Настройка Aspergillus Нигер Морфология за счет добавления частиц талька Micro

Summary

Метод точно создавать и всесторонне характеризуют морфологию нитчатых грибов<em> Aspergillus Нигер</em> Описано, что позволяет математические соотношения морфологических внешний вид и производительность.

Abstract

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most intriguing and often uncontrollable characteristics of this filamentous organism is its complex morphology. It ranges from dense spherical pellets to viscous mycelia (Figure 1). Various process parameters and ingredients are known to influence fungal morphology ¹. Since optimal productivity correlates strongly with a specific morphological form, the fungal morphology often represents the bottleneck of productivity in industrial production.

A straight forward and elegant approach to precisely control morphological shape is the addition of inorganic insoluble micro particles (like hydrous magnesium silicate, aluminum oxide or titanium silicate oxide) to the culture medium contributing to increased enzyme production ^2-6. Since there is an obvious correlation between micro particle dependent morphology and enzyme production it is desirable to mathematically link productivity and morphological appearance. Therefore a quantitative precise and holistic morphological description is targeted.

Thus, we present a method to generate and characterize micro particle dependent morphological structures and to correlate fungal morphology with productivity (Figure 1) which possibly contributes to a better understanding of the morphogenesis of filamentous microorganisms.

The recombinant strain A. niger SKAn1015 is cultivated for 72 h in a 3 L stirred tank bioreactor. By addition of talc micro particles in concentrations of 1 g/L, 3 g/L and 10 g/L prior to inoculation a variety of morphological structures is reproducibly generated. Sterile samples are taken after 24, 48 and 72 hours for determination of growth progress and activity of the produced enzyme. The formed product is the high-value enzyme β-fructofuranosidase, an important biocatalyst for neo-sugar formation in food or pharmaceutical industry, which catalyzes among others the reaction of sucrose to glucose ^7-9. Therefore, the quantification of glucose after adding sucrose implies the amount of produced β-fructofuranosidase. Glucose quantification is made by a GOD/POD-Assay ¹⁰, which is modified for high-throughput analysis in 96-well micro titer plates.

Fungal morphology after 72 hours is examined by microscope and characterized by digital image analysis. In doing so, particle shape factors for fungal macro morphology like Feret’s diameter, projected area, perimeter, circularity, aspect ratio, roundness und solidity are calculated with the open source image processing program ImageJ. Relevant parameters are combined to a dimensionless Morphology number (Mn) ¹¹, which enables a comprehensive characterization of fungal morphology. The close correlation of the Morphology number and productivity are highlighted by mathematical regression.

