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Medicine

의 분자 메커니즘의 특성 doi: 10.3791/4016 Published: November 28, 2012

Summary

백내장은 세계에서 실명의 주요 원인이다. 태양 자외선 방사 (UVR)는 백내장 개발을위한 주요 위험 요소입니다. 지금까지 UVR-B 유발 백내장의 동물 모델은 개발되었습니다. UVR, 정량 RT-PCR 및 immunohistochemistry에 노출 :이 글에서 우리는 백내장 형성에 대한 조사를하는 방법을 설명합니다.

Abstract

백내장은 세계 1 실명의 주요 원인이다. 세계 보건기구 (WHO)는 빛의 전송을 막는 눈의 수정체의 뿌옇게로 백내장 정의합니다. 백내장은 당뇨병, 흡연, 자외선 방사선 (UVR), 알코올, 이온화​​ 방사선, 스테로이드 및 고혈압과 관련된 여러 요소 질병입니다. UVR은 백내장 일으키는 강력한 2-4 실험 및 역학 증거 5,6가 있습니다. 우리는 anesthetized 7 비 anesthetized 동물 모두에 UVR B 유발 백내장에 대한 동물 모델을 개발했습니다.

백내장에 대한 유일한 치료는 수술이지만이 치료는 모든 액세스 할 수 없습니다. 그것은 10 년 동안 백내장의 발병을 지연 50 % 9 백내장 수술에 대한 필요성을 줄일 수있는 것으로 추산되었습니다. 백내장의 발생을 지연하기 위해, 그것은 백내장 형성의 메커니즘을 이해하고 효과적인 예방 strat를 찾을 필요합니다egies. 백내장 개발을위한 메커니즘 중 apoptosis 인간과 동물 10 백내장의 개시에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 우리의 초점은 최근 백내장 개발 8,11,12을위한 메커니즘으로 렌즈의 apoptosis있다. 그것은 apoptosis 경로에 UVR의 효과를 더 잘 이해 백내장 방지 할 수있는 새로운 의약품의 발견에 대한 가능성을 제공 할 것으로 예상된다.

이 문서에서는, 우리는 실험적으로 UVR-B에 생체 노출에 의해 유도 할 수있는 방법 백내장 설명합니다. 또한 RT-PCR 및 immunohistochemistry이 도구 UVR-B 유발 백내장의 분자 메커니즘을 연구하기로 제공됩니다.

Protocol

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1. 자외선 방사선에 노출

  1. 15 분 노출되기 전에, 90 밀리그램 / kg Ketalar (케타민)와 intraperitoneal 주사로 10 밀리그램 / kg Rompun (xylazine)의 혼합물 여성 Sprague-Dawley 쥐를 마취.
  2. 쥐 restrainer에서 동물을 놓고 트렁크 짜 13 발생하지 않고 쥐의 고정까지 벨트를 조이십시오.
  3. mydriasis를 유도 할 수있는 쥐의 두 눈에 Mydriacyl (tropicamide), 10 MG / ML을 심어.
  4. 그 한쪽 눈이 절반이 최대 10 nm의 전체 폭이 300 nm의 14 UVR의 좁은 빔에 대해 위치 될 수 있도록 동물을 놓고 검은 색 테이프 contralateral 눈을 보호.
  5. 15 300 nm의 분 15에서 쥐 일방적으로 하위 임계 복용 한 kJ / m 2 UVR-B을 쉽게받을 수 있습니다.

