Summary
Данное исследование описывает развитие
Protocol
1. Подготовка Перед Электропорация
- Усилить ДНК для электропорации на макси приготовительный (премьер-It или Qiagen). Концентрация ДНК должна быть не менее 1 мг / мл для эффективного поглощения.
- Удалить 495 мкл ДНК и смешайте с 5 мкл 0,01% Быстрый зеленый в 1 X PBS (фосфатный буферный раствор) в микроцентрифуге трубку.
2. Эмбриональные урожая
- Создание приурочено вязки из CD-1 мышей (Харлан). Проверьте наличие вагинальной пробки и считают датой вагинальный вилка наблюдается эмбриональный день (E) 0.5. Эмбрионы будут собраны 11 дней после визуализации плагин (E11.5).
- Поместите стерилизовать инструменты в 70% этаноле. Лечить капот ламинарного потока УФ-светом, по крайней мере за час до использования. Спрей капюшоном, рассекая лоток и рассекает область с 70% этанола. Разогреть 1 X PBS до 37 ° C.
- На E11.5 усыпить женщина в соответствии с условиями, утвержденными в ИнститутеРациональная Комитета по уходу и использованию животных (ICCUA). Место вскрытия лоток в ламинарном боксе. Спрей вниз живота женщины с 70% этанола.
- Откройте в брюшную полость и прикрепить к стенам рассечения лоток. Вытяните рога матки, так что она покоится в брюшную полость.
- Аккуратно разрезать стену рога матки. Используйте 20 мм ложка (Fine научно Tools), чтобы мягко удалить эмбрион в желточный мешок от плаценты. Место эмбрионов в 100 мм блюдо культуры ткани заполнено 10 мл стерильной 1 X PBS, которая подогревается в 2.2.
- Повторите эти действия для всех эмбрионов настоящее время.
3. Электропорация эмбрионов E11.5 (рис. 1)
- Использование 20 мм ложкой, передавать первый зародыш нового 100 мм блюдо заполнено 10 мл стерильной 1XPBS, который нагревается до 37 ° C.
- Используйте пинцет 11 см с 0,05 х 0,02 мм наконечник (Fine Научные инструменты) тщательно повторнодвигаться и отказаться от желтка.
- Позиция эмбрион так, что его спинной стороной вверх так, что он похож на мультфильм на рисунке 1а. Используйте 7 мм электрод весла (Harvard аппарата) аккуратно провести эмбриона. Электроды должны быть расположены по обе стороны нервной трубки на уровне заднего мозга четвертого желудочка. Желудочек видна невооруженным глазом, но с помощью вскрытия микроскоп может способствовать точного размещения весло. Позиционирование весла имеет решающее значение для определения области, который получает электропорации ДНК. Если нижняя губа ромбическая (НПН) спинного эмбриональных задний мозг желательно, весла должна быть местом, что они непосредственно фланговые самой широкой части четвертой открытия желудочка.
- Используйте 1 мл шприц, чтобы составить плазмидной ДНК смешивается с 0,01% Быстрый зеленый. 500 мкл смеси должна быть достаточной для электропорации по крайней мере, 8-10 эмбрионов (см. 3.5).
- Аккуратно проколите roofplate овerlying четвертого желудочка с 25G 5/8 туберкулин иглы прикреплен к 1 мл шприц и ввести ДНК-краситель смесь в желудочке. Успешное инъекций характеризуется ДНК-краситель смесь заполнение всей системы желудочков (рис. 1в). Количество ДНК-краситель смесь обычно вводят менее 50 мкл. Точные суммы переменных между эмбрионами, так как часть смеси, как правило, утечка из желудочка в PBS окружающих эмбрион. Альтернативный способ доставки ДНК-краситель смесь будет через доступ к желудочковой системы выкалыванием парус покрывающей мозга. Опять же, успешный инъекций характеризуется ДНК-краситель смесь заполнение всей системы желудочков.
- Доставка пяти квадратных импульсов с помощью электрического генератора импульсов (BTX) и 7 лопастей мм электрод. Каждый импульс 50 В длительностью 5 мс на импульс 500 мс между каждым импульсом. Ткани ближе к положительно заряженному электроду будет то TakЕ до плазмиды.
4. Культура эмбрионов
- В ламинарном боксе, заполните внешней лунки 12-луночного культуры блюдо с 2 мл DMEM/F12 среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина, 1% пенициллин / стрептомицин, который подогревается до 37 ° C. Культура условия были адаптированы с Диего и его коллеги 15.
- В ламинарного потока капот щепотку эмбрионов на миделе (до сердца) щипцами и удалить задней части эмбриона. Поместите переднюю часть в одном из заполненных ям 12 и культура блюдо.
- Повторите эти действия для всех эмбрионов. Заполните только внешний скважин 12-луночного планшета, чтобы избежать загрязнения культур.