Protocol

1. Установка реактора и начала культивирования 4 биореактор культивирования в целом проводятся. Используйте 3 л мешалкой биореактор с рабочим объемом 2,2 л для выращивания А. Нигер SKAn1015. Налейте 72,6 г глюкозы моногидрата в реактор и заполнить его с 1,9 л дистиллированной воды. Установить реакторного оборудования, таких как 3 перегородки, два шести-лопастных турбин диск колеса, рН-электрод, газовый клапан с воздушным фильтром, охлаждение пальцев, кулер отработанного воздуха с воздушным фильтром, погружная трубка для стерильного отбора проб с воздушным фильтром и вход шланги для среды, посевного, кислоты и основания. Автоклава реакторе при температуре 121 ° С в течение 20 мин. Подключите реактор с кислотно-основного резервуара (2 М HCl, 2 M NaOH) и соответствующие насосы и установить рН 5,0 ± 0,05 с блоком управления рН. Ссылка реактор с охлаждением водой систему и положить рубашкой обогревавокруг реактора. Установить датчик температуры с соответствующим блоком управления и настройки температуре 37 ± 0,1 ° С в блок контроля температуры. Установите агитации двигателя на вершине реактора и привести его в действие с агитацией скоростью 200 мин -1. Добавить стерильной минимальный рост среды 11 корыто один из стерильной шланги на входе (250 мл). Для средних подготовки всех компонентов в автоклаве при 121 ° C в течение 20 мин и смешивают вместе. За три культивации компоненты включают в себя талька (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) в концентрации 1 г / л (реактор 2), 3 г / л (реактор 3) и 10 г / л (реактор 4). Перед использованием, вновь приостановить микрочастиц в 50 мМ буферного раствора ацетата натрия (рН 6,5) и добавить его в стерильной среде. В управление культуры (без частиц) заменить микро частиц подвески на 50 мм буферного раствора ацетата натрия (рН 6,5). Добавить суспензии спор (посевного)с подготовленной в Wucherpfennig и др.. др. (2011) 11 корыто один из стерильной шланги на входе (50 мл), так что концентрация спор составляет 1×10 6 мл -1. Прививка знаменует собой начало возделывания (ч = 0 ч). Начать аэрации со скоростью 1,0 л мин -1. 2. Стерильные выборки после 24, 48 и 72 ч культивирования Принимать по 50 мл стерильного бульона культуры в флакон трубку. Использование образцов для определения биомассы сухого веса, β-fructofuranosidase деятельности и микроскопического анализа. 3. Определение биомассы Сухой вес после 24, 48 и 72 ч культивирования Биомасса образцы должны быть приняты по крайней мере, в двух экземплярах. Вес целлюлозы фильтр микро весы после сушки в сушильном шкафу и поставить фильтр в воронку Бюхнера с подключенным водоструйный вакуумный насос. Фильтр определенный объем пробы (например, 10 мл)й промыть фильтр с 10 мл дистиллированной воды, чтобы удалить среду соединений из биомассы. Морщины фильтр один раз в середине, поместите его в стеклянной посуде Петри и положить его в отделение сушилку до постоянство веса (по крайней мере 24 ч). Охладите фильтр в сушильном шкафу и измерять вес. Рассчитать сухой вес биомассы в виде разницы между весом фильтром и без сухой биомассы, деленная на используемый объем образца. 4. Определение внеклеточной ферментативной активности β-fructofuranosidase Богом / POD-эссе после 24, 48 и 72 ч культивирования Храните образцы на льду постоянно во время работы с ними. Фильтра 1,5 мл культуры подвески корыта ацетата целлюлозы фильтр, нажав на культуру подвески с помощью шприца через фильтр в реакционную трубку. Хранить реакционную трубку при температуре -20 ° C до использования. В реакционной смеси используют 20мкл образца и добавить 200 мкл 1,65 М сахарозы, растворенного в 0,05 М фосфатного буфера (рН 5,4), чтобы инициировать реакцию сахарозу на глюкозу. Кэри из реакции по крайней мере, в двух экземплярах. Инкубируйте реакционной смеси при 40 ° C в течение 20 мин в отопительный блок. Остановить реакцию путем инкубации при температуре 95 ° С в течение 10 мин в отопительный блок. Охладить в реакционную смесь, сохраняя его на льду и спином вниз конденсата на центрифуге при 13,000 г в течение 10 мин при 4 ° C. Для учета рН и зависит от температуры расщепление сахарозы на