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Immunology and Infection

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

doi: 10.3791/3986 Published: May 14, 2012

Summary

Generazione di linfociti T da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule fornisce un approccio alternativo di utilizzare cellule staminali embrionali per T cell-based immunoterapia. Il metodo dimostra che utilizzando sia

Abstract

Trasferimento adottivo di cellule (ACT) di antigene-specifica CD8 + linfociti T citotossici (CTL) è un trattamento promettente per una varietà di tumori maligni 1. CTL può riconoscere cellule maligne interagendo antigeni tumorali con i recettori delle cellule T (TCR), e citotossine rilascio nonché citochine per uccidere le cellule maligne. È noto che meno differenziati e centro-memory-simile (denominato altamente reattivo) CTL sono la popolazione ottimale per ACT-immunoterapia, perché questi CTL hanno un elevato potenziale proliferativo, sono meno inclini alla apoptosi di cellule più differenziate e hanno maggiore capacità di rispondere alle citochine omeostatiche 2-7. Tuttavia, a causa delle difficoltà nel reperire un numero elevato di CTL tali da pazienti, c'è un bisogno urgente di trovare un nuovo approccio per la generazione altamente reattive CTL Ag-specifici per il successo terapie a base di ACT.

TCR trasduzione del sé rinnovabile stelocellule per la ricostituzione immunitario ha un potenziale terapeutico per il trattamento di malattie 8-10. Tuttavia, l'approccio per ottenere cellule staminali embrionali (CSE) di pazienti non è fattibile. Sebbene l'uso di cellule staminali ematopoietiche (CSE) per scopi terapeutici è stato ampiamente applicato in clinica 11-13, CSE hanno ridotto la differenziazione e capacità proliferative, e CSE difficili da espandere in coltura cellulare in vitro 14-16. Recenti cellule iPS tecnologia e lo sviluppo di un sistema in vitro per il gene delivery sono in grado di generare cellule iPS da pazienti senza alcun approccio chirurgico. Inoltre, come CES, cellule iPS possiedono indefinita capacità proliferativa in vitro, e hanno dimostrato di differenziarsi in cellule ematopoietiche. In questo modo, le cellule iPS hanno maggiore potenziale per essere utilizzato in ACT-based immunoterapia rispetto al CES o CSE.

Qui, presentiamo metodi per la generazione di linfociti Tcondrociti iPS da cellule in vitro e in vivo di programmazione antigene-specifici CTL di cellule iPS per promuovere sorveglianza immunitaria cancro. La stimolazione in vitro con un ligando Notch spinge la differenziazione delle cellule T da cellule iPS, e TCR risultati di trasduzione del gene nelle cellule iPS differenziarsi in cellule T antigene-specifiche in vivo, che impedisce la crescita del tumore. Così noi vogliamo dimostrare antigene-specifica differenziazione delle cellule T da cellule iPS. I nostri studi forniscono un approccio potenzialmente più efficiente per la generazione di CTL antigene-specifici per terapie a base di ACT e facilitare lo sviluppo di strategie terapeutiche per le malattie.

