Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

توصيف الآليات الجزيئية لل doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

ساد هو السبب الرئيسي للعمى في العالم. الطاقة الشمسية الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) هو عامل الخطر الرئيسي للتنمية الساد. تم تطوير نموذج حيواني من الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها حتى الساد-B. في هذه المادة ونحن تصف أساليب التحقيق في تشكيل الساد: التعرض ل، الأشعة فوق البنفسجية الكمية RT-PCR والمناعية.

Abstract

ساد هو السبب الرئيسي للعمى في العالم 1. وتعرف منظمة الصحة العالمية الساد كما تغيم عدسة العين مما يعوق نقل الضوء. ساد هو مرض متعدد مضروب المرتبطة والسكري الإشعاع، والتدخين فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، والكحول، والإشعاع المؤين، والمنشطات وارتفاع ضغط الدم. هناك أدلة قوية التجريبية 2-4 والوبائية للأشعة فوق البنفسجية يتسبب 5،6 التي الساد. وضعنا نموذج حيواني لالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية B في كل من الساد 7 تخدير الحيوانات وغير تخدير 8.

العلاج الوحيد للساد هو عملية جراحية ولكن هذا العلاج ليس في متناول الجميع. وتشير التقديرات إلى أن التأخير لبداية ساد لمدة 10 سنوات يمكن أن تقلل من الحاجة إلى جراحة الساد بنسبة 50٪ 9. لتأخير حدوث المياه الزرقاء في العين، وهناك حاجة لفهم آليات تشكيل الساد والوقاية تجد فعالة STRATegies. بين آليات التنمية الساد، موت الخلايا المبرمج يلعب دورا حاسما في بدء الساد في البشر والحيوانات 10. ولقد انصب اهتمامنا في الآونة الأخيرة موت الخلايا المبرمج في عدسة كآلية للتنمية الساد 8،11،12. من المتوقع أن التوصل إلى فهم أفضل لتأثير الأشعة فوق البنفسجية على مسار موت الخلايا المبرمج سوف توفر إمكانيات اكتشاف أدوية جديدة لمنع إعتام عدسة العين.

في هذه المقالة، ونحن تصف كيفية الساد يمكن أن يتسبب في التعرض تجريبيا من الجسم الحي للأشعة فوق البنفسجية-B. يتم عرض مزيد RT-PCR والمناعية كأدوات لدراسة الآليات الجزيئية للأشعة فوق البنفسجية من الساد الناجم-B.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التعرض للأشعة فوق البنفسجية

  1. 15 دقيقة قبل التعرض، تخدير الأنثى سبراغ داولي الفئران بمزيج من 90 ملغ / كغ Ketalar (الكيتامين) و 10 ملغ / كغ Rompun (زيلازين) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
  2. وضع الحيوانات في restrainer الفئران وتشديد الأحزمة حتى تجميد الفئران دون التسبب في أزمة الجذع 13.
  3. غرس Mydriacyl (تروبيكاميد)، 10 ملغ / مل، في كلتا العينين من الفئران للحث على توسيع حدقة العين.
  4. وضع الحيوان بحيث يتم وضع ذلك عين واحدة ضد حزمة ضيقة من الأشعة فوق البنفسجية في 300 نانومتر 14 مع عرض 10 نانومتر كامل في نصف الحد الأقصى وحماية العين المقابل مع شريط أسود.
  5. كشف الفئران من جانب واحد دون العتبة جرعة 1 كج / م 2 للأشعة فوق البنفسجية-B في 300 نانومتر لمدة 15 15 دقيقة.

2. تشريح

  1. بعد آخر محدد مسبقا الفاصلة التعرض (1، 5، 24 و ساعة 120)، التضحية الفئران لمدة ستة أسابيع من العمر (الوزن <200 غ) من كاربون الاختناق وثاني أكسيد خلع في فقرات عنق الرحم.
  2. استأصل العينين. بعد ذلك، وضع القرنية العين إلى أسفل، حتى الجانب الخلفي. ثم، لكمة ثقب الحد الأدنى من خلال تطبيق مقياس قنية 27 و دفع عرضية إلى الصلبة لتجنب إتلاف العدسة التي هي قريبة جدا من الصلبة. ثم استخدم مقصا لقطع جراحات العيون محيطي خلف حوف حتى يمكن رفع الجزء الخلفي من خارج الصلبة. ثم، رفع العدسة مع ملقط منحني حادة.
  3. إزالة بقايا الجسم الهدبي من خط الاستواء تحت المجهر عدسة، والحفاظ على العدسة في محلول ملحي متوازن لم يعد من 5-10 دقيقة.

