Summary
我们描述的T细胞生长因子在体外扩增抗原特异性大鼠T淋巴细胞线的准备。
Abstract
抗原特异性T细胞株或文化克隆的维修需要轮抗原诱导激活细胞扩张 1,2阶段分开。白细胞介素2除了在扩张阶段的文化传媒，是必要措施，防止细胞死亡，并足以维持短期的T细胞系，但已被证明能增加Th1细胞极化3。 T细胞生长因子（TCGF），其中包含混合的细胞因子白细胞介素2的更换是更有效地保持长期的T细胞系在体外培养3比白细胞介素2。此外，TCGF可以很容易地在实验室中大量的准备和重组白细胞介素2比便宜得多。
在这里，我们展示如何准备从大鼠脾细胞培养上清TCGF。在此过程中，我们收获脾脏从幼稚刘易斯安乐死大鼠胸腺和血液采集。我们准备从脾单细胞悬液，析渗透压冲击的红血细胞，而种子在培养基中的脾。与非选择性地激活所有大鼠T淋巴细胞，诱导细胞因子的产生，有丝分裂原刀豆蛋白A的细胞受到刺激。文化supernantant收集48小时后andexcess伴刀豆球蛋白A是必然的α甲基mannoside，以防止它激活T细胞，TCGF将增加线路。 TCGF是无菌过滤，分装，储存于-20 ° C
Protocol
- 以Lewis大鼠脾脏（160 - 200G之间的老鼠是最好的）。在培养皿菜含有PBS +抗生素（PBS - PS），使用细胞过滤器Dilacerate冰。放入50毫升管。填写用PBS - PS。
- 自旋为10分钟，在4 ° C至沉淀细胞。
- 清洗细胞两次。
- 悬浮颗粒在NH 4氯0.15米（5毫升每脾）。混合3分钟就冰吸管轻轻地，不断溶解红细胞。填充介质管。
- 自旋为10分钟，在4 ° C至沉淀细胞。
- 清洗细胞两次。
- 细胞计数。大鼠脾给出了200-250万个单元格。
- 种子细胞完全培养基，在每毫升200万：50毫升每75厘米2烧瓶。
- 让我们成长为48小时，在孵化器。
- 旋在4 ° C 15分钟沉淀细胞。
- 收集上清液;丢弃的细胞。
- 添加15毫克/毫升甲基mannoside去上清。调匀。
- 过滤器（0.2毫米）
- 分装并储存于-20 ° C 10天，如果必要，可以保持在4 ° C。
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Discussion
我们准备从Lewis大鼠脾细胞TCGF，因为我们经常从天真这株收获血清和thymi Lewis大鼠T细胞系在体外刺激大鼠安乐死。这TCGF，可以被用来促进从其他的大鼠株T细胞系的生长和生存。 TCGF也可准备从其他菌株的大鼠。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
