Grundlæggende Published: June 10, 2012 doi: 10.3791/4019

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Montserrat Porta-de-la-Riva^1,2, Laura Fontrodona¹, Alberto Villanueva^1,2, Julián Cerón^1,2

¹Department of Cancer and Human Molecular Genetics, Bellvitge Institute for Biomedical Research, ²C. elegans Core Facility, Bellvitge Institute for Biomedical Research

Summary

Den lethed at bevare og udbrede nematode

Abstract

Forskning i molekylær-og udviklingsmæssige biologi nematode Caenorhabditis elegans blev påbegyndt i begyndelsen af halvfjerdserne af Sydney Brenner, og det er siden blevet brugt i udstrakt grad som en model organisme ^1. C. elegans besidder vigtige egenskaber, såsom enkelhed, gennemsigtighed og kort livscyklus, der har gjort det til et egnet eksperimentelle system til grundlæggende biologiske undersøgelser i mange år ^2. Fund i denne nematode have bred betydning, fordi mange cellulære og molekylære processer, der styrer dyret udvikling er evolutionære bevarede ^3.

C. elegans livscyklus går gennem en fosterstadiet og fire larvestadier, før dyrene når voksenalderen. Udviklingen kan tage fra 2 til 4 dage, afhængigt af temperaturen. I hvert af trinnene flere karakteristiske træk kan observeres. Den viden om sin fuldstændige celleafstamning ^4,5 sammen med den dybe annotation af sit genom gøre denne nematode til en stor model i så forskellige områder som neurobiologi ^6, aldring ^7,8, stamcellebiologi ⁹ og kønscellerne biologi ^10.

En yderligere funktion, der gør C. elegans en attraktiv model til at arbejde med, er muligheden for at opnå populationer af orme synkroniseret på et bestemt trin i en forholdsvis let protokol. Den lette vedligeholdelse og udbrede denne nematode tilsat til muligheden for synkroniseringen et virkningsfuldt værktøj til at opnå store mængder af orme, der kan anvendes til en lang række af små eller high-throughput eksperimenter såsom RNAi skærme, microarrays, massiv sekventering, immunblot eller in situ hybridisering, blandt andre.

På grund af sin åbenhed, C. elegans strukturer kan skelnes under mikroskop ved anvendelse af differentiel interferenskontrast-mikroskopi, også kendt som Nomarski MICROSkopiere. Anvendelsen af ​​et fluorescerende DNA bindemiddel, DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindol), for eksempel, kan føre til specifik identifikation og lokalisering af individuelle celler, såvel som subcellulære strukturer og mangler forbundet med dem.

Protocol

1. Protokol A: Dyrkning af Worms til blegning ¹¹

Store populationer af C. elegans kan opnås ved dyrkning deraf i enten flydende medier eller på faste medier i pladerne. De er sædvanligvis dyrket på fast NGM (nematodevækst medier) og fodret med E. coli-bakterier, der tilsættes til pladerne enten levende eller døde (dræbt ved UV ^12, ved hjælp af varme ¹³ eller kold ^14). Den mest almindelige procedure bruger levende OP50 E. coli, der er defekt i syntese af uracil og kan ikke overvokse i et tykt lag, der ville sløre orme.

1. Blandes 3 g NaCl, 17 g agar og 2,5 g pepton og tilsættes 975 ml _H2O Autoklav i 50 min.
2. Kolben afkøles til 55 ° C.
3. Tilsæt 1 ml 1 M _CaCl2, 1 ml 5 mg / ml cholesterol i ethanol, 1 ml 1 M _MgSO4 og 25 ml 1 M KPO ₄ buffer (alle af dem, men cholesterol tidligere autoclaved).
4. Brug sterile procedurer uddele NGM opløsningen i petriskåle; fylde plader op til 2/3 af deres volumen.
5. Når tørre, er det tilrådeligt at efterlade plader ved stuetemperatur i 2-3 dage før brug til detektering af kontaminanter. Forbered en stribe af OP50 E. coli fra et glycerol lager (OP50 kan fås fra Caenorhabditis Genetics Center).
6. Vælge en enkelt koloni og dyrke den i LB natten over ved 37 ° C under omrøring.
7. Tillade overskud af fugt fordamper fra pladerne ved at fjerne låget i den laminare strømning og tilføje OP50 til midten af ​​pladerne med en steril Pasteur-pipette.
8. Tillade OP50 E. coli plæne at vokse natten over ved stuetemperatur eller ved 37 ° C i 8 timer.
9. Tilsættes den ønskede mængde af orme til pladerne (hvis inkuberet ved 37 ° C plader bør afkøles ved stuetemperatur før brug).