глюкозу, осуществлять пустое значение, используя 20 мкл деионизованной воды вместо 20 мкл образца. Для учета остаточной глюкозы в культуральной жидкости, проводить отрицательного контроля для каждого образца. В связи с этим использование 20 мкл образца и инактивировать β-fructofuranosidase путем нагревания при 95 ° С в течение 10 минут до добавления сахара и инкубировать, как описано в пункте 4.3. Разбавьте образцы такой, что измеренияизмерял адсорбции в калиброванного диапазона значений. Выполняйте все ферментативные тесты в трех экземплярах. Нанести 2 мкл разбавленного образца микроволновая плита титр хорошо. Применить стандартный набор для калибровки микроволновая плита титр каждым использованием 2 мкл из десяти растворов глюкозы с десятью различными концентрациями Ноу (от 1 мм до 15 мм), а 2 мкл образца. Для калибровки нулевой точки использовать 2 мкл деионизованной воды вместо 2 мкл образца. Добавить 200 мкл раствора реагента в каждую лунку с помощью нескольких пипетки. Выдержите смесь в течение 10 мин при комнатной температуре. Хранить микроволновая плита титр при 6 ° С до измерения (несколько часов в большинстве). Измерьте поглощение при 450 нм с использованием 96-и микро Восход планшетов и поиска данных программное обеспечение Magellan. Установите время смешивания до 5 сек. , а остальное время до 1 сек. Откройте результате диаграмма с электронными таблицами и построить калибровочную линию, используя стандартный набор: гlucose концентрация = X + б поглощения Рассчитать деятельности: деятельность = (поглощение X-фактор разведения пустое значение) Х + Ь Выясните, β-fructofuranosidase деятельности путем расчета разницы между деятельностью образца и соответствующий негативный контроль. Рассчитать удельную производительность на следующий использования с учетом биомассы сухого веса и β-fructofuranosidase деятельности 11. 5. Микроскопии и автоматизированного анализа изображений после 72 ч культивирования Место около 3 мл суспензии в культуре пластиковые чашки Петри иразводить их физиологическим раствором хлорида натрия до морфологические структуры разделены. Размещайте Петри под микроскопом, который имеет встроенный или подключенной камеры. Получить и сохранить около 100 изображений (рис. 2) морфологических структур в образце. Обратите внимание, что на каждом изображении, по крайней мере один объект полностью рисунке. Откройте все изображения одного и того же образца с программой обработки изображений ImageJ 12. Преобразование изображения в черно-белое с помощью процесса инструмент "Сделать Binary" (рис. 2). Для применения команды на целый ряд изображений использовать макросы следующим образом. run (,, Марка Binary ") Откройте обработанных бинарных изображений с ImageJ снова. Рассчитать диаметр форму факторов Фере, в предполагаемый район, периметр, округлость, пропорции, округлость унд прочность для каждого изображения с инструментом анализа "Set оценка». Для применения команды в серьезэс изображений использовать макросы следующим образом. run ("8-бит"); run ("Сделай Binary"); run ("Установить масштаб …», «расстояние = X известны = 1000 пиксель = 1 единица = мкм глобальный"); run ("Set измерения …", "предел область отображения периметру формы Фере в перенаправить = Нет десятичной = 3"); run ("Анализ частиц …", "размер = 10000-Infinity округлости = 0.00-1.00 = шоу Контуры дисплей"); Определите X как количество пикселей, которое коррелирует до 1000 мкм с помощью построения прямой линией, пересекающей шкалы. Корреляция количества пикселей в прямой линии с длиной шкалы в мкм. Откройте результате график, содержащий значения форм-фактор для каждого изображения с электронными таблицами. Рассчитать количество морфологии следующее для каждого изображения. Вычислить среднее значение и стандартное отклонение для морфологии число с учетом всех изображений одного образца. </lя> Использование графиков и программы анализа данных для графического соотношение морфологии номер с удельной производительности и определить математическое соотношение математической регрессии. 