3. RT-PCR الكمي

  1. وضع العدسة في مزيج من 350 ميكرولتر العازلة تحلل RA1 (RNA NucleoSpin II مجموع RNA العزلة طقم) و 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول في أنبوب إيبندورف 2 مل.
  2. تبقي العدسة في هذا المزيج خلال 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. التجانس مع العدسةويترك حتى إبرة النواة الصلبة فقط للعدسة من عدسة (والقشرة هي lysed وكبسولة للعدسة في المخزن المؤقت تحلل). إزالة النواة من هذا المزيج.
  4. عينات متجر على الفور في -70 ° C.
  5. ذوبان الجليد العينات واتباع البروتوكول "تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا والأنسجة مثقف" (RNA NucleoSpin II مجموع RNA العزلة عدة).
  6. متجر عينات الحمض النووي الريبي في -70 ° C.
  7. للتحقق من إزالة كافية من الحمض النووي من كل عينة، تشغيل PCR وفقا للشروط التالية (الخطوة 1: 95 ° C لمدة 2 دقيقة، الخطوة 2 لمدة 40 دورات: 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 ° C لمدة 20 ثانية؛ الخطوة 3: 72 ° C لمدة 7 دقائق) مع الاشعال DNA P53 محددة، إلى الأمام 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 "وعكس 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3 'طق بوليميريز وDNA (dNTPack)، وفقا لتصنيع البروتوكول. المنتج PCR المتوقعة هي أزواج قاعدة 243.
  8. تشغيل هلام الاغاروز 1.5٪ الكهربائي للكشف عن الحمض النووي PCR المنتج محددة من أزواج قاعدة 243. لإعداد1.5٪ الاغاروز هلام العازلة في اتخاذ TBE 3،75 غرام من الاغاروز وحلها في 250 مل من TBE العازلة. إضافة بروميد إيثيديوم (0.5 ملغ / مل) 500 ميكرولتر في 500 مل من محلول 1.5٪ هلام الاغاروز. تسخين الخليط في الميكروويف أوين ويقلب لحل الاغاروز.

أي من العينات أن تكشف أي DNA محددة منتجات PCR على 1.5٪ الكهربائي للهلام الاغاروز.