2. 해부

  1. 미리 정해진 후 노출 간격 (1, 5, 24 및 120 시간) 후, carbo하여 육주 늙은 쥐 (체중 <200g)를 희생N 개의 이산화 질식과 경추의 전위.
  2. 명백히하다 눈. 이후, 아래 뒤쪽면을 눈 각막을 넣어. 그런 다음, 펀치 27 게이지 캐뉼라를 적용하고 공막에서 매우 가깝습니다 렌즈 손상을 방지하기 위해 공막에 tangentially 밀어로 최소한의 구멍. 그런 다음 공막의 뒤쪽 부분을 들어 올려 수있을 때까지 그냥 limbus 뒤에 원주 잘라 안과 수술 가위를 사용합니다. 그런 다음, 무딘 곡선 포셉으로 렌즈를 올린다.
  3. 5-10 분보다 더 이상 균형 소금 솔루션에 렌즈를 유지, 현미경 렌즈 적도에서 모양체의 잔해를 제거합니다.

3. 정량 RT-PCR

  1. 350 μl RA1 용해 완충액 (NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)와 2 ML Eppendorf 튜브에 3.5 μl β-메르 캅토 에탄올의 혼합에 렌즈를 삽입합니다.
  2. 실온에서 30 분 동안이 혼합에 렌즈를 보관.
  3. 로 렌즈를 균질화렌즈 만 하드 핵까지 바늘이 렌즈 (피질과 렌즈의 캡슐이 용해 버퍼에 lysed 아르)에서 남아있다. 믹스에서 핵을 제거합니다.
  4. 스토어 샘플 즉시 -70시 ° C.
  5. 샘플을 해동하고 프로토콜 "교양 세포와 조직의 총 RNA 정화"(NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)를 따르십시오.
  6. 스토어 RNA 샘플 -70에서 ° C.
  7. 2 분 95 ° C, 40 사이클에 대한 2 단계 : 각 샘플에서 DNA의 충분한 제거를 확인하려면 다음과 같은 조건 (1 단계에서 PCR을 실행 95 ° C 20 초, 55 ° C 20 초에 72 ° 20 초에 C, 3 단계 : 7 분 72 ° C) p53 유전자의 DNA 특정 프리 머와 함께 앞으로 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 '와 역 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (dNTPack), 제조에 따라 프로토콜입니다. 예상 PCR 제품은 243 기본 쌍입니다.
  8. 243 기본 쌍 DNA 특정 PCR 제품을 감지 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다. 준비하기TBE 버퍼에 1.5 % 아가로 오스 겔은 아가로 오스의 3.75 g을 가지고 TBE 버퍼 250 ML에 해결. ethidium 브로마이드 (0.5 MG / ML) 1.5 % 아가로 오스 겔 솔루션 500 ML 500 μl를 추가합니다. 전자 레인지 오웬의 혼합물을 가열하고 아가로 오스를 해결하기 위해 젓는다.

샘플 중 어느 것도 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동에있는 모든 DNA 특정 PCR 제품을 나타 내기 위해이 없습니다.

  1. RNA 샘플 (1 μl)의 농도와 NanoDrop ND-1000 분광 광도계에서 260 나노 미터 (RNA)와 280 nm의 (단백질)에서 샘플 흡광도의 비율을 측정합니다. RNA 샘플 흡광도의 단백질에 대한 비율 RNA 2.0 이상이면 다음 RNA 샘플은 순수합니다. RNA 샘플 흡광도의 비율이 2.0보다 낮 으면 정화 단계 3.5 RNA 다시 실행.
  2. 1 μg에 해당하는 RNA 샘플의 볼륨을 타고 프로토콜 1의 스트랜드 cDNA 합성 키트 (RT-PCR을위한 1 차 스트랜드 cDNA 합성 키트)에 따라 cDNA 합성.
  3. -20 ° C에서 cDNA 샘플을 저장(기간 1과 년 이상, -70에서 저장 ° C).
  4. iCycler MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 검출 시스템에 정량 실시간 PCR을 실행합니다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, caspase 3 TaqMan 유전자 발현 분석과 함께 96 - 웰 플레이트에 triplicates 지침을 제조했다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, 18에 대한 TaqMan 유전자 발현 분석과 또 다른 96 - 웰 플레이트에 triplicates 안내 (TaqMan 유전자 발현 분석 프로토콜)를 제조했다. 시리즈에서 세 무작위로 선택한 비 노출 렌즈의 cDNA의 일부를 희석. 96 - 웰 플레이트에 샘플의 cDNA와 함께 시리얼 dilutions을 실행합니다.
  5. 결과의 정량화에 대한 표준 곡선 방법을 사용합니다. 임계 형광의 사이클의 수는 MyiQ 소프트웨어의 측정으로 사용됩니다. 캘리브레이터의 상대적 농도의 함수로 입구에서 사이클의 수를 표현하는 표준 곡선은 에스입니다각 플레이트에 시리얼 dilutions을 위해 tablished. 세 이외의 치료 렌즈 샘플의 cDNA는 보정을 위해 사용되었다. cDNA가 측정 샘플의 상대적인 농도를 얻기 위해 표준 곡선에 각 샘플에 대한 사이클의 임계 번호를 관련. 마지막으로, cDNA 내부 제어 18에 cDNA 대상의 상대적 농도를 관련된하여 대상 유전자의 표현 수준을.