6. Представитель Результаты Через добавлением талька микрочастиц А. Нигер СКАН 1015 морфология изменяется от истинной морфологии гранул для рассеянных или мицелия морфологии. В то время как гранулы морфологии проявляется при стандартных условиях мицелия морфологии создана добавок среды с 10 г / л частиц талька микро-(рис. 4.). Одновременно активность β-fructofuranosidase увеличивается примерно 3 раза 3-5. Добавок 1 или 3 г / л порошка талька приводит к дисперсной морфологии, с удвоенным fructofuranosidase деятельности (рис. 4.). Микрочастицы зависимость морфологии может быть всесторонне описывается Morphology номер, который можно рассчитать, используя параметры, определяемые автоматического анализа изображений. Идеально круглые и гладкие гранулы в микроскопических изображений выглядят как идеальный кругах. Для таких частиц морфологии количество имеет значение 1. Самый маленький фрагмент мицелия морфологии может быть упрощен, как одномерные линии уступая морфологии число 0. Все промежуточные морфологические формы, как удлиненные гранулы нерегулярной или скопления, таким образом, имеют значения между 0 и 1. Довольно крупные частицы приведет к высокой, грибковые частиц с большой поверхностью или удлиненных частиц, в довольно низком морфологии номер 11. В стандартных условиях морфологии реактора 1 экспонаты морфологии насчитывается около 0,8. Морфология в реакторе 4 с 10 г / л талька имеет около 0,1 Мп. Морфология номер для реакторов 2 и 3, талька концентрации 1 и 3 г / л, лежит между этими двумя крайностями, демонстрируя дисперсной морфология. С микрочастицы зависимость морфологии тесно связано с β-fructofuranosidase производительности, математические соотношения числа Морфология и производительности похожа на рисунке 5 получается. Рисунок 1. Общая схема опытно-конструкторских и аналитических процедур. А. Нигер культивируется (с или без микро-частицы) в 3 л мешалкой биореакторе в течение 72 часов. После того, как 24, 48 и 72 га образец, взятый для определения сухого веса биомассы и β-fructofuranosidase деятельности, которая вновь используется для расчета удельной производительности. Через 48 ч грибковых морфологии рассматриваются под микроскопом и характеризуется цифрового анализа изображений. Соответствующие параметры анализа изображения объединяются в морфология число, которое является математическим коррелирует с удельной производительности. <imgALT = "2" SRC = "/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg" /> Рисунок 2. Этапы обработки изображения для микроскопических изображений, созданных морфологических структур А. Нигер. Шаг 1: получение изображений под микроскопом. Шаг 2: улучшение качества изображения, если это необходимо. Шаг 3: изображение бинаризации, черно-белое (бинарное) изображение, формируемое в ImageJ. Шаг 4: бинарное изображение обрабатывается и нежелательных объектов будут удалены. Шаг 5: морфологический анализ проводится с "Анализ частиц» функции с открытым исходным кодом программы ImageJ. Рисунок 3. Различные морфологические формы А. Нигер зависит от концентрации добавленной микрочастиц. С увеличением концентрации микрочастиц добавили размер гранул может быть точно снизилась до небольшое ядро-оболочка гранул, небольшими стайками и даже свободно рассеянных мицелия. Морфология техники какpergillus Нигер SKAn1015 микро частиц добавок в условиях погружения в культуру. Без микрочастиц (А), 10 мг / л (В), 0,1 г / л (С), 0,2 г / л (D), 0,3 г / л (Е), 0,6 г / л (F), 1,0 г / л (G), 1,5 г / л (H), 2,0 г / л (I), 2,5 г / л (J), 3,0 г / л (К), 3,5 г / л (L), 4,0 г / л (M ), 4,5 г / л (N), 5,0 г / л (О), 10 г / л (Р), 15 г / л (Q), 20 г / л (R), 30 г / л (S) и 40-50 г / л (Т). Изображения были сделаны с помощью световой микроскопии после 72 ч культивирования. Рисунок 4. Fructofuranosidase деятельности в зависимости от талька микрочастицы концентрации 1 г / л (реактор 2), 3 г / л (реактор 3) и 10 г / л (реактор 4). Реактор 1 не дополнить микрочастиц, здесь выращивание проводится при стандартных условиях. Рисунок 5. Представитель хорошую корреляцию (R 2 = 0,91) морфологииКоличество и удельной производительности. Морфология число строится (абсцисс) от удельной производительности (ординат). Нелинейная регрессия дает экспоненциальный корреляции.