- Культура эмбрионов в 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Выражение электропорации плазмиды должны наблюдаться в течение 24 часов.
- Если больше культуры раз лучшего, заполнить из скважины нового 12-луночный планшет с 2 млсредства массовой информации используются в 4.1. С стерилизованной ложкой передачи эмбрионов и в новой пластинке. Положите обратно в 37 ° C инкубатора. Культуры до 48 часов возможно.
- Когда желаемая культуры время будет достигнута, исправить эмбрионов для анализа (см. ниже).
5. Подготовка эмбрионов для анализа
- Промойте эмбрионы в 1 X PBS при 4 ° С в течение пяти минут. Повторите.
- Исправить эмбрионы на анализ в 2% параформальдегида (PFA) в 1XPBS в течение 2 часов при температуре 4 ° C.
- Промойте эмбрионы в 1 X PBS при 4 ° С в течение пяти минут. Повторите.
- Равновесие эмбрионов в 30% сахарозы в 1 X PBS в течение ночи при 4 ° C.
- Вставить эмбрионов в Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения с использованием сухого льда / этанол ванну. Эмбрионы могут храниться при температуре -20 ° C.
- Раздел эмбрионов на криостат (Leica) в 30 мкм разделы и смонтировать на слайдах (VWR, SuperFrost Plus). Хранить при температуре -20 ° C.
6. ИммунитетАнализ nohistochemistry
- Иммуногистохимическое проводили, как описано в 16. Первичное разведение антител для исследования включают кролика α-GFP (Invitrogen) 1:2500; мышь α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; кролика α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; кролика α-Ptf1a (Джейн Джонсон ) 1:2500; кролика Math1 (Jane Johnson) 1:100. Инкубировать слайд квартиры, образец вверх на лоток окрашивания при температуре 4 ° С в течение ночи.
- Слайды были проанализированы на сложный микроскоп (Olympus BX51).
7. Представитель Результаты
Схема на рисунке 1а изображен электропорации эксперимента. Рисунок 1B показывает сагиттальный вид эмбриона E11.5 до манипуляции. То же эмбрион после введения плазмиды, содержащей CAG :: GFP в 0,01% Быстрый зеленый показано на рисунке 1С, а также представитель незаписанных эмбриона выставке одностороннем GFPвыражение в спинном задний мозг 24 часа в сутки следующие культура показана на рис 1D. Протяженность области LRL, успешно электропорации является переменной и, похоже, сильно зависит от расположения электродов. В наших исследованиях было установлено, что 52 из 65 (80%) электропорации эмбрионы успешно выразил GFP. Ткань была сочтена успешной электропорации, если он был положительным для GFP в локализованных областях в течение нескольких разделов после записи и иммуногистохимического анализа (см. ниже). Эмбрионы, которые не отвечают этим критериям оценивались как неудачные попытки электропорации.
Дальнейшая оценка эффективности электропорации может быть установлена путем проведения иммуногистохимии против GFP на поперечных сечений электропорации эмбрионов на уровне четвертого желудочка. На рисунке 2 показан представитель серийных срезов из эмбриона отображения односторонниеGFP выражении. Рисунок 2А показывает идеализированную схему, которая иллюстрирует, что в левой части зародыша к положительному электроду. Поперечные сечения (на уровне представлены к середине мультфильма Рисунок 2А) выявить локализованные выражения GFP исключительно на левой стороне заднего мозга ткани (рис. 2С и 2D). Электропорации области LRL не распространяется весь передне-задней оси нервной трубки, как изучение разделов 300 мкм ростральной или больше, показанной на рис 2С не выражает GFP (рис. 2В).
Полезность этого анализа для манипуляций экспрессии генов зависит от стабильности выражения доменов эндогенных белков. LRL был охарактеризован как обладающий уникальными области предшественников характеризуется дифференциальным выражением proneural транскрипционных факторов (см. обзор 1).Некоторых из этих факторов (Mash1, Math1, Ngn1 и Ptf1a) были выбраны для анализа в связи с их предлагаемых и / или характеризуется роль в спецификации precerebellar нейронных подтипов в LRL, предмет будущих исследований 16-18. Все четыре белки имеют очень характерное выражение в области хвостового задний мозг на E11.5 16-18. Мы заметили, что эмбрионы, которые были размещены культуры удалось увеличить в размерах и также не смогли начать производство сосудистое сплетение эпителия и инвагинации LRL и roofplate, морфологических событий, которые происходят между E11.5 и E12.5 5. На основании этих наблюдений было установлено, что нормальное развитие в этих эмбрионов был остановлен или грубой задержкой и сопоставимых управления культурным эмбрионы должны быть некультурным эмбрионов на E11.5.