TIPS:

• Udhældningen af ​​den samme mængde af medieri plader med en pipette eller en pumpedispenser sikrer samme volumen agar til pladerne, og letter forskydningen af ​​pladen uden behov for at koncentrere stereomikroskop.
• Plader (både podet og upodet med bakterier) kan anvendes adskillige uger efter fremstillet ved opbevaring i en beholder ved stuetemperatur eller 4 ° C.
• Undgå udpladning af bakterierne til kanten af ​​pladen. Hvis plænen strækker sig til kanterne af pladen ormene kan kravle op siderne, tørre ud og dø.
• Worms lever længere, hvis bakterierne podet på pladerne er allerede døde ^15.

2. Protokol B: behandling med alkalisk hypochloritopløsning ("Bleaching") ¹¹

Blegningen teknik anvendes til synkronisering C. elegans kulturer på det første larvestadiet (L1). Princippet i fremgangsmåden ligger i den kendsgerning, at ormene er følsomme over for blegemiddel medens æggeskallen beskytter embryos fra det. Efter behandling med alkalisk hypochloritopløsning er embryoner inkuberes i flydende medier uden mad, som giver klækning, men forebygger yderligere udvikling.

1. Tillader orme at vokse, indtil voksne stadium.
2. Recover gravide voksne i 15 ml rør ved at vaske pladerne med M9 buffer.
3. Pellets orme ved centrifugering i 2 minutter ved 400 x g (~ 1500 rpm i en standard bordcentrifuge) ved stue-temperatur og kassér supernatanten.
4. Udføre 1-3 vaskninger, indtil bufferen vises tydeligt af bakterier.
5. Tilføje ønskede blegningsopløsningen (tabel I) og omrør i flere minutter (ødelæggelse af voksent væv bør overvåges under dissektionsmikroskop, og reaktionen standses, når spor af voksne er stadig synlig, hvilket typisk tager mellem 3 og 9 minutter, afhængigt af adskillige spørgsmål, såsom mængden af ormen pellet, der er nævnt i diskussionen) (Fig. 3).
6. Stop reaktionen ved tilsætning af M9 Buffer at fylde røret.
7. Hurtigt centrifuge (eftersom behandling stadig kan være aktiv) i 1 minut ved 400 x g og kassér supernatanten.
8. Vaskes pellet tre gange ved at fylde røret med M9-puffer.
9. Tilsæt 1 ml M9-puffer til pelleten, og placere æggene upodet NGM plader og inkuberes ved den ønskede temperatur under forsigtig omrøring. Korrekt beluftning bør gives (fig. 4).

TIPS:

• Der er forskellige Udblegningsopløsningerne, skal du vælge en, der virker bedre i dine hænder (tabel 1, fig. 1).
• Æg, der allerede er på pladerne kan udvindes ved ophugning overfladen af ​​agar med et blødt materiale, såsom et stykke af en røntgenfilm.
• Alt for mange rester af voksne dyr kan forringe synkroniseringen som de udgør en fødevareforsyning til den nyligt udklækkede larver.
• Højere temperaturer lidt fremskynde den udvikling, som er ubelejligt jegf en snekke springer synkronisering, da forskellen i udvikling mellem synkroniserede og synkroniserede orme vil være større ved højere temperaturer.
• Blegningsopløsningen skal udføres umiddelbart før dens anvendelse. Hertil kommer, mister blege styrke efter det har været åbent et stykke tid, dels på grund af sin lysfølsomhed. Vi foreslår at prøve hver ny flaske i små gule flasker for at forhindre et sådant tab og minimere udsættelse for lys.

3. Protokol C: Worm Plating

1. Vent mellem 12 og 24 timer (tid til at fuldføre embryonisk udvikling afhænger af temperaturen) efter blegning blev udført, og genvinde orme ved centrifugering (2 minutter ved 400 x g).
2. Bortkast supernatanten og frø orme om de nødvendige pladerne og lad resterende væske tørre.
3. Placer plader ved den krævede temperatur.

