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Medicine

Caracterização de mecanismos moleculares de doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo. Radiação solar ultravioleta (UVR) é o principal fator de risco para o desenvolvimento de catarata. Um modelo animal de longe RUV-B catarata induzida foi desenvolvido. Neste artigo vamos descrever os métodos de investigação de formação de catarata: a exposição a raios ultravioletas, RT-PCR e imuno-histoquímica.

Abstract

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo 1. A Organização Mundial de Saúde define catarata como uma turvação da lente do olho, o que impede a transferência da luz. A catarata é uma doença multi-factorial associada com diabetes, o tabagismo, radiação ultravioleta (RUV), o álcool, a radiação ionizante, esteróides e hipertensão. Há evidências experimentais 2-4 e epidemiológica forte que 5,6 UVR provoca catarata. Foi desenvolvido um modelo animal para a RUV B catarata induzida em ambos com 7 anestesiados e não anestesiados animais 8.

A única cura para a catarata é a cirurgia, mas este tratamento não é acessível a todos. Estimou-se que o atraso de aparecimento da catarata por 10 anos poderia reduzir a necessidade de cirurgia de catarata em 50% 9. Para atrasar a incidência de catarata, que é necessária para compreender os mecanismos de formação de catarata e encontrar estratégia de prevenção eficazgias. Entre os mecanismos para o desenvolvimento de cataratas, a apoptose desempenha um papel crucial na iniciação da catarata em humanos e animais 10. Nosso foco tem sido recentemente apoptose na lente como o mecanismo para o desenvolvimento de cataratas 8,11,12. Prevê-se que uma melhor compreensão do efeito da radiação UV sobre a via de apoptose proporcionará possibilidades para a descoberta de novos fármacos para prevenir a catarata.

Neste artigo, nós descrevemos como catarata pode ser induzida experimentalmente pela exposição in vivo a RUV-B. Além disso RT-PCR e imuno-histoquímica estão apresentados como ferramentas para o estudo dos mecanismos moleculares de catarata induzida por radiação UV-B.

Protocol

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1. A exposição à radiação ultravioleta

  1. 15 min antes da exposição, anestesiar uma ratazana Sprague-Dawley do sexo feminino, com uma mistura de 90 mg / kg de Ketalar (cetamina), e 10 mg / kg de Rompun (xilazina) por injecção intraperitoneal.
  2. Colocar o animal em um limitador de rato e apertar as correias até a imobilização do rato sem provocar um aperto do tronco 13.
  3. Instilar Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, em ambos os olhos dos ratos para induzir midríase.
  4. Colocar o animal para que um olho está posicionado de encontro a um estreito feixe de RUV a 300 nm 14 nm com 10 largura total a metade do valor máximo e proteger o olho contralateral com fita adesiva preta.
  5. Exponha o rato unilateralmente limiar sub-dose de 1 kJ / m 2 RUV-B a 300 nm para 15 min 15.

2. Dissecação

  1. Após pré-determinado intervalo de pós-exposição (1, 5, 24 e 120 horas), o sacrifício do rato de seis semanas de idade (peso <200 g) por carbon asfixia e dióxido de deslocamento das vértebras cervicais.
  2. Enuclear olhos. Depois disso, coloque a córnea do olho para baixo, lado posterior para cima. Em seguida, o perfurador de um furo através da aplicação de um mínimo de uma cânula de calibre 27 e empurre tangencialmente à esclerótica para evitar danificar a lente que é muito próximo da esclera. Em seguida, usar um par de tesouras de cirurgia oftálmica para cortar circunferencialmente logo atrás do limbo até que a porção posterior da esclerótica pode ser levantada. Depois, levante a lente com uma pinça sem corte curvas.
  3. Remover restos do corpo ciliar do equador do cristalino sob um microscópio, mantendo a lente na solução de sal equilibrada de não mais do que 5-10 minutos.

3. RT-PCR quantitativa

  1. Colocar uma lente em uma mistura de 350 ul de tampão de lise RA1 (NucleoSpin ARN II de ARN total isolado kit) e 3,5 ul de β-mercaptoetanol em 2 ml de tubo Eppendorf.
  2. Manter a lente nesta mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
  3. Homogeneizar a lente comuma agulha até que apenas o núcleo duro do cristalino é deixada entre a lente (córtex e da cápsula da lente são lisadas em tampão de lise). Remover o núcleo a partir da mistura.
  4. Armazenar as amostras imediatamente a -70 ° C.
  5. Descongelar as amostras e seguir o protocolo "purificação RNA total a partir de células cultivadas e tecidos" (NucleoSpin RNA II RNA total isolamento kit).
  6. Armazenar as amostras de ARN a -70 ° C.
  7. Para verificar a remoção suficiente de DNA de cada amostra, execute uma PCR sob as seguintes condições (passo 1: 95 ° C durante 2 min; passo 2 durante 40 ciclos de: 95 ° C durante 20 segundos, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 20 segundos; passo 3: 72 ° C durante 7 min) com os iniciadores de ADN específicos de p53, para a frente 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'e inverso 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' e a Taq DNA polimerase (dNTPack), de acordo com a fabricação protocolo. O produto de PCR esperado é 243 pares de bases.
  8. Executar uma electroforese em gel de agarose 1,5% para detectar ADN do produto de PCR específico de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de agarose gel em tampão TBE ter 3,75 g de agarose e resolvê-lo em 250 ml de tampão TBE. Adicionar brometo de etídio (0,5 mg / ml) em 500 ul de 500 ml de solução a 1,5% de gel de agarose. Aquece-se a mistura num forno de microondas owen e agitar para resolver a agarose.

Nenhuma das amostras tem de revelar quaisquer produtos de PCR específicos de DNA em electroforese em gel de agarose a 1,5%.

  1. Medir a concentração de amostras de RNA (1 ul) e a razão entre a absorvância da amostra a 260 nm (RNA) e 280 nm (de proteína) em um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop. Se o RNA relação à proteína de RNA absorvância da amostra é de 2,0 ou mais, em seguida, a amostra de RNA é puro. Se a razão de absorvância da amostra de RNA é menor do que 2,0, refazer o RNA etapa de purificação de 3,5.
  2. Tomar um volume de amostra de ARN correspondente a 1 ug e sintetizar cDNA após a 1 ª Strand Kit protocolo de síntese de ADNc (1 st Strand Kit de síntese de ADNc por RT-PCR).
  3. Armazenar as amostras de cDNA a -20 ° C(Por um período de um ou mais anos, armazenar a -70 ° C).
  4. Executar quantitativa PCR em tempo real em iCycler única cor MyiQ Real Time sistema de detecção de PCR. Carga triplicados em placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por caspase 3, de acordo com as instruções para a fabricação. Carga triplicados em outra placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por 18s, de acordo com as instruções para a fabricação (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Diluir em série de uma fracção de cDNA a partir de três escolhidos aleatoriamente não expostas lentes. Executar diluições em série juntamente com o cDNA a partir de amostras em uma placa de 96 poços.
  5. Utilizar o método de curva padrão para a quantificação dos resultados. O número de ciclos a fluorescência limiar é utilizado como a medida em software MyiQ. Uma curva padrão de expressar o número de ciclos de limiar como uma função da concentração relativa de calibrador é eslecido para as diluições em série em cada uma das placas. cDNA a partir de três amostras não tratadas foi de lente usada para calibração. Relacionar o número limite de ciclos para cada amostra com a curva padrão para se obter a concentração relativa da amostra de cDNA medido. Finalmente, obter o nível de expressão dos genes alvo através da relação entre a concentração relativa do alvo de cDNA para os 18s de controlo interno de cDNA.

4. A coloração imuno-histoquímica

  1. Fixação
    1. Dissecar o olho em PBS (Tampão fosfato salino, pH 7,4).
    2. Colocar o olho em um tubo cheio com paraformaldeído a 4% (PFA) em frio de gelo durante 20 min. Prepare PFA 4% no dia anterior. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização. PFA é fresco por cerca de uma semana.
    3. Remover PFA com uma micropipeta. Em seguida, lava-se com PBS arrefecido em gelo durante 20 min.
    4. Colocar o olho em sacarose a 30%, a +4 ° C durante a noite.
    5. Colocar o olho em um copo cheio de temperatura de corte ideal (outubro) e médio (Tissue-Tek). Colocar o olho em posição adequada para o corte.
    6. Congelar em OCT médio sobre gelo seco.
    7. Armazenar a -70 ° C até à sua utilização.
  2. Seccionamento
    1. Posicione o olho para crio-corte em um plano apropriado.
    2. Corte três 5 mm de espessura médio-sagital secções de uma porção central de cada uma das lentes. Descartar pelo menos seis trechos entre seções seqüenciais para evitar manchar os mesmos núcleos em diferentes seções.
    3. Uma vez que a seção tenha sido cortada, coloque delicadamente um slide em cima dela. A seção deve, então, ficar com o slide.
    4. Deixar as lâminas secar ao ar antes da utilização. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C até serem necessárias.
  3. Fluorescência imunohistoquímica
    1. Deixe as amostras atingir a temperatura ambiente (5-10 min).
    2. Desenhar bordas em torno dos espécimes com uma caneta PAP-(Invitrogen).
    3. Deixe que a fronteira seco durante algum tempo (10 min).
    4. Rotular as lâminas de microscópio.
    5. Rehidratar em 1 × PBS durante 15 min.
    6. Permeabilizar a solução padrão para bloco de 30 min.
    7. Adicionar anticorpo primário (caspase-3 de coelho, policlonal de anticorpos clivados Asp175 9661; tecnologia de sinalização celular, Inc) diluída 1:3.000 em solução bloco padrão.
    8. Armazenar numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite.
    9. Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (> 15 min, 1-2 alterações).
    10. Adicionar anticorpo secundário (anticorpo de coelho anti secundária com um espectro de absorção / emissão específico) diluído 1:300 em solução de bloqueio padrão.
    11. Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (> 15 min, 1-2 alterações).
    12. Limpe PAP pen-manchas.
    13. Armazenar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 3 hr. Evitar a exposição à luz.
    14. Adicionar uma gota de Vectashield e colocar uma lamela sobre a lâmina. Evite fazer bolhas.
    15. Deixe secar a camada Vectashield (~ 20 min).
    16. Mantenha seções in no escuro até a análise.
    17. Todas as secções de controlo são tratados, na ausência de anticorpo primário.
    18. Olhe para os resultados dentro de algumas horas sob um microscópio de fluorescência.
    19. Conte núcleos de células epiteliais "de um arco lateral nuclear para outro lado arco nuclear de cada lente. Aplicar o filtro padrão azul para ver todos os núcleos lente epitelial em azul e um filtro padrão que se encaixa a emissão do anticorpo secundário para ver os núcleos caspase-3 positiva em verde.
    20. Registar o número de todos os núcleos lente epiteliais e o número de núcleos positivos. Conte as células três vezes para cada seção.

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Representative Results

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As várias fontes de variação nas medidas foram estimadas com uma análise de variância, e verificou-se que, considerando três medidas por animal da variância para as medições foi da ordem de 15% do que para os animais. Assim, tendo em vista a análise da lente inteira, não é possível aumentar a precisão. Testes ortogonal elucidado um contraste estatisticamente significativo para a caspase-3 de mensagem entre 120 intervalo de latência hr vs intervalos mais curtos de latência.

In vivo induz a exposição RUV expressão da caspase-3.

Figura 1
Figura 1. Esquemática do fluxo da exposição à radiação ultravioleta.

Figura 2
Figura 2. Evolução da caspase-3 a expressão do mRNA (casp3) no cristalino após exposição in vivo a 1 kJ / m 2 UVR a 300 nm. As barras de erro são intervalos de confiança de 95% para a média da razão casp3 mRNA/18s rRNA entre a lente objectiva não exposto e exposto contralateral. Os meios, acima e abaixo da linha preta na 1 rel. unidade, representam respectivamente, para cima e para baixo-regulação do gene casp3.

Figura 3
Figura 3. Expressão da caspase-3 (A) em uma lente exposta, 24 horas após a exposição e (B) de uma lente não exposto. As setas indicam células marcadas.

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Discussion

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Este artigo descreve métodos que permitem estudar eventos moleculares que ocorrem durante a catarata induzida UVR-B.

Considerando, que a maioria das informações disponíveis para in vivo UVR catarata induzida foi derivada a partir de experiências sobre albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, decidimos usar o rato Sprague-Dawley albinos, no presente estudo. Idade dos ratos foi de seis semanas de idade. O gênero foi escolhido para ser fêmea, porque, em contraste com os machos, as fêmeas têm urina menos alergênicos. Além disso, não há nenhuma diferença de sexo em relação à gravidade da catarata induzida UVR 20.

Todos os animais foram mantidos e tratados de acordo com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Permissão ética foi obtido a partir do animal Uppsala Experiments Ethics Committee, número de protocolo C 29/10. Os ratos são obtidos a partir de um criador comercial (Taconic, Dinamarca).

tenda "> A fonte de raios ultravioletas de banda estreita foi escolhida para que o UVR ser espectralmente bem definida. sensibilidade máxima da lente de rato a RUV-B é de cerca de 300 nm. A dose de 1 kJ / m 2 foi escolhida para ser inferior à dose limiar 15. O tempo de exposição de 15 min, foi selecionado para induzir dano máximo para a lente 21. A dose de exposição à radiação UV-B e pós-exposição ao tempo pode variar de acordo com o desenho experimental.

Olho órgão emparelhado tem a sua vantagem em termos de estatísticas e ética no uso de animais em pesquisa. Exposição unilateral do olho permite a utilização de um lado como o outro lado exposto e como controle em um animal, assim, reduz o número de animais por metade em relação ao órgão desemparelhado.