Для того, чтобы культура и электропорации не беспокоить уровни эндогенных белков, мы проанализировали четыре различных белков immunohistochemistry (IHC) в 34 различных эмбрионов, которые были электропорации и культурный, по крайней мере 24 часов. В таблице приведено количество эмбрионов проанализированы для каждого маркера и процент эмбрионов проанализированы, которые сохранили нормальный уровень белка. На рисунке 3 показан представитель IHC данных из двух белков проанализированы Mash1 (рис. 3A и 3B) и Math1 (рис. 3C и 3D). Мы заметили, что большинство эмбрионов сохранить нормальный уровень экспрессии после электропорации и культуры (рис. 3B и 3D) по сравнению с контролем эмбрионов на E11.5 (рис. 3А и 3С). Важно отметить, что характеристика областей экспрессии этих белков не возмущается.
Рисунок 1. Электропорация эмбрионов в E11.5. (А) Схема йЭксперимент электронной электропорации. E11.5 эмбриона выделяют и выражения плазмиды в 0,01% Быстрый зеленый вводится в четвертый желудочек. Эмбрион, то в окружении электрод весла и подвергается 50 V импульса до того, как помещается в культуре (B) Сагиттальный зрения эмбриона E11.5 перед инъекцией. (C) E11.5 же эмбрион после введения плазмиды в 0,01% Быстрый зеленый. (D) Односторонние выражение задний мозг из GFP наблюдали в зародыше E11.5 после 24 часов культуры. MB-мозга; 4v четвертый желудочек.
Рисунок 2. Экспрессия GFP в электропорации тканей. (A) мультфильм слева изображен размещения электродов вокруг эмбриона E11.5. Средние мультфильм изображает поглощение и экспрессия GFP плазмида кодирования на левой стороне зародыша. Мультфильм по праву является схема идеализированный поперечного сечения, сделанные через эмбрион на лEvels обозначаются черными линиями в середине мультфильма. (B-D) для иммуногистохимического GFP на поперечных срезах через электропорации эмбриона E11.5 после 24 часов культуры. Стрелки указывают на roofplate (РП), который задерживает вторичными антителами. Изображения, принятые на 10-кратным увеличением. Относительные уровни разделах показано изображены горизонтальные линии через середину мультфильма в (A). MB-мозга; л 4v четвертый желудочек; RP-roofplate.
Рисунок 3. Экспрессия эндогенных белков в Нижнем Ромбическая губ Immunohistochemistry для Mash1 (А и В) или Math1 (C и D) по сравнению поперечном сечении эмбрионов E11.5, которые не были культурными (A, C) с эмбрионами, которые были электропорации с CAG.: : GFP и культивировали в течение 24 ч (B и D). Изображения, полученные в 10-кратным увеличением.
| Proneural Transcriptiна фактор Проанализированы | Количество эмбрионов Проанализированы | Процент сохранение нормальной структуре выражения |
| Math1 | 15 | 86,7% |
| Mash1 | 12 | 83,3% |
| Ngn1 | 7 | 71,4% |
| Ptf1a | 6 | 100% |
Таблица I. Процент электропорации и искусственного Эмбрионы сохранение нормального Proneural фактора транскрипции доменов в LRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В пробирке электропорации техники, представленные в данном исследовании является новой методологии, которая может быть эффективно использован для управления экспрессией генов в эмбрионах моложе 12 дней беременности. Размещение эмбрионов в культуре позволяет выражение гена и обходит летальность наблюдается при электропорации эмбрионов разрешено остаться в естественных условиях. Этот метод позволяет для манипуляций экспрессии генов в эмбриональных предшественников, которые ранее были недоступны для электропорации на основе исследований.
Электропорации техники привело к эффективной экспрессии гена в 80% эмбрионов проанализированы. Как было отмечено на рисунке 2 степени электропорации ткани локализованных дискретных областей. Для того, чтобы конкретно определенном регионе задний мозг для электропорации электроды должны быть тщательно размещены, так как это определяет местоположениеffected ткани. Если нижняя губа ромбическая спинного эмбриональных задний мозг желательно, весла должна быть местом, что они непосредственно фланговые самой широкой части четвертой открытия желудочка. Если одностороннее выражение, с одной стороны нервной трубки желательно после чего эмбрион должны быть расположены между электродами так, чтобы ось нервной трубки параллельно весла. Наклон эмбриона может привести к неправильному адресности и / или двусторонних выражения. При оптимизации для достижения лучшего электропорации эффективности можно изменять напряжение электропорации так как это может увеличить долю клеток, поглощение электропорации ДНК. Можно было бы также дальнейшей концентрации ДНК акций. В нервной трубки могут разместиться небольшой объем жидкости, более концентрированные образцы должны увеличить количество плазмиды вводят в клетки при электропорации. Наконец, можно изменить диаметр лопастей. Если кто-то хочет целевой меньшег более локализованной области было бы лучше, чтобы уменьшить размер весла.
