Fast Green. (D) Unilateral hindbrain uttrykk av GFP observert i E11.5 embryo etter 24 timer av kultur. MB-midbrain; 4V-fjerde ventrikkel.
Figur 2. Uttrykk av GFP i Electroporated Tissue. (A) tegneserie på venstre viser plasseringen av elektroder rundt en E11.5 embryo. Midt tegnefilm skildrer opptak og uttrykk av plasmid koding GFP på venstre side av embryo. Cartoon på høyre er skjematisk av en idealisert tverrgående delen tas gjennom embryo ved levels betegnes med svarte linjer i midten tegnefilm. (B-D) Immunhistokjemi for GFP på tverrgående seksjoner via en electroporated E11.5 embryo etter 24 timer av kultur. Piler indikerer roofplate (rp) som feller den sekundære antistoffet. Bildene er tatt ved 10x forstørrelse. De relative nivåer av delene som vises er avbildet med de horisontale linjer gjennom midten tegneserie i (A). MB-midbrain; l 4V-fjerde ventrikkel, RP-roofplate.
Figur 3. Uttrykk av endogene Proteiner i Lower Rhombic Lip Immunhistokjemi for Mash1 (A og B) eller Math1 (C og D) sammenligne tverrgående deler av E11.5 embryoer som ikke var kultivert (A, C) med embryoer som ble electroporated med CAG.: : GFP og kultivert for 24 timer (B og D). Bilder tatt på 10X forstørrelse.
| Proneural Transcriptipå Factor Analysert | Antall Embryoer Analysert | Andel Beholde Normal uttrykk mønstre |
| Math1 | 15 | 86,7% |
| Mash1 | 12 | 83,3% |
| Ngn1 | 7 | 71,4% |
| Ptf1a | 6 | 100% |
Tabell I. Andel Electroporated og Helstøpt Embryoer Støttemurer Normale Proneural transkripsjonsfaktor domener i LRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro electroporation teknikk presenteres i denne studien er en roman metodikk som kan effektivt utnyttes til å manipulere genuttrykket i embryoer yngre enn 12 dager av svangerskapet. Plassering av embryoene inn i kulturen tillater uttrykk for introduserte genet og omgår letalitet observert når electroporated embryo får lov til å forbli in vivo. Denne teknikken gjør det mulig for manipulering av genuttrykk i embryonale stamceller som tidligere var utilgjengelige for electroporation-baserte studier.
Den electroporation teknikken resulterte i effektiv uttrykk for introdusert genet i 80% av embryoene analysert. Som observert i figur 2 omfanget av electroporated vev er lokalisert til diskrete regioner. For spesifikt mot ett bestemt hindbrain region for electroporation elektrodene må nøye plassert som dette styrer plasseringen av enffected vev. Dersom den nedre rhombic leppe av dorsal embryonale hindbrain er ønskelig, må padleårer være plass slik at de er direkte flankerer den bredeste delen av fjerde ventrikkel åpningen. Hvis ensidig uttrykk på en side av nevralrøret er ønsket da fosteret må plasseres mellom elektrodene slik at aksen av nevralrøret er parallelt med padleårer. Tilting av embryoet kan resultere i urettmessig målretting og / eller bilateral uttrykk. I optimalisering for å oppnå bedre electroporation effektivitet kunne man variere electroporation spenning som dette kan øke andelen av celler som opptak på electroporated DNA. Man kan også ytterligere konsentrere DNA bestandene. Som nevralrøret kan bare plass til et lite volum av væske, bør mer konsentrerte prøvene øke mengden av plasmidet introdusert inn i cellene ved electroporation. Endelig kunne man forandre diameteren på padleårer. Hvis man ønsker å målrette en mindre end mer lokaliserte regionen kan det være best å redusere padle størrelse.