Protocol

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1. Coltura cellulare

  1. Preparazione delle cellule irradiate alimentazione SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) per la cultura.
    SNL76 / 7 cellule sono generalmente mantenute in 10% di siero fetale bovino (FBS) Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) media.
    1. Un piatto di coltura o matraccio saranno rivestite con 0,1% soluzione di gelatina in 37 ° C; incubatore per 30 minuti prima di recuperare SNL76 / 7 cellule di azoto liquido.
    2. Quando SNL76 / 7 cellule raggiungono la confluenza, le cellule saranno via tripsinizzate, centrifugate a 400 g per 5 minuti e risospese in terreno fresco.
    3. Risospese SNL76 / 7 celle verranno irradiate in un irradiatore 60 Co con una dose di 5000 Rads.
      Approccio alternativo, cellule SNL76 / 7 potrebbe essere sostituita da fibroblasti embrionali di topo (MEF) e mitomicina-inattivazione potrebbe sostituire irradiazione.
    4. Dopo l'irradiazione, le cellule vengono centrifugate a 400 g per 5 minuti e risospese in 10% dimetilsolfossido (DMSO) tampone FBS congelamento, in aliquotacryovials e conservati in azoto liquido per uso futuro.
  2. Preparazione di OP9 DL1-cellule per la differenziazione in vitro.
    OP9-DL1 cellule saranno generalmente mantenuto nel 20% FBS α-terreno minimo essenziale (MEM) α-media. Quando raggiungono le cellule confluenza sarà diviso in una diluizione 1:5.
  3. Preparazione delle cellule di timoma E.G7.
    E.G7 cellule timoma saranno generalmente mantenuto nel 10% FBS Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) -1640 media. Quando si arriva a confluenza, le cellule saranno divisi in una diluizione 1:10.
  4. Manutenzione generale di IPS e TCR-trasdotte cellule iPS.
    1. Un piatto cultura sarà rivestito con 0,1% di soluzione di gelatina in 37 ° C per 30 minuti prima della semina cellule feeder irSNL76 / 7 un giorno prima del recupero o di scissione delle cellule iPS.
    2. Per scissione iPS cellule, le cellule vengono tripsinizzate off, centrifugato a 400 g per 5 minuti e risospese in FBS 15% DMEM supporto.
    3. IPS tripsinizzatile cellule saranno incubate su un piatto di coltura fresco per 30 minuti a 37 ° C in incubatore prima semina fresco piatto cella irSNL76 / 7 alimentatore prerivestita per escludere cellule differenziate e cellule feeder residui.
    4. Dopo l'incubazione, 4 x 10 6 cellule vengono seminate in un piatto di coltura 100 millimetri.