Discussion

Изменение морфологии грибов был интерес в области биотехнологии, так как многие десятилетия. Различные исследования пытались изменять выбранные параметры процесса, такие как рН, мощность, температура, средний питательных веществ или посевной концентрации ^1, но страдают от довольно неточным и неполным контролем морфологии, высокие цены на энергоносители, подавление эффекта или продукта нестабильность, в отличие, добавок микрочастиц позволяет точное машиностроение грибковых морфологии через доработать изменения размера частиц и концентрации. Это открывает новые возможности использования микрочастиц для оптимизации и индивидуальный дизайн высокого производству морфологии биотехнологического производства с А. Нигер и других нитчатых микроорганизмов.

Цифрового анализа изображения легко воспроизводимый метод для описания морфологии грибковых макроса. Тем не менее, разнообразие параметров для характеристики размера, формы и поверхноститер морфологических структур, описанных в литературе, позволяет быстро оценить грибковых морфологии сложно. Представленные морфологии количество как совокупность соответствующих параметров, позволяет избежать этого недостатка и может быть использована не только для всестороннюю характеристику морфологических структур, но и для прямой математической корреляции с производительностью. Это снова делает оценку производительности данной морфологии и поэтому настройка морфологии для технологических нужд возможно.

Использование морфологии число, можно различать различные гранулы и скопления морфологии ^4,5. Для дальнейшего развития морфологии число рассмотрение фрактальной размерности представляется перспективным. Фрактальной размерности дает измерение сложности и массового заполнения свойств объекта ¹³ и, следовательно, предопределив для целостной характеристики мицелия морфологии.

Крeation высокой производству мицелия морфологии, однако, может привести к проблемам с производительностью процесса, особенно в больших масштабах выращивания, потому что рост мицелия форме Ранее было показано, проявляют гораздо большую вязкость культуральной жидкости ^2. Это приводит к проблемам с тепло-и массообмена и образование застойных зон, не смешанные, которые требуют более высокую мощность и сделать выращивание более дорогим в эксплуатации ^1. Поэтому взаимосвязь между грибковой морфологии и вязкости культуральной жидкости следует учитывать при изменении морфологии и быть включены в дальнейшие модели.

Materials

Table of Equipment:

Equipment	Company	Catalogue Number/model
autoclave	Systec	V150
Büchner funnel (plastic)	VWR	–
cellulose filter (for biomass dry weight)	Sartorius Stedim Biotech	Filter Discs Grade 389
cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)	Sartorius stedim biotech	Midisart 200 PTFE
cellulose acetate filter (for enzyme activity)	Sartorius Stedim Biotech	Midisart NML
centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5415R
centrifuge	Heraeus	Biofuge fresco
centrifuge	Heraeus sepatech	Varifuge 3.0R
compartment dryer (105 °C)	Heraeus	Kelvitran t
control unit (temperature)	Jumo	Jumo iTron 08
control unit (pH-value)	meredos	pH Control 2
desiccator	Duran	Vacuum stable
Falcon tubes	Omnilab	FALC352070
heating block 40 °C	Biometra	TB1 Thermoblock
heating block 95 °C	HLC	HBT 130
micro plate reader	Tecan	Sunrise-Microplate-Reader
micro scales	Sartorius	CP 225
microscope (digital inverted)	AMG	EVOS xl
micro pipettes and tips (different sizes)	Omnilab	5283303 5283298 5283299 5283300
micro titer plate	Nunc	MaxiSorp
multi pipette and tips	Eppendorf/ Omnilab	5283611/ 5283611
pH-electrode	Schott	pH-Meter CG840
reaction tubes	Roth	E518.1
scale	Sartorius	CP 3202 S
stirred tank bioreactor with equipment	Applikon Biotechnology	2L Bioreactor set
syringe	Eppendorf	Combitips Plus 5 mL

Table of Reagents:

Name of the reagent	Company
Acetic acid	Roth
Disodium hydrogen phosphate	Merck
Ethanol (95%)	Roth
Glucose monohydrate, (α-D-)	Roth
Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)	Sigma
Hydrochloride acid (37 % w/v)	Fiedel-de Haën
Hydrous magnesium silicate	Roth
Monopotassium phosphate	Merck
o-dianoisidine dihydrochloride	Sigma
Peroxidase (Typ II from horseradish)	Sigma
Sodium acetate	Roth
Sodium hydroxide	Merck
Sucrose, D-(+)	Fluka
Water (deionized)	–

Table of Solutions and Medium Composition:

Solution	Components	Amount
50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)	Sodium acetate Bring to volume with deionized water Adjust at pH 6.5 with acetic acid	4.1 g L-1
0.05 M monopotassium phosphate solution	Monopotassium phosphate Bring to volume with deionized water	6.805 g L-1
0.05 M disodium hydrogen phosphate solution	Disodium hydrogen phosphate Bring to volume with deionized water	7.1 g L-1
0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)	0.05 M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution	61.2 mL
0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)	0.05M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution	3 mL
1.65 M sucrose solution	D-(+)-sucrose Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)	564.8 g L-1
reagent solution	o-Dianisidin-Dihydrochlorid Ethanol (95%)	25 mg 10 mL
Glucose reagent solution	Glucose oxidase Peroxidase Phosphate buffer (pH 7.0) reagent solution	10.5 mg 3 mg 90 mL 10 mL