En metod för att exakt generera och att fullständigt karaktärisera morfologi av fintrådiga svamp<em> Aspergillus niger</em> Beskrivs, vilket tillåter den matematiska korrelationen av morfologiska utseendet och produktivitet.
Den filamentösa svampen A. niger är en allmänt använd stam i ett brett spektrum av industriella processer från mat till läkemedelsindustrin. En av de mest spännande och ofta okontrollerbara egenskaperna hos denna fintrådiga organism är dess komplex morfologi. Den sträcker sig från täta sfäriska pellets för viskösa mycel (figur 1). Olika processparametrar och ingredienser är kända för att påverka svamp morfologi 1. Eftersom optimal produktivitet korrelerar starkt med en viss morfologisk form, representerar svamp morfologin ofta flaskhalsen produktiviteten i industriell produktion.
En rakt fram och elegant sätt att exakt kontrollera morfologisk form är tillsatsen av oorganiska olösliga mikropartiklar (t.ex. vattenhaltigt magnesium-silikat, aluminiumoxid eller titan-silikat-oxid) till odlingsmediet som bidrar till ökad enzymproduktion 2-6. Eftersom det finns en obvious samband mellan mikro partikel beroende morfologi och enzymproduktion det är önskvärt att matematiskt länka produktivitet och morfologiska utseende. Därför är en kvantitativ exakt och helhetssyn morfologiska beskrivningen är riktad.
Därför presenterar vi en metod för att generera och karaktärisera mikro partiklar beroende morfologiska strukturer och att korrelera svamp morfologi med produktivitet (figur 1) som möjligen bidrar till en bättre förståelse för morfogenes av trådformiga mikroorganismer.
Den rekombinanta stammen A. niger SKAn1015 odlas i 72 timmar i en 3 L omrörd tank bioreaktor. Genom tillsats av talk mikropartiklar i koncentrationer av 1 g / I, 3 g / L och 10 g / L innan inokulering en mängd av morfologiska strukturer är reproducerbart genereras. Sterila prover tas efter 24, 48 och 72 timmar för bestämning av tillväxt framsteg och aktivitet producerade enzymet. Denbildade produkten är värdefulla enzym β-fruktofuranosidaset, en viktig biokatalysator för neo-socker-bildning i livsmedel eller farmaceutiska industrin, som katalyserar bl reaktionen av sackaros till glukos 7-9. Därför medför kvantifiering av glukos efter tillsats av sackaros mängden producerad β-fruktofuranosidaset. Glukos kvantifiering görs genom ett GOD / POD-analys 10, som är modifierad för hög genomströmning analys i 96-brunnars mikro titerplattor.
Svamp morfologi efter 72 timmar undersöks i mikroskop och kännetecknas av digital bildanalys. På så sätt är partiklar formfaktorer för svamp makro morfologi som Feret diameter, projicerade area, omkrets, cirkularitet, bildförhållande, rundhet und soliditet beräknas med öppen källkod bildbehandlingsprogram ImageJ. Relevanta parametrar kombineras till en dimensionslös Morfologi antal (Mn) 11, vilket möjliggör en fullständig karakterisering avsvamp morfologi. Det nära sambandet mellan morfologi antalet och produktivitet är markerade genom matematisk regression.
Ändringen av svamp morfologi har varit av intresse för bioteknik sedan många decennier. Olika studier har försökt att variera valda processparametrar såsom pH-värde, ineffekt, temperatur, näringsämnen mediet eller inokulum koncentration 1, men lider av ganska inexakt och ofullständig kontroll av morfologin, höga energikostnader, effekter hämning eller produkten instabilitet, I motsats härtill att tillskott av mikropartiklar tillåter en exakt konstruktion av svamp morfologi genom finjusteras variation av partikelstorlek och koncentration. Detta öppnar nya möjligheter att använda mikropartiklar för optimering och skräddarsydda design av högproducerande morfologi i bioteknisk produktion med A. niger och andra fintrådiga mikroorganismer.
Den digitala bildanalys är en enkel reproducerbar metod för att karaktärisera svamp macro morfologi. Emellertid den mängd parametrar för storlek, form och yta egenskater av morfologiska strukturer som beskrivs i litteraturen gör snabb bedömning av svamp komplicerad morfologi. Den presenterade Morfologi tal som en kombination av relevanta parametrar, undviker denna brist och kan användas inte bara för omfattande karakterisering av morfologiska strukturer, utan också för direkt matematisk korrelation med produktivitet. Detta gör återigen en uppskattning av produktiviteten genom att ges morfologi och därmed en anpassning av morfologi för processen måste möjligt.