2. In Programmazione vitro

  1. Nel sistema di co-coltura in vitro.
    1. Al giorno 0, 5x10 4 cellule iPS saranno seminate su una piastra di coltura contenente 100 millimetri confluenti OP9 DL1-monostrato di cellule in 20% di FBS α-MEM media.
    2. Al 3 ° giorno, terreni di coltura sarà cambiato con quelli freschi.
      1. Al 5 ° giorno, le cellule vengono tripsinizzate off e centrifugato a 400 g per 5 minuti prima di incubazione su un piatto di coltura fresco 100mm per 30 minuti a 37 ° C incubatore.
      2. Cellule galleggianti saranno raccolti e contati, 5x10 5 cellule saranno trasferiti a una coltura frescapiatto contenente confluenti OP9-DL1 monostrato cellulare nel 20% FBS α-MEM media. Citochine mFlt-3L (concentrazione finale: 5 ng / mL) verranno aggiunti nella cultura.
      1. Al 8 ° giorno, le cellule vagamente collegati saranno pipettare delicatamente verso il basso.
      2. Lavare il OP9-DL1 strato di alimentazione con 10 ml di PBS ancora una volta per ottenere il massimo recupero parzialmente differenziate cellule iPS.
      3. Dopo la raccolta di cellule dalla co-coltura, le cellule vengono centrifugate a 400 g per 5 minuti e risospese in 20% FBS a-MEM mezzo supplementato con mFlt-3L (5 ng / mL) e mIL-7 (1 ng / mL).
      4. Le cellule saranno trasferiti in una piastra da 6 pozzetti cultura rivestita con confluenti OP9-DL1 cellule. Di solito le cellule iPS recuperate da un piatto di 100 millimetri cultura saranno trasferiti in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti.
      1. Dal giorno 10, i terreni di coltura sarà cambiato in ogni altro giorno (20% FBS α-MEM supporti supplemented con mFlt-3L (5 ng / mL) e mIL-7 (1 ng / ml)).
      2. Piastre di coltura rivestito con alimentatore OP9 DL1-cellule sarà cambiato in 4-6 giorni a seconda della crescita delle cellule di alimentazione.
  2. In maturazione vivo parzialmente differenziate cellule iPS.
    1. Il giorno 22 di co-coltura, le cellule iPS verrà tripsinizzati off, centrifugato a 400 g per 5 min e incubata su un piatto di coltura fresco 37 ° C per 30 minuti.
    2. Cellule galleggianti saranno raccolti, fatto passare attraverso il filtro 70 um nylon per escludere cellule grumi che potrebbero causare embolia polmonare a topi e lavato tre volte in PBS freddo.
    3. Le cellule vengono risospese in PBS con una concentrazione di 1.5x10 7 cellule / ml.
    4. Le cellule sarà mantenuto in ghiaccio prima dell'iniezione.
    5. Prima dell'iniezione iv attraverso la vena della coda, i topi sarà posto sotto una luce infrarossa per dilatare la loro vena della coda.
    6. Dopo la vena dilatation, 200 microlitri di sospensione cellulare o 3x10 6 cellule saranno adoptively trasferito in una settimana 4 anni B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J-mouse attraverso la sua vena della coda. Tre settimane sono ammessi per la maturazione in vivo di cellule parzialmente differenziate cellule iPS.
  3. Valutazione.
    1. Cambiamenti morfologici di cellule differenziate e tassi di recupero cellulare. Figura 1.
      1. A diversi giorni di co-coltura con cellule OP9-DL1, foto di cellule in vivo saranno prese al microscopio convenzionale.
      2. Tassi di recupero cellulari sarà calcolato in base al numero di celle che raccolte dalla coltura.
    2. Citometria a flusso dei cambiamenti marcatore di superficie. Figura 2a.
      1. In diversi giorni della co-coltura, le cellule saranno rimossi dalla coltura mediante tripsinizzazione e lavate con PBS freddo prima di procedere alla colorazione della superficie cellulare.
      2. Prima di colorarlo, with diversi anticorpi coniugati con fluorocromi, le cellule saranno bloccati dal blocco 24G2 Fc in 4 ° C per 20 minuti.
      3. Dopo 20 minuti di colorazione in 4 ° C, le cellule vengono lavate tre volte in PBS freddo prima dell'esame citometria a flusso.
    3. L'attivazione in vitro di cellule differenziate iPS. Figura 2b.
      1. Un giorno prima del saggio di attivazione, prerivestimento uno piastra da 24 pozzetti con anti-CD3 (concentrazione finale: 4 microgrammi / ml, in PBS) a 4 ° C durante la notte.
      2. Il giorno 22 di co-coltura, le cellule iPS derivate le cellule T saranno raccolte dalla cultura e lavate con PBS freddo, prima stimolando con piastra di rivestimento anti-CD3 e solubile anticorpi anti-CD28 (concentrazione finale: 4 mg / mL).
      3. L'incubazione viene effettuata in 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 40 ore e quindi Befeldin A sarà aggiunto in coltura per altre 4 ore.
      4. Al termine della co-coltura, le cellule saranno haracquisiti, lavato e bloccato da bloccante Fc come descritto sopra. Cellule bloccati sarà macchiata per i marcatori di superficie come Vβ catena e CD8 TCR utilizzando anticorpi coniugati con fluorocromi.
      5. Dopo la colorazione della superficie cellulare, le cellule saranno fissate con 4% di formaldeide e permeabilizzate utilizzando il kit di permeabilizzante Biolegend.
      6. Dopo permeabilizzazione, molecole intracellulari come IL-2 e IFN-γ sarà colorate utilizzando anticorpi coniugati con fluorocromi.
      7. Prima esame flusso finale citometria, le cellule saranno lavate tre volte in PBS freddo per escludere anticorpi eccessive.
    4. Maturazione in Rag-/ - topi.
      1. Dopo tre settimane di sviluppo in vivo, Rag-/ - topi vengono sacrificati, milza e nei linfonodi saranno rimossi da topi.
      2. Singole cellule saranno trattati attraverso guasto meccanico. I globuli rossi saranno lisate mediante tampone di lisi e ACKmononucleocytes saranno raccolte e lavate due volte in PBS freddo.
      3. Dopo il lavaggio, le cellule vengono bloccati con bloccanti 24G2 Fc in 4 ° C per 20 minuti e alla fine di bloccare, le cellule saranno colorate con differenti fluorocromi coniugati anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 e anti-TCRβ anticorpi a 4 ° C per 20 minuti.
      4. Alla fine di colorazione, le cellule saranno lavate tre volte in PBS freddo prima dell'esame citometria a flusso.