4. Immunohistochemical 착색

  1. 정착
    1. PBS의 눈을 (; 산도 7.4 인산 식염 버퍼링) 해부.
    2. 20 분을위한 얼음처럼 차가워에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 가득 찬 튜브에 눈을 놔. 전날 PFA 4 % 준비합니다. 4시 매장 ° C 사용까지. PFA는 약 1 주일 동안 신선한 것입니다.
    3. micropipette으로 PFA를 제거합니다. 그런 다음 20 분을위한 얼음 차가운 PBS로 씻어.
    4. ° C 밤 동안 4에서 자당 30 %가 눈을 놔.
    5. 최적의 절삭 온도 (OCT) 매체로 가득 찬 컵에 눈을 넣어 (조직- 테크). sectioning에 적합한 위치에 눈을 놔.
    6. 드라이 아이스를 통해 월 중간에 멈춰 봐.
    7. -70에서 저장 ° C 사용까지.
  2. Sectioning
    1. 해당 비행기에 cryo-sectioning에 눈을 배치합니다.
    2. 각 렌즈의 중앙 부분에서 세 5 μm 두께의 중간 시상 부분을 잘라 버릴거야. 다른 섹션에 동일한 핵을 얼룩 방지하기 위해 연속 섹션 사이에 최소 6 절을 폐기하십시오.
    3. 섹션 절단되면 부드럽게 상단에 슬라이드를 놓습니다. 섹션은 다음 슬라이드에 충실해야합니다.
    4. 사용하기 전에 공기 건조에 슬라이드를 둡니다. 필요 할 때까지 슬라이드는 -20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
  3. 형광 immunohistochemistry
    1. 샘플 실온 (5-10 분)을 달성 보자.
    2. PAP-펜 (Invitrogen)를 표본 주위에 가장자리를 그립니다.
    3. 잠시 (10 분)에 테두리가 건조 보자.
    4. 현미경 슬라이드를 붙입니다.
    5. 1 Rehydrate × P를15 분을위한 BS.
    6. 30 분에 표준 블록 솔루션 Permeabilize.
    7. 표준 블록 솔루션에 1:3,000를 희석 (세포 Signalling 기술, Inc의 토끼 polyclonal, 흘리고 caspase-3 항체 Asp175 966​​1)가 기본 항체를 추가합니다.
    8. 밤 동안 4 ° C에서 humidified 챔버에 저장합니다.
    9. (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (> 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오.
    10. 표준 블록 솔루션에 1:300을 희석 보조 항체를 (특정 흡수 / 방출 스펙트럼과 안티 토끼 차 항체)를 추가합니다.
    11. (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (> 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오.
    12. PAP-펜 얼룩을 닦아.
    13. 3 시간 동안 실온에서 humidified 챔버에 저장합니다. 빛에 노출을 피하십시오.
    14. Vectashield 한 방울을 추가하고 슬라이드 커버 슬립을 배치합니다. 거품을 피하십시오.
    15. Vectashield 굳어를 (~ 20 분) 보자.
    16. 섹션 바로 내가 보관분석까지 어둠 습니.
    17. 모든 제어 섹션은 기본 항체의 부재로 처리됩니다.
    18. 형광 현미경으로 몇 시간 안에 결과를보세요.
    19. 한쪽 핵 활에서 각 렌즈의 반대편 핵 활에 상피 세포 '핵을 계산합니다. 파란색의 모든 렌즈 상피 핵 녹색의 caspase-3 긍정적 핵을 보려면 차 항체의 방출에 맞는 표준 필터를 확인하기 위해 표준 청색 필터를 적용 할 수 있습니다.
    20. 모든 렌즈 상피 핵 및 긍정적 인 핵의 수를 기록합니다. 각 섹션에 대한 세포 세 번 계산합니다.