Med hjälp av morfologi numret, är det möjligt att skilja mellan olika pellets och morfologier klumpa 4,5. För vidareutveckling av morfologin numret behandlingen av fraktala dimensionen verkar vara lovande. En fraktal dimension ger ett mått på komplexiteten och massa fylla egenskaperna för ett objekt 13 och är därför förutbestämt för holistisk karakterisering av mycel morfologi.
CReation av en hög producerande mycel morfologi, kan dock leda till problem med processernas prestanda, särskilt i stor skala odling, eftersom myceltillväxten formen har tidigare visat sig uppvisa mycket större kulturbuljong viskositeter 2. Detta leder till problem med värme och masstransport och bildande av stillastående icke blandade områden, som kräver en högre ineffekt och göra odlingen dyrare att driva 1. Därför förhållandet mellan svamp morfologi och kultur buljongen viskositet bör beaktas vid byte av morfologi och införlivas i ytterligare modeller.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från den tyska Research Foundation (DFG) genom samarbete forskningscentrum SFB 578 "Från gen till produkt" på Technische Universität Braunschweig, Tyskland.
Table of Equipment:
Equipment | Company | Catalogue Number/model |
autoclave | Systec | V150 |
Büchner funnel (plastic) | VWR | – |
cellulose filter (for biomass dry weight) | Sartorius Stedim Biotech | Filter Discs Grade 389 |
cellulose acetate filter (for air filtration at reactor) | Sartorius stedim biotech | Midisart 200 PTFE |
cellulose acetate filter (for enzyme activity) | Sartorius Stedim Biotech | Midisart NML |
centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5415R |
centrifuge | Heraeus | Biofuge fresco |
centrifuge | Heraeus sepatech | Varifuge 3.0R |
compartment dryer (105 °C) | Heraeus | Kelvitran t |
control unit (temperature) | Jumo | Jumo iTron 08 |
control unit (pH-value) | meredos | pH Control 2 |
desiccator | Duran | Vacuum stable |
Falcon tubes | Omnilab | FALC352070 |
heating block 40 °C | Biometra | TB1 Thermoblock |
heating block 95 °C | HLC | HBT 130 |
micro plate reader | Tecan | Sunrise-Microplate-Reader |
micro scales | Sartorius | CP 225 |
microscope (digital inverted) | AMG | EVOS xl |
micro pipettes and tips (different sizes) | Omnilab | 5283303 5283298 5283299 5283300 |
micro titer plate | Nunc | MaxiSorp |
multi pipette and tips | Eppendorf/ Omnilab | 5283611/ 5283611 |
pH-electrode | Schott | pH-Meter CG840 |
reaction tubes | Roth | E518.1 |
scale | Sartorius | CP 3202 S |
stirred tank bioreactor with equipment | Applikon Biotechnology | 2L Bioreactor set |
syringe | Eppendorf | Combitips Plus 5 mL |
Table of Reagents:
Name of the reagent | Company |
Acetic acid | Roth |
Disodium hydrogen phosphate | Merck |
Ethanol (95%) | Roth |
Glucose monohydrate, (α-D-) | Roth |
Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger) | Sigma |
Hydrochloride acid (37 % w/v) | Fiedel-de Haën |
Hydrous magnesium silicate | Roth |
Monopotassium phosphate | Merck |
o-dianoisidine dihydrochloride | Sigma |
Peroxidase (Typ II from horseradish) | Sigma |
Sodium acetate | Roth |
Sodium hydroxide | Merck |
Sucrose, D-(+) | Fluka |
Water (deionized) | – |
Table of Solutions and Medium Composition:
Solution | Components | Amount |
50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5) | Sodium acetate Bring to volume with deionized water Adjust at pH 6.5 with acetic acid | 4.1 g L-1 |
0.05 M monopotassium phosphate solution | Monopotassium phosphate Bring to volume with deionized water | 6.805 g L-1 |
0.05 M disodium hydrogen phosphate solution | Disodium hydrogen phosphate Bring to volume with deionized water | 7.1 g L-1 |
0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) | 0.05 M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 61.2 mL |
0.05 M phosphate buffer (pH 5.4) | 0.05M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 3 mL |
1.65 M sucrose solution | D-(+)-sucrose Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4) | 564.8 g L-1 |
reagent solution | o-Dianisidin-Dihydrochlorid Ethanol (95%) | 25 mg 10 mL |
Glucose reagent solution | Glucose oxidase Peroxidase Phosphate buffer (pH 7.0) reagent solution | 10.5 mg 3 mg 90 mL 10 mL |