3. In Programmazione vivo

  1. Generazione di costrutto retrovirale.
    1. MSCV-IRES-DsRed (MIDR) vettore è costruito sulla base MSCV-IRES-GFP vettore sostituendo il gene GFP con il gene DsRed.
    2. OT-I gene di recettore di cellule T è subclonato nel vettore MIDR per fare OT-I/MiDR costruire.
  2. Trasduzione retrovirale e selezione delle cellule.
    1. Plat-E imballaggi cellule are utilizzato per generare pseudovirus che verrà utilizzato per la trasduzione seguente.
      1. 3x10-6 Plat E cellule sono seminate su un piatto di coltura 100 millimetri un giorno prima della trasfezione.
    2. Il giorno 0, Plat-E cellule saranno trasfettate con OT-I MIDR plasmide usando reagente di trasfezione GeneJamma.
    3. Il giorno 1, 1x10 6 cellule iPS saranno seminate in un pozzetto di un 0,1% di gelatina prerivestita piastra da 24 pozzetti.
      1. Il giorno 2, pseudovirus contenenti supernatante da Plat-E la cultura saranno raccolti e passati attraverso un filtro 0,4 micron per escludere potenziali contaminanti.
      2. Trasduzione verrà eseguita sotto la condizione di 32 ° C centrifugare a 1400 rpm per 1 ora in presenza di 5 pg / ml polibrene.
      3. Dopo centrifuga basato trasduzione, le cellule saranno collocati in 32 ° C, 5% CO 2 incubatore per tutta la notte.
    4. Il giorno 3, ripetere il giorno 2 TRAnsduction procedimento come sopra descritto. Una piastra da 6 pozzetti saranno coperte con irSNL76 / 7 celle di alimentazione per uso futuro.
    5. Il giorno 4, trasdotte cellule iPS verrà tripsinizzate off, centrifugati a 400 g per 5 minuti e seminato su prerivestite cellule feeder irSNL76 / 7.
    6. Alla confluenza, le cellule saranno via tripsinizzate, centrifugate a 400 g per 5 minuti e trattati per selezione cellulare. GFP e DsRed cellule doppio positive verranno ordinati per cell sorter MoFlo. Cellule selezionate saranno coltivate su irSNL76 / 7 cellule di alimentazione per uso futuro.
  3. Trasferimento adottivo e la sfida del tumore.
    OT-I TCR trasdotte IPS (OT-I/iPS) cellule sono generalmente mantenute su cellule feeder irSNL76 / 7 come descritto sopra.
    1. Il giorno di trasferimento adottivo, le cellule vengono tripsinizzate OT-I/iPS off, centrifugato a 400 g per 5 minuti e risospese in terreno fresco.
    2. 30 minuti di incubazione su un piatto di coltura fresco in incubatore a 37 ° C è necessaria per eliminare cellule differenziatee le rimanenti cellule alimentatore.
    3. Alla fine dell'incubazione, le cellule galleggianti verrà raccolto e centrifugato a 400 g per 5 min.
    4. Pellet di cellule saranno lavate in PBS freddo per tre volte, e le cellule sono fatti passare attraverso un filtro di nylon 70 um tra due lavaggi di escludere grumi di cellule (2X filtrazione).
    5. Dopo il lavaggio, le cellule vengono conteggiati e risospese in PBS freddo in una concentrazione di 1.5x10 7 cellule / ml.
    6. Le cellule sarà mantenuto in ghiaccio prima dell'iniezione.
    7. Per il trasferimento adottivo, 4-6 settimane vecchi topi di sesso femminile C57BL/6J verranno utilizzati. Prima dell'iniezione iv attraverso la vena della coda, i topi saranno sottoposti a una luce a infrarossi per dilatare le vene coda.
    8. Dopo la dilatazione della vena, 200 microlitri di sospensione cellulare o 3x10 6 cellule saranno adoptively trasferiti attraverso la vena della coda. Sei settimane sarà consentito per la maturazione in vivo di OT-I TCR trasdotte cellule iPS.
      1. Dopo sei settimane di iniezione endovenosa, 4x10 6 cellule E.G7 timoma saranno inoculati per via intraperitoneale.
      2. E.G7 cellule di timoma saranno raccolte dalla coltura e lavato tre volte in PBS.
      3. Alla fine del lavaggio, le cellule vengono sospese in PBS freddo in una concentrazione di 8x10 7 cellule / ml.
      4. 50 microlitri di sospensione cellulare o 4x10 6 cellule vengono iniettate nella cavità peritoneale.
  4. Valutazione.
    1. In vitro caratterizzazione di OT-I TCR trasdotte cellule iPS.
      1. Fluorescente esame microscopico dei DsRed, GFP le cellule doppio positive verranno eseguite sotto convenzionale microscopio a fluorescenza non fissate con cellule vive.
      2. L'integrazione e l'espressione genica saranno analizzati sia da PCR e RT-PCR analisi.
        1. Cellular DNA o RNA viene isolato da campioni separatamente utilizzando DNA Qiagen oKit di isolamento dell'RNA.
        2. PCR e RT-PCR viene effettuata utilizzando primer che riconoscono specificamente la regione ricombinato VDJ di TCR Vβ5 catena.
    2. Lo sviluppo delle cellule T e la maturazione. Figura 3a.
      1. Alla settimana 2, 4 e 6 celle dopo il trasferimento, animali saranno sacrificati e nodi milza, linfonodi saranno rimossi da animali.
      2. Sospensione di singola cellula sarà effettuato mediante guasto meccanico. Globuli rossi vengono lisate mediante tampone di lisi ACK e mononucleocytes saranno raccolte e lavate due volte in PBS freddo.