Neste protocolo, utilizamos anestesia como um método para a imobilização de animais. No entanto, outra alternativa, rato limitador 13, que concebido no nosso laboratório, podem ser utilizados para imobilização de animais unanaesthetized. Rats têm de ser condicionadas ao limitador de ratos antes da exposição aos raios UV. Este dispositivo permite que bem controlados exposições repetidas quando a anestesia não é recomendada devido aos seus efeitos secundários. Aqui, utilizou-se o limitador de rato como um dispositivo de posicionamento e de exploração para animais anestesiados.

O limitador de rato é feita de madeira e está disponível em vários itens em nosso laboratório. Nós limpamos o nosso dispositivo de contenção antes de cada animal é posicionado sobre ele. Blocos de madeira, caleiras e abrigos de madeira são usados ​​como enriquecimento nas gaiolas de ratos. Este enriquecimento é aprovado pelo animal Uppsala Experimentos Comitê de Ética e da Federação das Associações Laboratório Europeu de Ciência Animal (FELASA).

A lente tem de ser dissecado em BSS em curto período de tempo (5-10 min). Esta restrição permite que a lente para ficar claro e transparente.

qRT-PCR

O tempo de 30 min para manter a lente em tampão de lise RA1 é ptough romper a cápsula da lente e do córtex. O núcleo da lente permanece rígido dentro de 30 min. O núcleo da lente, ou organelo zona livre é considerado uma transcrição parte não activa da lente. Por conseguinte, o núcleo é removido a partir da amostra, a fim de aumentar a relação sinal / ruído de expressão de mRNA.

O iniciador de ADN específico utilizado para RNA pureza (ausência de ADN) de controlo foi seleccionado arbitrariamente para ser p53-primer. Quaisquer sequências que ocorrem geralmente codificados de DNA do genoma do animal em particular pode ser escolhido. Ambas as lentes foram analisadas por PCR para 10 animais por pós-exposição e para cada intervalo de lente, caspase-3, o conteúdo de RNA foi determinada em três medidas independentes.

RT-PCR permite medir o mRNA de interesse. A transcriptase reversa de mRNA converte em ADN complementar, que é então amplificado através de PCR. As medições foram quantificados utilizando a curva padrão obtida por amplificação de amostras diluídas em série do cDNA de interest. As vantagens da aplicação de uma curva padrão é que a curva padrão proporciona uma forma fiável para calcular a incerteza da concentração, e que a curva padrão proporciona medições quantitativas do mRNA de interesse. Alternativamente, o teor relativo do mRNA de interesse pode ser directamente estimado por comparação do número de ciclos necessários para se obter um sinal de fluorescência normalizado, o método-Ct. A principal desvantagem da curva de calibração é que requer o uso de mais produtos genómicos que o método Ct.

A coloração imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi utilizada para estudar a distribuição espacial do activo caspase-3 nas células epiteliais da lente.

Os olhos foram imediatamente congelados a -70 ° C para parar toda a bioquímica em curso. Os olhos foram então armazenados à mesma temperatura durante a preservação.

Imunohistoquímica está associada a dois pro geralblems; a especificidade do anticorpo primário e a ligação não especifica do anticorpo. O anticorpo deve ser adquirido a partir de uma fonte bem controlada, garantindo assim a especificidade. Se possível, o tecido contendo o epitopo deve ser corado como um controlo positivo. A fim de outrule coloração não específica, se possível, o epitopo deve ser bloqueada antes da coloração com o anticorpo específico para o controlo negativo. Além disso, a coloração não específica pode ser minimizada através do estabelecimento da concentração de anticorpos e tempo de reacção óptimo. Tanto por coloração do tecido exposta a raios ultravioletas e de tecidos não expostos à radiação UV, é possível estabelecer a RUV induzida epitopo, aqui caspase-3. Para facilitar a contagem das células que expressam caspapse-3 o sinal de imagem de microscopia de fluorescência foi gravada digitalmente. A fim de minimizar a variação de ruído de fundo, utilizou-se as configurações fixas para todas as fotografias de microscópio.

A intensidade do sinal de fluorescência de fundo varia em uma continuous escala. Por conseguinte, um limite para a coloração significativa tem de ser definida. No entanto, a fluorescência média pode variar espacialmente dentro da secção observado o que torna difícil a utilização de um limiar absoluto para a coloração significativa. Por isso, normalmente o julgamento de coloração específica depende de um observador experiente eo resultado absoluto de coloração específica depende do parecer do observador experiente, mas será consistente para que observador. Por esse motivo, apenas um observador experiente foi usado. Para melhorar o sinal causado pela variável experimental, a exposição à radiação UV, em relação ao ruído, a fotografia de cada secção foi contada três vezes.

Se possível, a imunohistoquímica deve ser verificada por Western blot que confirma a existência de epitopos com a massa molecular esperada.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Karolinska KID-financiamento Autoridade de Protecção, sueco Radiação, Instituto Karolinska Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Olho St. Erik Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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