En fremgangsmåde til præcist generere og omfattende karakterisering morfologi filamentøs fungus<em> Aspergillus niger</em> Beskrives, som tillader den matematiske korrelation af morfologisk udseende og produktivitet.
Den filamentøse svamp A. niger er et almindeligt anvendte stamme i en lang række industrielle processer fra fødevarer til lægemiddelindustrien. En af de mest interessante og ofte ukontrollerbar karakteristika ved denne filamentøs organisme er en kompleks morfologi. Det spænder fra tætte kugleformede pellets til tyktflydende mycelia (figur 1). Forskellige procesparametre og bestanddele er kendte for at påvirke fungal morfologi 1. Siden optimal produktivitet korrelerer stærkt med en bestemt morfologisk form, svampe morfologi ofte er en flaskehals i produktiviteten i industriel produktion.
En ligetil og elegant fremgangsmåde til præcist at kontrollere morfologiske form er tilsætningen af uorganiske uopløselige mikropartikler (såsom vandholdigt magnesiumsilicat, aluminiumoxid eller titansilicat oxid) til dyrkningsmediet bidrager til forøget enzymproduktion 2-6. Da der er en obvskellige korrelation mellem mikro partikel afhængig morfologi og enzymproduktion det er ønskeligt at matematisk forbinde produktivitet og morfologiske udseende. Derfor er en kvantitativ præcis og holistisk morfologiske beskrivelse er målrettet.
Derfor præsenterer vi en metode til at generere og karakterisere mikro-partikler er afhængige af morfologiske strukturer og til at korrelere svampe morfologi med produktivitet (figur 1), som muligvis bidrager til en bedre forståelse af morfogenese af trådformede mikroorganismer.
Den rekombinante stamme A. niger SKAn1015 dyrkes i 72 timer i en 3 L omrørt tank bioreaktor. Ved tilsætning af talkum mikropartikler i koncentrationer på 1 g / L, 3 g / l og 10 g / L før inokulering forskellige morfologiske strukturer reproducerbart genereres. Sterile udtages prøver efter 24, 48 og 72 timer til bestemmelse af væksten fremskridt og aktiviteten af det producerede enzym. Dendannede produkt er af høj værdi enzym β-fructofuranosidase en vigtig biokatalysator for neo-sukker dannelse i fødevarer eller farmaceutisk industri, der katalyserer bl.a. reaktion af sakkarose til glukose 7-9. Derfor kvantificering af glucose efter tilsætning af saccharose indebærer den producerede mængde β-fructofuranosidasen. Glucose kvantificering fremstilles ved en GOD / POD-assay 10, som er modificeret til high-throughput-analyse i 96-brønds mikro-titer-plader.
Svampe morfologi efter 72 timer undersøges i mikroskop og kendetegnet ved digital billedanalyse. Ved at gøre dette, er partikel form faktorer for svampe makro morfologi som Féret diameter, projiceret areal, omkreds, cirkularitet, aspect ratio, rundhed und soliditet beregnes med open source billedbehandling program ImageJ. Relevante parametre kombineres til et dimensionsløst morfologi antal (Mn) 11, som muliggør en omfattende karakterisering affungal morfologi. Den tætte korrelation mellem morfologi antal og produktivitet er fremhævet af matematisk regression.
Ændringen af svampe morfologi har været af interesse for bioteknologi, da mange årtier. Forskellige undersøgelser har forsøgt at variere udvalgte procesparametre såsom pH-værdi, strømtilførsel, temperatur, medium næringsstoffer eller inokulumkoncentration 1, men lider ikke unøjagtig og ufuldstændig kontrol morfologi, høje energiomkostninger, hæmmende virkning eller produkt ustabilitet, I modsætning hertil tilskud af mikropartikler muliggør en nøjagtig manipulation af fungal morfologi gennem finjusteres variation af partikelstørrelsen og koncentration. Dette åbner nye muligheder for at anvende mikropartikler, til optimering og skræddersyet udformning af højt producerende morfologi i bioteknologisk produktion med A. niger og andre filamentøse mikroorganismer.
Det digitale billede Analysen er en nem reproducerbar metode til at karakterisere svampe makro morfologi. Imidlertid forskellige parametre for størrelse, form og overflade kendetegnetter af morfologiske strukturer beskrevet i litteraturen gør hurtig vurdering af svampe kompliceret morfologi. Det præsenteret Morfologi nummer som en kombination af relevante parametre, undgår denne mangel, og kan bruges ikke kun for omfattende karakterisering af morfologiske strukturer, men også for direkte matematisk sammenhæng med produktiviteten. Denne gang gør en vurdering af produktivitet ved given morfologi og derfor en tilpasning af morfologi for processen skal muligt.