TIPS:

• L1 larver i M9-puffer kan holdes ved 15 ° C vipning mindst en uge without åbenlyse ændringer.
• være forsigtig, når beregning af orme, du vil skabe grobund for, fordi alt for mange kan udmatte maden hurtigere end forventet, og ødelægge dit eksperiment. Ca. 500 L1 kan nå voksenalderen i en 55 mm plade uden at løbe tør for mad.

4. Protokol D: C. elegans Observation

D.1 Nomarski observation

Differentiel interferens kontrast mikroskopi er en optisk mikroskopi belysning teknik anvendes til at forøge kontrasten i ufarvede transparente prøver. Ordet Nomarski refererer til den anvendte prisme, opkaldt efter sin opfinder. Ved at observere dyrenes levende vi er i stand til at undersøge fysiologi af dyret med de eneste ændringer afledt immobilisering. Hertil kommer, da der ikke fiksativ tilsættes, kan fluorescerende markører iagttages in vivo. Dette faktum, og muligheden for at fusionere fluorescerende markører til et gen af ​​interesse gør det muligt at følge processer wVILKEN proteinet af undersøgelsen kan være involveret. Ved hjælp af teknikken beskrevet i denne protokol, kan ikke kun levende orm overholdes, men de kan også genvindes og belagt igen.

Agar pad forberedelse (lige før brug):

1. Forberede agarose 2% i vand og smelter. Holde smeltede ved 65 ° C.
2. Placer to dias med et stykke tape på dem på begge sider af et tredje, rent objektglas.
3. Med en Pasteur-pipette sted en dråbe af agar på den rene overflade.
4. Dække agar med et andet rent objektglas anbragt oven på de tre sider vinkelret.
5. Tryk forsigtigt så agaren dråbe fladtrykt til tykkelsen af ​​de båndformede afstandsstykker.
6. Når agaren størkner, træk forsigtigt ud tapet dias og adskille de to resterende dias ved at skubbe en i forhold til den anden.

Montering levende dyr

7. Placer en dråbe (10 pl) af levamisol 1mM eller natriumazid 10-30 mM på tHan midten af ​​puden.
8. Overfør dyr i drop ved hjælp af en orm pick.
9. Anbring forsigtigt et dækglas over dyrene og ordne det på begge sider med nogle neglelak eller silikone.

TIPS:

• Holde alikvoter af agarose 2% ved 4 ° C.
• Smeltet agarose kan holdes ved 65 ° C i mindst en dag.
• Bemærk: Levamisol er en nikotinreceptoragonist som fremkalder spastisk muskelparalyse ^16.
• Vær forsigtig, natriumazid er ekstremt giftigt!

D.2 Ethanol fiksering og DAPI farvning

Protokollen beskrevet her repræsenterer en hurtig måde farvning orme med DAPI, men på grund af dissecation af ormen nogle strukturer kan udgøre nogen ændring. Der er flere andre metoder til at fastsætte orme tidligere til DAPI-farvning som fiksering med Carnoys løsning, eller formaldehyd, at bevare bedre integriteten af ormen ¹⁷.

Ethanol fiksering (modificeret fra ¹⁸⁾

1. Sted ~ 10 ul M9-puffer (eller vand) på et mikroskopobjektglas.
2. Ved hjælp af en orm pick omhyggeligt overføre 10-25 orme til drop.
3. Brug filtrerpapir eller et mikro-pipette fjerne så meget M9 buffer som muligt uden at fjerne orme eller lade dem tørre.
4. Tilsæt ~ 10 ul 90% ethanol og lad det tørre.
5. Gentag trin 4 gang eller to.

4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning

6. Blandes DAPI med de ønskede montering mediet til en slutkoncentration på 2 ng / ul.
7. Når ethanol er afdampet fuldstændigt, tilsættes 7 ul af DAPI: monteringsmedium blanding.
8. Anbring et dækglas og ordne det på begge sider med nogle neglelak eller silikone. Objektglassene vil være klar til observation cirka 5 minutter efter tilsætning af DAPI.