      3. Dopo il lavaggio, le cellule vengono bloccati con bloccanti 24G2 Fc in 4 ° C per 20 minuti e alla fine di bloccare, cellule verranno aliquotato e colorati con differenti anticorpi coniugati con fluorocromi a 4 ° C per 20 minuti.
      4. Alla fine di colorazione, le cellule saranno lavate tre volte in PBS freddo prima di caricare al citofluorimetro.
    3. Peptide stimolazione. Figura 3b.
      1. Il giorno 50 di sfida del tumore, gli animali saranno sacrificati e nodi milza, linfonodi saranno rimossi dagli animali.
      2. Sospensione di singola cellula sarà effettuato mediante guasto meccanico. Globuli rossi vengono lisate mediante tampone di lisi ACK e mononucleocytes saranno raccolte e lavate due volte in PBS freddo.
      3. Cellule T CD8 + sarà isolato utilizzando Miltenyi Biotec di cellule CD8 + T kit di isolamento. Isolate le cellule T CD8 + sarà mescolato con irradiati splenociti isolati da topi naive C57BL/6J nel rapporto di 1:10 e pulsata con 0,5 micromol / peptide OVA 257-264 ml per 40 ore. Successivamente, brefeldina A sarà aggiunto alla coltura per altre 4 ore.
      4. Al termine della co-coltura, le cellule vengono raccolte, lavate e bloccate con bloccanti Fc come descritto sopra.
      5. Cellule bloccati sarà macchiata per il marchio di superficieERS come e CD8 TCR Vβ5 catena usando fluorocromi anticorpi coniugati.
      6. Dopo la colorazione della superficie cellulare, le cellule saranno fissate con 4% di formaldeide e permeabilizzate utilizzando kit di permeabilizzazione cellulare.
      7. Dopo permeabilizzazione, molecole intracellulari come IL-2 e IFN-γ sarà colorate utilizzando anticorpi coniugati con fluorocromi.
      8. Prima esame flusso finale citometria, le cellule saranno lavate tre volte in PBS freddo per escludere anticorpi eccessive.
    4. In vivo uccidendo test. Figura 3C.
      1. Splenociti da topi naïve C57BL/6J saranno isolati ed etichettati con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) come cellule bersaglio.
      2. Cellule marcate con 5 mmol / ml CFSE (CFSE cellule hi) saranno pulsate con 10 ug / ml di peptide OVA 257-264 e cellule marcate con 0,5 mmol / ml CFSE (CFSE cellule LO) non essere pulsata. Una miscela di cellule CFSE 2.5x10 6 hi più 2.5x10 6 celle CFSE Lo sarà adoptively trasferiti mediante iniezione iv in destinatario indicato.
      3. Dopo 16 ore, splenociti da tali topi verrà isolato e celle + CFSE verranno analizzate mediante citometria di flusso.
    5. Intraperitoneale conta delle cellule tumorali. Figura 4.
      Al giorno 20 di sfida tumore, i topi vengono sacrificati e il lavaggio della cavità peritoneale verrà effettuata utilizzando PBS freddo. Lavaggio peritoneale recuperato cellule tumorali verranno contate.
    6. Tumore infiltrante cellule T identificazione. Figura 5.
      1. Nella fase tardiva di sfida tumore, i topi vengono sacrificati e tumore verrà rimosso dalla cavità peritoneale da diversi gruppi.
      2. Tumore sarà tagliato in pezzi, un pezzo sarà messo in una esageratamente e messo in ghiaccio secco subito, l'altra metà sarà fissato in performaldeide e un pezzo terzo sarà conservato in condizionata RPMI-1640 media per un uso futuro.
      3. Colorazione H & E sarà eseguita in base al protocollo generale da fisso formaldeide e campioni avvolti in paraffina.
      4. Colorazione immunofluorescenza verrà eseguita su campioni crioconservati.
        1. Tissue sarà sezionata e conservati a -20 ° C prima dell'uso.
        2. Le sezioni di tessuto saranno asciugati all'aria 15 minuti prima di 15 minuti fissazione acetone freddo.
        3. Dopo il fissaggio, le sezioni saranno asciugati all'aria per altri 15 minuti prima del lavaggio 5 minuti PBS.
        4. Dopo vetrini lavatoio, in una camera umida e coprire la sezione di tessuto con 30 microlitri 3% BSA in PBS per 30 minuti per bloccare il legame non specifico.
        5. Al fine di bloccare, tampone la tampone bloccante e coprire le sezioni di tessuto con una miscela 50 pl di PE-anti-TCR Vα2 anticorpi e FITC anti-OVA anticorpi diluiti in 3% BSAin PBS.
        6. Incubare in una camera umida per 2 ore e alla fine dell'incubazione, vetrini vengono lavati tre volte in PBS freddo e con montato un supporto di montaggio a base di acqua prima fluorescente esame microscopico.
      5. Citometria a flusso delle cellule T tumore infiltrante.
        1. Tumor sarà schiacciato nella sospensione cellulare singola e globuli rossi vengono lisate mediante tampone di lisi ACK.
        2. Dopo il lavaggio e bloccaggio, le cellule vengono marcate con differenti anticorpi coniugati con fluorocromi che riconoscono specificamente CD8, TCR Vα2 e TCR V β5 molecole espresse sulla superficie cellulare.
    7. Topo sopravvivenza. Figura 6.
      Dopo la sfida del tumore, la sopravvivenza del mouse sarà attentamente monitorato.