  1. قياس تركيز عينات الحمض النووي الريبي (1 ميكرولتر) ونسبة امتصاص العينة في 260 نانومتر (RNA) و 280 نانومتر (البروتين) في الطيف ND-1000 NanoDrop. إذا كان البروتين RNA نسبة لعينة من الحمض النووي الريبي الامتصاصية هو 2.0 أو أكثر ثم عينة الحمض النووي الريبي هو محض. إذا كانت نسبة الامتصاص عينة الحمض النووي الريبي هو أقل من 2.0، إعادة RNA خطوة تنقية 3.5.
  2. اتخاذ حجم العينة RNA الموافق 1 ميكروغرام وتوليف [كدنا] ستراند بعد بروتوكول ST 1 التوليف [كدنا] كيت (1 شارع ستراند التوليف [كدنا] كيت RT-PCR ل).
  3. تخزين العينات في -20 درجة [كدنا] C(لمدة 1 و سنوات أخرى، المحل في -70 درجة مئوية).
  4. تشغيل الكمي في الوقت الحقيقي PCR على MyiQ iCycler واحدة لون نظام الوقت الحقيقي الكشف PCR. تحميل ثلاث مكرارت على لوحة 96-بشكل جيد مع نموذج 1 ميكرولتر [كدنا]، TaqMan التعبير الجيني ماجستير ميكس، TaqMan الفحص التعبير الجيني لكاسباس 3، وفقا لتعليمات تصنيع. تحميل ثلاث مكرارت على آخر لوحة 96-بشكل جيد مع نموذج 1 ميكرولتر [كدنا]، TaqMan التعبير الجيني ماجستير ميكس، TaqMan الفحص التعبير الجيني ل18S، وفقا لتعليمات تصنيع (TaqMan الفحص الجيني التعبير البروتوكول). تمييع في سلسلة جزء من [كدنا] من ثلاث عدسات غير مكشوفة اختيارها عشوائيا. تشغيل التخفيفات المسلسل مع [كدنا] من عينات في لوحة 96-أيضا.
  5. استخدام الأسلوب الكمي لمعيار منحنى النتائج. يتم استخدام عدد من الدورات في مضان عتبة كما القياس في برامج MyiQ. A منحنى القياسية التعبير عن عدد من الدورات في عتبة وظيفة التركيز النسبي للتدريج هو EStablished لالتخفيفات المسلسل في كل لوحة. وقد استخدم [كدنا] من ثلاث عينات غير المعالجة لعدسة المعايرة. ربط عدد من الدورات عتبة لكل عينة لمنحنى القياسية للحصول على التركيز النسبي للعينة [كدنا] قياس. وأخيرا، والحصول على مستوى التعبير عن الجينات المستهدفة عن طريق ربط تركيز النسبية للهدف [كدنا] إلى [كدنا] 18S الرقابة الداخلية.

4. المناعى تلوين

  1. تثبيت
    1. تشريح العين في PBS (الفوسفات مخزنة المالحة؛ درجة الحموضة 7.4).
    2. وضع العين في أنبوب مملوء بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الجليد الباردة لمدة 20 دقيقة. إعداد PFA 4٪ في اليوم السابق. مخزن +4 ° C في استخدام حتى. PFA هو جديد لمدة أسبوع واحد تقريبا.
    3. إزالة PFA مع micropipette. ثم، يغسل مع الثلج الباردة PBS لمدة 20 دقيقة.
    4. وضع العين في 30٪ سكروز +4 ° C في أكثر من ليلة.
    5. وضع العين في كأس مليئة درجة الحرارة المثلى للقطع (OCT)-المتوسطة (الأنسجةتك). وضع العين في وضع مناسب لتقطيع.
    6. تجميد في OCT-المتوسطة أكثر من الثلج الجاف.
    7. المحل في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. باجتزاء
    1. وضع العين في البرد تقطيع طائرة المناسب.
    2. ثلاث قطع 5 ميكرون سميكة منتصف السهمي أقسام من الجزء المركزي من كل عدسة. تجاهل ما لا يقل عن 6 أقسام بين أبواب متسلسلة لتجنب تلطيخ نواة نفسها في أقسام مختلفة.
    3. مرة واحدة وقد تم قطع الجزء، ضع شريحة بلطف على أعلى من ذلك. ينبغي لقسم عصا ثم إلى الشريحة.
    4. ترك الشرائح إلى الهواء الجاف قبل الاستخدام. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
  3. مضان المناعية
    1. اسمحوا عينات تحقيق درجة حرارة الغرفة (5-10 دقيقة).
    2. رسم حواف حول العينات باستخدام قلم-PAP (إينفيتروجن).
    3. اسمحوا الحدود الجافة لفترة من الوقت (10 دقيقة).
    4. تسمية الشرائح المجهر.
    5. ترطيب في 1 × PBS لمدة 15 دقيقة.
    6. Permeabilize في حل كتلة القياسية لمدة 30 دقيقة.
    7. إضافة الأجسام المضادة الأولية (أرنب بولكلونل، كاسباس-3 المشقوق الأجسام المضادة Asp175 9661؛ الخليوي التكنولوجيا تشوير، المؤتمر الوطني العراقي) المخفف في حل 1:3،000 كتلة القياسية.
    8. مخزن في غرفة مرطب C ° +4 في أكثر من ليلة.
    9. يغسل في برنامج تلفزيوني من قبل pipetting (3 × 5 دقائق) أو عن طريق غمر في حمام كبيرة (> 15 دقيقة، 1-2 التغييرات).
    10. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة لمكافحة الأرانب الثانوية مع طيف الامتصاص / الانبعاثات المحددة) المخفف في 1:300 الحل كتلة القياسية.
    11. يغسل في برنامج تلفزيوني من قبل pipetting (3 × 5 دقائق) أو عن طريق غمر في حمام كبيرة (> 15 دقيقة، 1-2 التغييرات).
    12. تمحو PAP من ركلة جزاء التناسلية.
    13. في غرفة تخزين في درجة حرارة الغرفة مرطب لمدة 3 ساعة. تجنب التعرض للضوء.
    14. إضافة قطرة من Vectashield ووضع زلة غطاء على الشريحة. تجنب الوقوع في فقاعات.
    15. السماح للتصلب Vectashield (~ 20 دقيقة).
    16. الحفاظ على القسمين الأولن الظلام حتى التحليل.
    17. تتم معالجة كافة أقسام التحكم في غياب الأجسام المضادة الأولية.
    18. البحث عن النتائج في غضون بضع ساعات تحت المجهر مضان.
    19. عد نوى الخلايا الظهارية "من جانب واحد القوس القوس النووية لالجانب الآخر النووية من كل عدسة. تطبيق عامل التصفية القياسية الزرقاء لمشاهدة كافة نواة العدسة الظهارية في الزرقاء ومرشح القياسية التي تناسب الانبعاثات من الأجسام المضادة الثانوية لرؤية نوى كاسباس-3 الإيجابية باللون الأخضر.
    20. تسجيل عدد من النوى كل عدسة الظهارية وعدد النوى إيجابية. عد الخلايا ثلاث مرات لكل قسم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقدرت مصادر مختلفة من التباين في القياسات مع تحليل التباين ووجد أن ثلاثة قياسات النظر لكل حيوان التباين للقياسات كان بناء على أمر من 15٪ من تلك الحيوانات. وبالتالي، معتبرا كله تحليل العدسة، فإنه من غير الممكن لزيادة الدقة. توضيح الاختبار متعامد على النقيض ذات دلالة إحصائية لرسالة كاسباس-3 الفاصل الزمني بين 120 ساعة مقابل فترات الكمون الكمون أقصر.