TIPS:

• Montering withIA indeholder glycerol, så en lille mængde er tilstrækkelig til at dække hele præparatet.
• Der findes en bred vifte af kommercielle montering medier (Fluoromount eller forlænge, ​​for eksempel), deres kvalitet og pris afhænger af, hvor længe du ønsker at gemme din prøve.
• Vær forsigtig, DAPI er et kendt mutagen, der binder stærkt til AT-rige regioner i DNA.

Opskrifter

Nematode vækstmedium (NGM)

1,7% (w / v) agar
50 mM NaCl
0,25% (vægt / volumen) pepton
1 mM _CaCl2
5 ug / ml kolesterol
25 mM KPO ₄
1 mM _MgSO4

M9 buffer

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM _{Na2 HPO4}
86 mM NaCl
1 mM _MgSO4

Udblegningsopløsningerne testet

	opskrift # 1	opskrift # 2	opskrift # 3	opskrift # 4	opskrift # 5
vand (ml)	2,75	3,5	0,5	0,5	1,5
natriumhydroxid (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5 M)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
natriumhypochlorit på ~ 4% (ml)	1	1	1	2	1
alt (ml)	5	5	4	5	5

Tabel I. Forskellige blegningsopløsningen opskrifter testet for denne artikel. Opskrifter # 3 og # 4 er 2x, og bør tilsættes til det samme volumen M9. Opskrifter til # 1, # 2 og # 5 er tidligere blevet rapporteret ^{2, 11, 19.} Endelige koncentrationer: # 1 NaOH 0,25, NaOCl på ~ 0,8% , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Repræsentative resultater

Figur 1. Sammenligning af fem forskellige Udblegningsopløsningerne ved to forskellige inkubationstider. N2 orme vasket to gange med M9 blev opdelt i fem 15 ml koniske rør indeholdende hver blegende opløsning. Rørene blev rystet kraftigt, og 1 ml overført til et nyt rør med M9 at standse reaktionen efter det angivne tidsrum. Efter blegning procedure orme blev inkuberet med 1 ml M9 ved 20 ° C i 24 timer. I hvert tilfælde blev nederste billede taget lige efter blegning, øverste billede 24 timer senere.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Temperaturen af blegningsopløsningen påvirker effektiviteten af behandlingen. Lige volumener af N2 orme blev bleget med den samme blegningsopløsningen enten tidligere afkølet på is i 20 minutter eller holdt ved 25 ° C i det samme tidsrum. De to kolonner til venstre viser billederne lige efter blegning. Efterbehandling orme blev inkuberet i 15 ml koniske rør med 1 ml M9 ved 20 ° C i 24 timer. Kolonner på højre displaybilleder 24 timer senere.

Figur 3. Forholdet orm pellet: tid alkalisk hypochlorit inkubation påvirker effektiviteten af behandlingen 50, 100, 250 og 500 gl snekke pellet blev inkuberet med 2 ml af blegningsopløsningen # 3 til 3, 6 og 9 minutter.. Skraverede L1, døde fostre og resterne af voksne fragmenter blev kvantificeret efter inkubation ved 20 ° C i 2 4 timer i 15 ml koniske rør med 1 ml M9-puffer. Ca. tre sammenflydende 55 mm plader med voksne orme er nødvendige for at få en 100 gl orm pellet.

Figur 4. Korrekt beluftning er nødvendig for klækning og overlevelse af C. elegans embryoer En 100 ul pellet af N2 orme blev bleget i 6 minutter og inkuberet i 15 ml koniske rør med 1, 5 eller 10 ml, som specificeret af M9 ved 20 ° C i 24 timer. Den øvre del af figuren viser billeder af kulturerne efter 24 timer, hvor pilene angiver æg, som ikke udklækkes. Ved bunden er der en graf, der afbilder mængden af ​​larver (lysegrå) og døde embryoer (mørkegrå) 48 timer efter blegning ved de angivne betingelser.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Livscyklus af C. elegans. en. Omtrentlige længde af ormene på forskellige stadier. Timer der kræves for at nå hver fase afhængigt af temperaturen (modificeret fra ^20). B. Nomarski (op) og DAPI (ned) billeder af forskellige orme på de angivne udviklingsstadier. Mest betydningsfulde features i hver fase er forstørret L1: Pilen viser forløbere for det somatiske gonade og kønscellerne Tidlig L4: sort pil (Nomarski) angiver at udvikle vulva, hvide pile (DAPI) angiver de to gonadale arme Mid-... sent L4: Pilen viser udviklingslandene vulva på det såkaldte juletræ etape Unge Voksne:. sort pil angiver et foster inde i livmoderen, pilehovedformede peger på spermatheca, hvide pil indikerer en oocyt Gravid voksen:. Arrowhead (DAPI) påpeger befrugtede æg. Arrow i DAPI billede viser spermatheca.