Kritisk til nytten av denne teknikken i å manipulere hindbrain genuttrykk er oppbevaring av normalt gen og protein uttrykk mønstre etter electroporation og kultur av embryoer. Som dokumentert i figur 3 og tabell jeg er normal proneural transkripsjonsfaktor nivåer og mønstre godt bevart 83% av embryoene Analyseresultatene uttrykt Mash1, uttrykte 86% Math1, og 100% uttrykt Ptf1a. Nivåer av Ngn1 ble ikke så robust beholdt (71%) som de andre transkripsjonsfaktorer analysert. Mens det er mulig at denne transkripsjonsfaktor er negativt påvirket av electroporation og kultur prosedyre vi mener at det er en alternativ forklaring. Det er vist at Ngn1 uttrykk i dorsal hindbrain avtar over tid, med nivåer forsvinner ved embryonale dag (E) 12.5 16. Gitt at percentage av embryoer uttrykker Ngn1 er lavere enn de beholder normalt uttrykk for de andre proteiner vurdert (83% eller mer) er det mulig at minst en del av 30% av befruktede egg som er mangelfull i uttrykket av dorsal Ngn1 har kommet i normal utviklingsmessige program, slå Ngn1 uttrykk 24 time etter høsting på E11.5 og plassering i kultur. Dette tyder på at molekylære endringer som skjer i dorsal hindbrain mellom E11.5 og E12.5 kan oppstå i en del av embryoene, men gjør så på en asynkron eller forsinket tidsramme. Dette finne meritter videre analyse i fremtidige studier, men forringer ikke entusiasmen for denne analysen. Muligheten for at embryoer kan gjennomgår molekylære endringer som oppstår under normal utvikling bør også informere hvordan resultater fra studier som benytter denne teknikken blir tolket.
Endringer av optimaliserte electroporation og kultur vilkår presentert i ther studien er mulig. Det ble funnet at 50 V ga en robust opptaket av electroporated genet med minimal forstyrrelse vev integritet. Spenningen for de electroporations kan endres for å finjustere denne analysen til individuell eksperimentator behov. De kultur forholdene ble optimalisert på befruktede egg som ble direkte plassert inn i kultur media (beskrevet ovenfor) i en 12-brønns plate. Denne teknikken kan endres ved å plassere embryoet på en membran (CoStar) som er plassert i media av en 12-brønns plate. Under optimalisering av dyrking teknikken denne varianten ble forsøkt, men det syntes ikke å påvirke den eksperimentelle utfallet enten i electroporated genuttrykk eller bibehold av normal genuttrykk mønstre.
Denne studien fokuserer på dyrking befruktede egg i 24 timer. Embryoet har blitt dyrket i opptil 48 timer med media blir endret på 24 timer. Det ble funnet at integriteten av vevet avvist med langeh inkubasjonstider men uttrykk for electroporated GFP kan bli oppdaget. For lengre inkubasjonstider (tidligere 48 timer) kan det være nødvendig endring av kultur forholdene og vil trolig bli gjenstand for fremtidige undersøkelser.
Under optimalisering av kultur analysen ble det funnet at oppbevaring av endogent genuttrykk forbedret i embryoer som hadde større eksponering av nevralrøret til mediemiljø. I disse studiene ble dette oppnådd ved punktering av 4. ventrikkel roofplate og fjerning overflødig vev i kaudal delen av fosteret før plassering i kulturen. Fremtidige studier vil undersøke om microdissected nevralrøret kan være vellykket dyrkes under disse forholdene.
Denne studien fokuserte på electroporation av befruktede egg ved 11,5 dagers drektighet (E11.5). En fremtidig retning vil være å optimalisere teknikken for tidligere stadier av utviklingen. Vi har brukt denne teknikken på befruktede egghøstes ved E10.5 og mens vi ennå har til å akkumulere og analysere et betydelig antall embryoer vi har sett lykkes i å innføre GFP og dyrking av embryoer. En mer inngående videre studier vil være nødvendig å si med sikkerhet at den teknikken som brukes i denne studien kan brukes til yngre embryoer. Det kan være mulig å electroporate embryoer yngre enn E10.5 men det har ikke vært forsøkt.
En funksjonell anvendelse av denne teknikken kan være å overuttrykker eller slå ned funksjon av gener for å undersøke om deres protein produkter er avgjørende for produksjon av ulike nevrale subtyper fra LRL. Fremtidige forsøk med denne teknikken vil fokusere på innføring av proneural transkripsjonsfaktorer å endre skjebnen til de ulike nevrale subypes kjent for å bli produsert fra LRL på E11.5. Teknikken kan også tilpasses målrette andre neuroepithelial regioner som aktivt produserer nevroner ved E11.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jane Johnson for Math1, Ngn1, og Ptf1a antistoffer og Connie Cepko for pCAG :: GFP plasmidet. Dette arbeidet ble finansiert av NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