في التعرض لتلك الأشعة المجراة يدفع كاسباس-3 التعبير.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي لتدفق التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

الشكل 2
الشكل 2. تطور كاسباس3 التعبير مرنا (casp3) في العدسة البلورية بعد التعرض في فيفو إلى 1 الأشعة فوق البنفسجية 2 كج / م في 300 نانومتر. أشرطة الخطأ هي فترات الثقة 95٪ لنسبة متوسط ​​casp3 mRNA/18s الرنا الريباسي بين العدسة وتعرض عدسة المقابل لم تتعرض. الوسيلة، فوق وتحت الخط الأسود في 1 الرطوبة. وحدة على التوالي، تمثل أعلى ولأسفل التنظيم من الجين casp3.

الشكل 3
الشكل 3. كاسباس-3 التعبير (A) في عدسة المكشوفة، 24 ساعة بعد التعرض و(B) في عدسة غير مكشوفة. الأسهم تظهر الخلايا المسمى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتصف هذه الورقة دراسة الأساليب التي تمكن الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء الساد الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية-B.

النظر، التي تم اشتقاق معظم المعلومات المتاحة للفي الجسم الحي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية الساد من التجارب على الفئران سبراغ داولي البيضاء 7، 16، 17، 18، 19، قررنا استخدام البيضاء سبراغ داولي الفئران وفي الدراسة الحالية. وكان عمر الفئران ستة أسابيع من العمر. وقد تم اختيار جنس الإناث ليكون بسبب، على النقيض من الذكور، والإناث أقل البول تسبب الحساسية. وعلاوة على ذلك، لا يوجد فرق بين الجنسين في ما يتعلق بفعل شدة الأشعة فوق البنفسجية الساد 20.