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Representative Results

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측정의 유사 콘텐츠의 다양한 소스는 분산 분석과 예상되었고 그것은 동물 당 3 측정을 고려하면 측정을위한 분산 동물에 대해 해당의 15 %의 순서에 있던 것을 발견했습니다. 따라서, 전체 렌즈 분석을 고려, 그것은 정밀도를 향상 할 수 없습니다. 직교 테스트 120 시간의 대기 시간 대 짧은 지연 시간 간격 사이의 caspase-3 메시지 통계적으로 의미있는 대조를 elucidated.

생체 UVR 노출에서 caspase-3 표현이 유도한다.

그림 1
그림 1. 자외선 방사선에 노출의 흐름을 도식.

그림 2
그림 2.의 진화 caspase-300 nm의 1 kJ / m 2 UVR에 생체 노출의 후 결정 렌즈 3 (casp3) mRNA의 표현. 오류 바 노출 렌즈와 contralateral 노출되지 렌즈 사이 casp3 mRNA/18s rRNA의 평균 비율에 대한 95 % 신뢰 구간입니다. 수단, 위, 아래 1, 상대의 검은 선. 단위가 각각 대표까지와 casp3 유전자의 다운 규제.

그림 3
그림 3. 노출 렌즈, 노출 후와 (B)가 아닌 노출 렌즈를 24 시간에서 Caspase-3 식 (A). 화살표가 표시된 셀을 표시합니다.

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Discussion

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본 논문은 UVR-B 유발 백내장 동안 발생하는 분자 이벤트를 공부하고 사용 방법을 설명합니다.

생체 UVR 유도 백내장에서 사용할 수 대부분의 정보는 흰둥이 Sprague-Dawley 쥐 7, 16, 17, 18, ​​19에서 실험에서 파생 된 것으로, 고려, 우리는 현재의 연구에 흰둥이 Sprague-Dawley 쥐를 사용하기로 결정했습니다. 쥐의 나이 여섯 일주일 정도했습니다. 남성과 대조적으로, 여성은 덜 알레르기 소변을 가지고 있기 때문에 성별이 여성으로 선정되었습니다. 또한, UVR 유도 백내장 20 정도에 따른 성별에 차이가 없습니다.

모든 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 보관 및 취급되었다. 윤리 권한은 웁살라 동물 실험 윤리위원회, 프로토콜 번호 C 10분의 29로부터 얻은 것입니다. 쥐가 상업 증식 (Taconic, 덴마크)에서 얻을 수 있습니다.

십t "> A 협 대역 UVR 소스가 spectrally 잘 정의 할 UVR 수 있도록 선정되었습니다. UVR-B에 쥐 렌즈의 최대 감도는 약 300 nm의 것입니다. 복용 1 kJ / m 2 임계 복용 아래로 선정되었습니다 15. 15 분의 노출 시간은 렌즈 21 최대 손상을 유도하기 위해 선정되었다. UVR-B에 노출 및 사후 노출 시간의 투여 량을 실험 디자인에 따라 다를 수 있습니다.

페어링 오르간 눈이 연구에서 동물의 사용 통계 및 윤리 측면에서의 장점이 있습니다. 눈의 일방적 노출 노출 한 동물의 관리와 같은 다른면이 따라서는 unpaired 장기에 비해 절반으로 동물의 수를 줄여으로 한쪽을 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 우리는 동물 고정하는 방법으로 마취를 사용했습니다. 그러나, 다른 대안은 우리가 우리 연구실에서 설계 쥐 restrainer 13, unanaesthetized 동물의 고정에 사용하실 수 있습니다. RATS 전에 UV 노출 쥐 restrainer에 에어컨이해야합니다. 마취는 약의 부작용으로 인해 권장하지 않습니다 때 장치는 잘 제어 반복 노출 할 수 있습니다. 여기, 우리는 anesthetized 동물 위치 및 지주 장치로 쥐 restrainer를 사용했습니다.

쥐 restrainer는 나무로 만들어 우리의 실험실에서 여러 항목에서 사용할 수 있습니다. 각 동물이 거기에 위치하기 전에 우리는 우리의 구속 장치를 청소하십시오. 나무 블록, guttering과 나무 보호소는 쥐 케이지의 농축으로 사용됩니다. 이러한 강화는 유럽 연구소 동물 과학 협회 웁살라 동물 실험 윤리위원회와 연맹 (FELASA)에 의해 승인을받은 것입니다.

렌즈는 시간의 짧은 기간 (5-10 분)에 BSS에 해부한다. 이 제한은 렌즈가 명확하고 투명하게 유지 할 수 있습니다.

qRT-PCR

RA1 용해 버퍼에 렌즈를 보호하기위한 30 분의 시간은 실내입니다ough는 수정체 낭, 피질를 중단합니다. 렌즈 핵은 30 분 내에 하드 남아 있습니다. 렌즈 핵, 또는 세포 기관이없는 지역은 렌즈의 전사 비 활성화 일부로 간주됩니다. 따라서 핵은 신호 / 노이즈 mRNA 표현 비율을 증가시키기 위해 샘플에서 제거됩니다.

RNA의 순도 (DNA의 부재) 제어에 사용되는 DNA 특정 프라이머는 p53의 - 프라이머로 임의로 선택되었습니다. 특정 동물 게놈의 DNA의 일반적으로 발생하는 코드 시퀀스는 선택 될 수 있습니다. 두 렌즈는 사후 노출 간격마다 각 렌즈 10 동물 PCR로 분석되었다 caspase-3 RNA 내용은 세 독립적 인 측정에서 산출 된 것입니다.

RT-PCR 관심의 mRNA를 측정 할 수 있습니다. 역 transcriptase는 PCR에 의해 증폭되어 보완 DNA로 mRNA를 변환합니다. 측정 INT의 cDNA의 증폭 순차적으로 희석 샘플에 의해 얻은 표준 곡선을 사용하여 정량화 된erest. 표준 곡선을 적용의 장점은 표준 곡선은 농도의 불확실성을 계산 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공하고, 표준 곡선의 관심 mRNA의 양적 측정을 제공합니다. 또는 관심 mRNA의 상대적 내용은 직접 표준화 된 형광 신호, CT-방법을 얻기 위해 필요한 사이클의 수를 비교하여 추정 할 수있다. 보정 곡선의 주요 단점은 CT 방법보다 더 게놈 제품의 사용을 필요로한다는 것입니다.

Immunohistochemical 착색

Immunohistochemistry는 렌즈 상피 세포의 활성 caspase-3의 공간적 분포를 연구하는 데 사용되었습니다.

눈이 -70 즉시 냉동 중이 ° C 모두 지속적으로 생화학을 중지 할 수 있습니다. 눈을 보호에 대해 동일한 온도에서 저장되었습니다.

Immunohistochemistry은 두 개의 일반 프로에 연결되어 있습니다blems, 차 항체 및 항체의 비 특정 바인딩의 특이성. 항체 따라서 특이성을 보장, 잘 제어 된 소스에서 획득해야합니다. 가능하다면, 에피토프를 포함하는 조직은 긍정적 인 제어로 물들 일 것입니다. 가능하면 비 특정 얼룩을 outrule하기 위해 에피토프는 특정 항체, 음성 제어 얼룩 전에 차단해야합니다. 또한, 비 특​​정 얼룩은 최적의 항체 농도 및 반응 시간을 설정하여 최소화 할 수 있습니다. UVR과 UVR에 노출되지 조직에 노출 두 조직을 얼룩, 여기 caspase-3 UVR 유도 에피토프를 구축 할 수 있습니다. caspapse-3 신호를 표현 세포의 계산을 용이하게하기 위해 형광 현미경 이미지가 디지털로 기록되었습니다. 배경 소음의 변화를 최소화하기 위해, 우리는 현미경 사진에 대한 고정 설정을 사용했습니다.

배경 형광으로 신호의 강도는 공동의 차이ntinuous 규모. 따라서, 중요한 착색에 대한 임계 값을 설정해야합니다. 그러나, 평균 형광은 어려운 중대한 착색에 대한 절대 임계 값을 사용 할 수있게 관찰 섹션에 spatially 다를 수 있습니다. 따라서, 보통 특정 착색의 판단은 경험이 관찰자에 의존하고 구체적으로 착색의 절대 결과는 숙련 된 관찰자의 의견에 따라하지만 관찰자에 대한 일관 될 것입니다. 이러한 이유로, 하나의 경험이 관찰자가 사용되었습니다. UVR에 실험 변수, 노출로 인한 신호를 향상 시키려면, 소음에 비해, 각 섹션의 사진은 세 번 계산되었다.

가능하면 immunohistochemistry 따라서 예상 분자 크기 epitopes의 존재를 확인 서부 얼룩으로 확인해야합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

S 엉터리 Drottning Viktorias Frimurarstiftelse :이 작품은 Karolinska Institutet 아이에게 자금, 스웨덴어 방사선 보호 기관, Karolinska Institutet 안구 연구 재단, 총 엉터리 Bertil Stohnes Stiftelse, 세인트 에릭의 눈 병원 연구 재단, Ögonfonden, Konung 구스타프 V에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Ketalar Pfizer 150086 50 mg/ml
Rompun Bayer 022545 20 mg/ml
Oculentum Simplex Apoteket, Sweden 336164 5 g
Mydriacyl Alcon 00352 10 mg/ml
Balanced salt solution Alcon 0007950055
3.5 ul β-mercaptoethanol
NucleoSpin RNA II total RNA isolation kit Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany 740955.50
p53 DNA specific primers biomers.net GmbH Custom made
Taq DNA polymerase, dNTPack Roche 04 728 866 001
Agarose Sigma A5093
Ethidium bromide solution 0.5 mg/ml Sigma E1385
Nano-Drop ND-1000 spectrophotometer NanoDrop Products
1st Strand cDNA synthesis kit for RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR detection system Bio-Rad Laboratories
96-well plate Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Assay for caspase 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Assay for 18s Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ software Bio-Rad Laboratories
Cleaved caspase-3 (Asp175) Cell signaling technology 9661
Anti rabbit IgG Abcam Ab6798
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Universal Microscope Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 441244
TBE buffer 10x Promega V4251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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의 분자 메커니즘의 특성<em&gt; 생체에</em&gt; UVR 유도 백내장
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Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).More

Galichanin, K., Talebizadeh, N., Söderberg, P. Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract. J. Vis. Exp. (69), e4016, doi:10.3791/4016 (2012).

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