Важнейшее значение для полезности этого метода в манипулировании выражение задний мозг ген является сохранение нормального гена и моделей экспрессии белка после электропорации и культуры эмбрионов. Как указано на рисунке 3 и в таблице I, нормальной proneural транскрипционных факторов уровней и структуры хорошо сохранила 83% эмбрионов проанализировали выразил Mash1, 86% выразили Math1, и 100% выразили Ptf1a. Уровни Ngn1 не были так надежно сохранены (71%), как и другие факторы транскрипции анализировали. Хотя вполне возможно, что именно этот фактор транскрипции, пострадавших от процедура электропорации и культуры, мы считаем, что существует альтернативное объяснение. Было показано, что Ngn1 выражение в спинном задний мозг уменьшается с течением времени, с уровнем исчезают на эмбриональной день (E) 12.5 16. Учитывая, что рercentage эмбрионов выражения Ngn1 ниже, чем те, сохранив нормальное выражение для оценки других белков (83% и выше) вполне возможно, что по крайней мере часть из 30% эмбрионов, которые испытывают недостаток в выражении спинного Ngn1 продвинулись в нормальной программы развития, отключение Ngn1 выражение 24 часов после сбора урожая на E11.5 и размещение в культуре. Это говорит о том, что молекулярные изменения, которые происходят в задний мозг спинной между E11.5 и E12.5 могут возникнуть в части эмбриона, но делает это в асинхронном или задержкой времени. Этот факт говорит о необходимости дальнейшего анализа в будущих исследованиях, но не уменьшает энтузиазма по поводу этого теста. Возможность того, что эмбрионы могут быть проходит молекулярные изменения, которые происходят во время нормального развития должны также сообщить, как результаты исследований с использованием этого метода интерпретируются.
Изменения в оптимизированных электропорации и условия культивирования представлена в гоявляется исследование возможно. Было установлено, что 50 V дал надежное поглощение электропорации гена с минимальным нарушения целостности тканей. Напряжение electroporations может быть изменен для того, чтобы подстроить этого теста для каждого отдельного экспериментатора. Культура условия были оптимизированы на эмбрионах, которые были непосредственно помещается в культуре средств массовой информации (описано выше) в 12-луночного планшета. Эта техника может быть изменен путем размещения эмбриона на мембране (Costar), который помещается в средствах массовой информации 12-луночного планшета. Во время оптимизации культивирования технику этого изменения была предпринята попытка, но она, казалось, не оказывает существенного влияния экспериментальных результатов либо в электропорации экспрессии генов или сохранения нормальных моделей экспрессии генов.
Это исследование было сосредоточено на культивирование эмбрионов в течение 24 часов. Эмбрионы были культивировали в течение 48 часов со средствами массовой информации изменяется в 24 час. Было установлено, что целостность тканей сократился с длиннымиэ инкубации, но выражение электропорации GFP может быть обнаружена. Для более длительного времени инкубации (за последние 48 часа) может возникнуть необходимость изменения условий культивирования и, вероятно, будет предметом будущих исследований.
Во время оптимизации культуры анализа было установлено, что сохранение эндогенной экспрессии генов в эмбрионах улучшилась, что было большим воздействием нервной трубки для окружающей среды, средств массовой информации. В этих исследованиях это было достигнуто путем пункции 4-го желудочка roofplate и удаления посторонних ткани в задней части эмбриона до размещения в культуре. Дальнейшие исследования будут исследовать, если микродиссекции нервной трубки можно успешно культивировать в этих условиях.
Это исследование было сосредоточено на электропорации эмбрионов на 11,5 дней беременности (E11.5). Будущее направление будет оптимизировать методику ранней стадии развития. Мы использовали эту технику на эмбрионахсобирают в E10.5 и пока мы еще не накапливать и анализировать значительные количества эмбрионов мы видели успехи во внедрении GFP и культивирование эмбрионов. Более глубокого дальнейшего изучения необходимо будет с уверенностью сказать, что техника, используемая в данном исследовании, могут быть применены к младшим эмбрионов. Это можно было бы electroporate эмбрионов моложе E10.5 но никто не пытался.
Функциональные применение этого метода может быть гиперэкспрессией или сбить функции генов для расследования, если их белковые продукты имеют решающее значение для производства различных нейронных подтипов от LRL. Дальнейшие эксперименты с этой техникой будет направлена на внедрение proneural факторов транскрипции, чтобы изменить судьбу различных нервных subypes как известно, производится из LRL на E11.5. Техника также может быть адаптирована в отношении других нейроэпителиальных регионов, которые активно производства нейронов в E11.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джейн Джонсон Math1, Ngn1 и Ptf1a антител и Конни Cepko для pCAG :: GFP плазмиды. Эта работа финансировалась NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