تم الاحتفاظ بها جميع الحيوانات وعلاجها وفقا للبيان أرفو لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. تم الحصول على إذن من الحيوان الأخلاقية أوبسالا جنة الأخلاقيات التجارب، رقم البروتوكول C 29/10. ويتم الحصول على الفئران من مربي التجارية (تاكونيك، الدانمرك).

خيمة "> وقد تم اختيار مصدر للأشعة فوق البنفسجية ضيقة النطاق من أجل أن الأشعة فوق البنفسجية ليكون طيفيا محددة. الحساسية القصوى للعدسة الفئران للأشعة فوق البنفسجية B-حوالي 300 نانومتر، وجرعة 1 تم اختيار كج / م 2 لتكون تحت عتبة جرعة 15. تم اختيار الساعة 15 دقيقة من التعرض للحث على أكبر قدر من الضرر على عدسة 21. جرعة من الأشعة فوق البنفسجية التعرض ل-B والوقت بعد التعرض يمكن أن تختلف اعتمادا على تصميم التجريبية.

إقران الجهاز لديه العين ميزتها من حيث الإحصاءات والأخلاق في استخدام الحيوانات في البحوث. التعرض من جانب واحد من العين يمكن استخدام جانب واحد كما تتعرض وجها آخر والتحكم في حيوان واحد وبالتالي فإنه يقلل من عدد الحيوانات بمقدار النصف مقارنة مع الجهاز المفردة.

في هذا البروتوكول استخدمنا التخدير كوسيلة لتجميد الحيوان. ومع ذلك، بديل آخر، يمكن استخدام الفئران restrainer 13، والتي صممت نحن في مختبرنا، لتجميد الحيوانات unanaesthetized. Rالمنشطات يجب أن تكون مشروطة إلى restrainer الفئران قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية. هذا الجهاز يسمح تسيطر عليها بشكل جيد التعرض المتكرر عند التخدير لا ينصح نظرا لآثارها الجانبية. هنا، استخدمنا restrainer الفئران وتحديد المواقع وجهاز القابضة للحيوانات تخدير.

يتم إجراء restrainer الفئران من الخشب، وتتوفر في عدة بنود في مختبرنا. نقوم بتنظيف الجهاز لدينا قبل تقييد يتم وضع كل حيوان على ذلك. وتستخدم الكتل الخشبية، المزاريب والملاجئ والخشب في أقفاص تخصيب الفئران. تمت الموافقة من قبل تخصيب الحيوان أوبسالا جنة الأخلاقيات والتجارب اتحاد الجمعيات الأوروبية مختبر علم الحيوان (FELASA).

العدسة لابد من تشريح في BSS في فترة قصيرة من الزمن (دقيقة 5-10). هذا التقييد تسمح للعدسة للبقاء واضحة وشفافة.

QRT-PCR

وقت 30 دقيقة لحفظ العدسة في المخزن المؤقت هو تحلل RA1 ENough لتعطيل كبسولة العدسة والقشرة. نواة العدسة يزال من الصعب في غضون 30 دقيقة. ويعتبر نواة العدسة، أو منطقة خالية من عضية أن تكون النسخ غير نشط جزء من العدسة. لذلك، تتم إزالة النواة من العينة من أجل زيادة التعبير مرنا إشارة / نسبة الضوضاء.

وقد تم اختيار التمهيدي DNA محددة تستخدم للنقاء الحمض النووي الريبي (DNA غياب) التحكم بشكل تعسفي لتكون P53-التمهيدي. يمكن اختيار أي تسلسل تحدث عموما ترميز الجينوم DNA من الحيوان خاصة. وقد تم تحليل كل من العدسات مع PCR لمدة 10 الحيوانات في فترة ما بعد التعرض ولكل عدسة، تحديد كاسباس RNA-3 المحتوى في ثلاثة قياسات مستقلة.