4. Risultati rappresentativi

CD3 e TCRβ sono usati come marcatori di Tcellule. Per determinare se la stimolazione delle cellule iPS con il ligando Notch DL1 potrebbe contribuire alla differenziazione delle cellule T, abbiamo valutato l'espressione di CD3 + e TCRβ su cellule iPS derivate da cellule, e l'espressione ulteriormente analizzato dei CD4 e CD8, CD3 + il gating e TCRβ + popolazione. Come si vede qui, il giorno 22, CD3 + CD4 + TCRβ - CD8 + singole positive (SP), le cellule T sono stati generati da cellule iPS in vitro. Inoltre, i derivati ​​da cellule iPS SP cellule erano in grado di produrre IL-2 e IFN-γ quando stimolata in vitro da lamiera rivestita con anti-CD3 e anti-CD28 solubili anticorpi (Fig. 2), suggerendo le iPS cellule derivate Le cellule T sono funzionali.

Dopo il trasferimento adottivo in topi riceventi, la maggioranza dei TCR gene-trasdotte iPS sottoposti differenziazione in CTL CD8 +, che hanno risposto in vitro per stimolazione con il peptide da sécreting IL-2 e IFN-γ (Fig. 3). La cosa più importante, il trasferimento adottivo di TCR-trasdotte cellule iPS innescato infiltrazione di OVA CTL-reattivi nei tessuti tumorali e animali protette dalla sfida del tumore (Fig. 5-6). Così, TCR gene-trasdotte cellule iPS possono differenziarsi in funzionali antigene-specifici CTL in vivo.

Figura 1
Figura 1. Morfologia della differenziazione delle cellule iPS. A vari giorni, iPS topo cellule sono state co-coltivate con OP9 DL1-α-cellule in mezzo MEM supplementato con 20% FCS e 2,2 g / L di bicarbonato di sodio in presenza di 5 ng / ml mFlt3L e 1 ng / ml mIL-7 .

Figura 2
Figura 2. Differenziazione delle cellule T da cellule iPS. Mouse cellule iPS state co-coltivate con OP9 DL1-cellule come descritto nella Figura 1. Su day 22, iPS derivati ​​da cellule cellule sono state isolate e analizzati. A) CD4 + CD8 - o CD4 - CD8 + cellule dopo gating su CD3 + e + TCRβ popolazioni. B) Le cellule sono state stimolate con piastra rivestita con anti-CD3 e anti-CD28 solubile anticorpi per 5 ore a 37 ° C al 5% CO 2. IL-2 e IFN-γ sono stati analizzati mediante colorazione intracellulare, dopo gating il CD4 vivi - cellule T CD8 +.

Figura 3
Figura 3. Antigene-specifica CD8 + T-cellule sviluppo dalle cellule iPS in vivo. OT-I TCR gene-trasdotte iPS sono state iniettate iv in topi C57BL / 6. Dopo sei a dieci settimane, OVA-specifici CD8 + + Vβ5 lo sviluppo delle cellule T è stata determinata. A) CD8 + + Vβ5 cellule T da LNs pool e la milza sono stati analizzati mediante citometria a flusso, dopo il gating su CD8 + popolazioni. B) IL-2 e IFN-γ produzione (linee scure; aree ombreggiate indicano controlli isotipici) sono stati determinati mediante colorazione intracellulare citochina, dopo gating sulle CD8 + + Vβ5 popolazioni. C) In vivo proliferazione / citotossicità dosaggio. CFSE hi (picchi a destra) e lo CFSE (picchi sinistra) cellule bersaglio sono state pulsate con OVA 257-264 peptide e il controllo, rispettivamente, e sono state iniettate in topi dieci settimane dopo il trasferimento delle cellule iPS o un giorno dopo OT-I CTL trasferimento.

Figura 4
Trasferimento Figura 4. Adottivo di OT-I TCR gene-trasdotte iPS sopprime la crescita tumorale. OT-I TCR gene-trasdotte adoptively cellule iPS sono state trasferite in topi C57BL / 6. Un gruppo di topi è stato iniettato con OVA reattivo cellule T CD8 + da OT-I TCR topi transgenici e un gruppo di topi avevano alcun trasferimento cella. Dopo sei settimane sia o il giorno seguente dopo il trasferimento delle cellule, i topi sono stati sottoposti a sfidare con le cellule tumorali E. G7. Il giorno 20, le cellule tumorali nella cavità peritoneale sono enumerati.

Figura 5
IPS Figura 5. Derivato dalle cellule antigene-specifica CTL infiltrarsi nei tessuti tumorali. Il giorno 30-35 dopo sfida del tumore, i tessuti tumorali sono stati esaminati per tumore-infiltrazione di cellule T reattive. A) H & E colorazione. Cellule infiammatorie infiltrate nei tessuti tumorali (↓). B) colorazione immunoistologica. OVA-specifici Vα2 + CTL (rosso), infiltrato in OVA che esprimono i tessuti tumorali (verde). C) Singolo-sospensioni di cellule provenienti da tessuti tumorali sono stati analizzati per l'espressione di Vα2 Vβ5 + e + mediante citometria a flusso, dopo gating sulla popolazione CD8 +.

"/ Figura 6. Trasferimento adottivo di OT-I TCR gene-trasdotte cellule iPS sostiene la sopravvivenza del mouse. OVA TCR gene-trasdotte iPS sono state adoptively trasferite in topi C57BL / 6 che sono stati sottoposti ad impugnare con cellule E. G7 tumorali come descritto in Fig. 4. La sopravvivenza del mouse sul giorno 50 è stato mostrato il metodo di Kaplan-Meier curve di sopravvivenza (n = 6).

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Discussion

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Per ACT-terapie, la generazione in vitro di un gran numero di cellule T reattive altamente Ag-specifiche in vivo reinfusione è un approccio ottimale. Sebbene il nostro metodo in vitro comporta funzionali di cellule T da cellule iPS, un gran numero di cellule iPS derivate cellule muoiono in quattro settimane, soprattutto nella quarta settimana. Si conclude che i segnali di sopravvivenza di Notch segnalazione mediata dalla DL1 e IL-7 e Flt3L non sono sufficienti a mantenere la sopravvivenza delle cellule progenitrici iPS derivati ​​da cellule T, altri fattori di sopravvivenza può essere cooperativa di regolare questi maturazione delle cellule. TCR trasduzione genica e stimolazione in vitro con il ligando Notch ampiamente diretto differenziazione delle cellule T da cellule iPS, tuttavia, i derivati ​​da cellule iPS antigene-specifiche cellule T non riesce ancora a sopravvivenza più, che impedisce di ottenere numeri appropriati di iPS derivato dalle cellule antigene- cellule T specifiche per ACT-immunoterapia.

ve_content "> Lo sviluppo dei linfociti T nel timo è un processo ben ordinata. I timociti immaturi senza espressione di CD4 e CD8 sono indicati come doppi negativi (DN) cellule. precursori DN sono divisi in sottoinsiemi di sviluppo basato su espressione di CD44 e CD25:. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) e DN4 (CD44 - CD25 -) Solo DN3 cellule che hanno generato una catena funzionale TCRβ, che coppia con il invarianti pre-Tα CD3 e le catene per formare un pre-TCR e vengono selezionati per ulteriore differenziazione. Questo evento, denominato β-selezione, rappresenta il primo checkpoint durante lo sviluppo delle cellule T. pre-TCR proliferazione formazione di segnali, cessazione di riarrangiamento locus TCRβ , e la differenziazione dei timociti DN ai CD4 + CD8 + doppio positive (DP) stage 17. La stimolazione in vitro won il ligando Notch DL1 spinge le cellule iPS di passare attraverso il β-selezione checkpoint in 2 settimane, e diventare pre-cellule T (CD3 + TCRβ +; CD25 - CD44 -; CD4 - CD8 -). Altre due settimane di stimolazione consente di pre-cellule T mature al transito in cellule CD8 + T (CD3 +, CD4 + TCRβ - CD8 +; CCR7 + CD62L + CD27 + CD127 +). Le cellule T mature SP moriranno in assenza di una stimolazione ulteriormente il TCR e complesso CD3.

In programmazione in vivo di antigene-specifici CTL di cellule iPS possono superare la carenza di ottenere un numero sufficiente di cellule T per terapie a base di ACT. Nonostante il controllo della crescita tumorale osservato, abbiamo individuato alcune limitazioni di ACT con TCR gene-trasdotte cellule iPS. In primo luogo, almeno sei settimane in vivo sviluppo è essenziale per la differenziazione delle cellule T derivato dal transferred cellule iPS. In secondo luogo, abbiamo notato perdita di pelo, l'osteoporosi e altre manifestazioni minori autoimmuni in topi che avevano ricevuto TCR-trasdotte cellule iPS, come osservato in alcuni studi clinici che amministrano T cell-based immunoterapia del cancro. Questi effetti possono essere causati dalla generazione di altri tipi di cellule immunitarie dalle cellule trasferiti iPS. Tuttavia, come queste cellule vengono generati in vivo rimane ignoto. Terzo, trasferimento adottivo di TCR gene-trasdotte iPS ha il rischio di generare teratoma causa del suo fenotipo stelo. Ma finora nel nostro studio, abbiamo identificato solo massa extrathymic in uno RAG1 - / - mouse e non hanno osservato anomalie in C57BL convenzionale / 6 topi. Pertanto, si consiglia, per ottenere la massima efficienza, è meglio per ottenere corrispondenza genetica di sfondo per la differenziazione in vivo iPS.

In contrasto con i derivati ​​dei CES, l'espressione del gene anomalo in alcune cellule differenziate da cellule iPS hanno la potential per indurre T-dipendente dalle cellule in risposta immunitaria riceventi singenici 18. Pertanto, l'immunogenicità di cellule derivate dal paziente-specifiche cellule iPS devono essere valutate prima applicazione clinica di queste cellule autologhe è contemplato. Analizzando i profili di espressione genica di iPS cellule derivate da cellule, è stato dimostrato che un gruppo di geni 9 (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, SPT1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, RETN) sono state espresse a livelli anormalmente elevati . Inoltre, inducendo l'espressione di tre di questi geni (Hormad1, Zg16 e Cyp3a11) in cellule ES significativamente aumentata immunogenicità il trapianto in riceventi geneticamente trovati 18. Pertanto, il gruppo di proteine ​​9 ha il potenziale di provocare rigetto immune delle cellule derivate da cellule iPS dopo trasferimento adottivo, e possono rappresentare marcatori immunogeniche. Ciononostante, la potenziale immunogenicità dei iPS cell-derived linfociti T non è stata determinata.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo il dottor Shinya Yamanaka (Kyoto University) per la fornitura di IPS-MEF-Ng-20D-17 della linea cellulare, Dr. Dario Vignali (Research Hospital di St. Jude Children) per sostenere l'OT1-2A • pMig II costrutto, Dr. Juan Carlos Zuniga-Pflucker (Dipartimento di Immunologia, Università di Toronto) per sostenere il OP9-DL1 linea cellulare, e il Dr. Kent E Vrana (Dipartimento di Farmacologia, Penn State University College of Medicine) per aiutare la progettazione di questo studio. Questo progetto è finanziato, in base a concessioni con il numero di Grant K18CA151798 dal National Cancer Institute, il Trust Barsumian e il Melanoma Research Foundation (Song J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

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Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T
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Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

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