Figur 6. Vulva morfologi ved L3, L4 og voksne stadier. Ved L3 fase kun en lille lumen, hvor vulva dannes, kan iagttages. På L4, udvider dette hulrum danner den såkaldte "juletræ". I den voksne vulva er allerede lukket. Gule linjer angiver placeringen af ​​vulva på disse tre faser.

Figur 7. DAPI farvning på L3, tidlig L4, sene L4 og voksne stadier. På L3 er kønscellerne langstrakt. På L4, arme gonade nuværende U-form morfologi. Ved sene-L4 fase sperm kan observeres i den distale del af gonade. Unge voksne præsenterer oocytter. The Adult kimcellelinje præsenterer oocyter og embryoner. Gule linjer afgrænser kimlinjer på the forskellige anførte stadier.

Figur 8. C. elegans udvikling på 15 og 25 ° C. N2 orme blev bleget, inkuberet natten over i M9 og omrøring ved 15 ° C, overført til plader og dyrket de angivne tidspunkter ved de angivne temperaturer.

Discussion

Nematode Synkronisering

Adskillige blegende opløsninger er blevet beskrevet. Vi prøvede fem forskellige opskrifter (tabel I), og i vores hænder, har de ikke udviser betydelige forskelle i synkroniseringen af snekkegear populationer (fig. 1). Imidlertid vore eksperimenter viste, at parametre, såsom temperatur (fig. 2), idet forholdet blegningsopløsningen: volumen orme (fig. 3), og mængden af M9 som embryonerne inkuberes udrugning (fig. 4) gør påvirke overlevelsen af ​​ormene, er relateret til korrekt beluftning af kulturen. I vores ryster betingelser, mens et rør 15 ml et volumen på 1 ml tillader overlevelse af alle orme et volumen på 5 ml allerede er for meget til at tillade korrekt ægklækning og sammenlignes med det maksimale volumen af ​​15 ml (ikke vist) .

C. elegans Development

I løbet af sin udvikling, (fig. 5) forud for voksne stadium. Kimcellelinjen er en god indikator for udviklingsstadium C. elegans. Den letteste træk C. elegans udvikling, som kan observeres under Nomarski-optik er udviklingen af vulva, der begynder at dannes på et tidligt L4 fase. I første omgang kun en lille lumen er observeret, som senere udvides til den såkaldte "juletræ" form, i midten af ​​slutningen af ​​L4. Endelig, ved slutningen af L4 vulva lukker (fig. 6). På den anden side giver DAPI farvning observation af udviklingen af ​​gonade. Fra de fire celler i L1 til delende celler og forlængede gonade i L2 og L3. Ved L3 den distale spids cellerne kan observeres, begynder at migrere dorsalt. Meiose starter også ved udgangen af ​​L3. På L4 distale spids celler når deres endelige stillingtagen og kønsceller differentierer til sædceller. Ved udgangen af ​​L4 sædproduktion ender og oocyt produktionen starter. I adult orme embryoer kan observeres i livmoderen (fig. 7).

Udvikling og Temperatur

C. elegans udvikler sig i en anden sats afhængig af temperaturen: mens det tager omkring 90 timer fra det øjeblik ægget er lagt, indtil den nye orm begynder at lægge sine egne æg ved 15 ° C, 45 timer er nok, når dyrket ved 25 ° C (fig. 6). Undersøgelsen af ​​forskellen udvikle hastighed forskellige temperaturer fører til relativ fleksibilitet i oprettelsen forhold og udføre eksperimenter. Derudover er det giver mulighed for ikke kun at overvåge virkningerne af en særlig behandling eller ændring (fx temperaturfølsomme alleler), men også at skabe de bedste betingelser, som udfører en bestemt eksperiment.