Ved hjælp af morfologi nummeret, er det muligt at skelne mellem forskellige pellet og klump morfologier 4,5. For yderligere udvikling af morfologi antal behandlingen af den fraktale dimension synes at være lovende. En fraktal dimension giver en måling af kompleksiteten og masse fylde egenskaber af et objekt 13 og er derfor prædestineret for en helhedsorienteret karakterisering af mycelie morfologi.
Creation af en højt producerende mycelial morfologi, men kan føre til problemer med fremgangsmåden ydeevne, især i stor skala dyrkning, da mycelievækst form har tidligere vist sig at udvise meget større dyrkningsmedium viskositeter 2. Dette fører til problemer med varme-og masseoverførsel, og dannelsen af stillestående ikke blandede zoner, der kræver en højere indgangseffekt og for dyrkning dyrere at drive en. Derfor er forholdet mellem svampe morfologi og kultur bouillon viskositet bør overvejes, når du ændrer morfologi og indarbejdes i yderligere modeller.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker for finansiel støtte fra den tyske Research Foundation (DFG) gennem fælles forskningscenter SFB 578 "fra gen til produkt" ved Technische Universität Braunschweig, Tyskland.
Table of Equipment:
Equipment | Company | Catalogue Number/model |
autoclave | Systec | V150 |
Büchner funnel (plastic) | VWR | – |
cellulose filter (for biomass dry weight) | Sartorius Stedim Biotech | Filter Discs Grade 389 |
cellulose acetate filter (for air filtration at reactor) | Sartorius stedim biotech | Midisart 200 PTFE |
cellulose acetate filter (for enzyme activity) | Sartorius Stedim Biotech | Midisart NML |
centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5415R |
centrifuge | Heraeus | Biofuge fresco |
centrifuge | Heraeus sepatech | Varifuge 3.0R |
compartment dryer (105 °C) | Heraeus | Kelvitran t |
control unit (temperature) | Jumo | Jumo iTron 08 |
control unit (pH-value) | meredos | pH Control 2 |
desiccator | Duran | Vacuum stable |
Falcon tubes | Omnilab | FALC352070 |
heating block 40 °C | Biometra | TB1 Thermoblock |
heating block 95 °C | HLC | HBT 130 |
micro plate reader | Tecan | Sunrise-Microplate-Reader |
micro scales | Sartorius | CP 225 |
microscope (digital inverted) | AMG | EVOS xl |
micro pipettes and tips (different sizes) | Omnilab | 5283303 5283298 5283299 5283300 |
micro titer plate | Nunc | MaxiSorp |
multi pipette and tips | Eppendorf/ Omnilab | 5283611/ 5283611 |
pH-electrode | Schott | pH-Meter CG840 |
reaction tubes | Roth | E518.1 |
scale | Sartorius | CP 3202 S |
stirred tank bioreactor with equipment | Applikon Biotechnology | 2L Bioreactor set |
syringe | Eppendorf | Combitips Plus 5 mL |
Table of Reagents:
Name of the reagent | Company |
Acetic acid | Roth |
Disodium hydrogen phosphate | Merck |
Ethanol (95%) | Roth |
Glucose monohydrate, (α-D-) | Roth |
Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger) | Sigma |
Hydrochloride acid (37 % w/v) | Fiedel-de Haën |
Hydrous magnesium silicate | Roth |
Monopotassium phosphate | Merck |
o-dianoisidine dihydrochloride | Sigma |
Peroxidase (Typ II from horseradish) | Sigma |
Sodium acetate | Roth |
Sodium hydroxide | Merck |
Sucrose, D-(+) | Fluka |
Water (deionized) | – |
Table of Solutions and Medium Composition:
Solution | Components | Amount |
50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5) | Sodium acetate Bring to volume with deionized water Adjust at pH 6.5 with acetic acid | 4.1 g L-1 |
0.05 M monopotassium phosphate solution | Monopotassium phosphate Bring to volume with deionized water | 6.805 g L-1 |
0.05 M disodium hydrogen phosphate solution | Disodium hydrogen phosphate Bring to volume with deionized water | 7.1 g L-1 |
0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) | 0.05 M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 61.2 mL |
0.05 M phosphate buffer (pH 5.4) | 0.05M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 3 mL |
1.65 M sucrose solution | D-(+)-sucrose Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4) | 564.8 g L-1 |
reagent solution | o-Dianisidin-Dihydrochlorid Ethanol (95%) | 25 mg 10 mL |
Glucose reagent solution | Glucose oxidase Peroxidase Phosphate buffer (pH 7.0) reagent solution | 10.5 mg 3 mg 90 mL 10 mL |