RT-PCR يمكن لقياس مرنا في المصالح. والناسخ العكسي يحول مرنا في الحمض النووي التكميلية التي يتم تضخيمه ثم PCR. وتم قياس كمية القياسات باستخدام منحنى القياسية التي تم الحصول عليها عن طريق تضخيم عينات تخفيفه بشكل متسلسل من [كدنا] إدارة النزاهة المؤسسيةerest. مزايا تطبيق منحنى القياسية هي أن منحنى القياسية يوفر وسيلة يمكن الاعتماد عليها لحساب عدم التيقن من التركيز، وأن منحنى القياسية توفر قياسات كمية لمرنا في المصالح. وبدلا من ذلك، يمكن أن يقدر المحتوى النسبي للمرنا من الفائدة من خلال مقارنة مباشرة عدد الدورات المطلوبة للحصول على إشارة مضان موحدة، و-CT الأسلوب. العيب الرئيسي من منحنى المعايرة هو أنه لا يتطلب استخدام المزيد من المنتجات الجينية من الأسلوب ط م.

المناعى تلوين

وقد استخدم المناعية لدراسة التوزيع المكاني لنشاط كاسباس في الخلايا-3 عدسة الظهارية.

تم تجميد نظر فورا إلى -70 ° C إلى وقف كافة الكيمياء الحيوية الجارية. تم تخزينها بعد ذلك نظر في نفس درجة الحرارة للمحافظة.

ويرتبط المناعية مع برو العامانblems، وخصوصية من الأجسام المضادة الأولية وملزم غير محددة من الأجسام المضادة. وينبغي أن حصلت على الأجسام المضادة من مصدر للرقابة بشكل جيد، وبالتالي ضمان خصوصية. إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي ملطخة الأنسجة التي تحتوي على حاتمة كعنصر تحكم إيجابية. من أجل outrule غير محددة تلطيخ، إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي حظر حاتمة قبل تلطيخ مع تحكم معينة، الأجسام المضادة سلبية. يمكن التقليل وعدم تلطيخ محددة أخرى عن طريق إنشاء تركيز الأجسام المضادة الأمثل وفترة رد الفعل. من تلطيخ كل الأنسجة تتعرض للأشعة فوق البنفسجية والنسيج لم تتعرض للأشعة فوق البنفسجية، فمن الممكن لإنشاء الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية حاتمة، هنا كاسباس-3. لتسهيل عملية فرز الخلايا معربا عن caspapse-3 تم تسجيلها رقميا إشارة الصورة المجهر مضان. استخدمنا من أجل تقليل الاختلاف من الضوضاء في الخلفية، وإعدادات ثابتة لجميع الصور المجهر.

كثافة مضان الخلفية إشارة إلى يتفاوت على التعاونntinuous النطاق. ولذلك، فإن الحد الأدنى لتلطيخ كبيرة لابد من تعيين. ومع ذلك، قد تختلف مكانيا متوسط ​​مضان داخل القسم لاحظ مما يجعل من الصعب استخدام عتبة المطلق لتلطيخ كبيرة. لذلك، عادة ما حكم تلطيخ محددة تعتمد على مراقب من ذوي الخبرة ونتائج المطلقة لتلطيخ محددة تعتمد على رأي المراقب من ذوي الخبرة ولكن سوف تكون متسقة لذلك المراقب. لهذا السبب، كانت تستخدم فقط أحد المراقبين من ذوي الخبرة. لتحسين إشارة الناجمة عن التعرض التجريبية، متغير للأشعة فوق البنفسجية، وبالمقارنة مع الضوضاء، عد صورة لكل قسم ثلاث مرات.

إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي التحقق من المناعية طخة غربية مؤكدة بذلك وجود الحواتم مع حجم الجزيئية المتوقعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل معهد كارولينسكا KID التمويل، السويدية الإشعاع هيئة حماية، معهد كارولينسكا مؤسسة أبحاث العيون، بندقية اوتش برتيل Stohnes Stiftelse، وسانت إريك في مستشفى العيون مؤسسة أبحاث، Ögonfonden، Konung غوستاف V: S اوتش Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
  2. Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
  3. Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
  4. Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
  5. McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
  6. Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
  7. Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
  8. Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
  9. McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
  10. Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
  11. Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
  12. Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
  13. Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89, (1), (2011).
  14. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
  15. Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
  16. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
  17. Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
  18. Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  19. Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  20. Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
  21. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
توصيف الآليات الجزيئية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الأشعة فوق البنفسجية المستحثة الساد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter