Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler
Summary
Influenzavirus replikere deres RNA-genom i association med værts-celle kromatin. Her præsenterer vi en metode til at rense intakte virale ribonucleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler. Oprenset virus komplekser kan analyseres ved både Western blot og primerforlængelse af protein og RNA-indhold, hhv.
Abstract
Som alle negativt-strengede RNA-vira er genomet af influenzavira emballeret i form af virale ribonukleoprotein komplekser (vRNP), hvor den enkeltstrengede genom er indkapslet af nukleoprotein (NP), og forbundet med det trimere polymerase kompleks bestående af PA, PB1 og PB2 underenheder. Men i modsætning til de fleste RNA-vira, udføre influenzavirus viral RNA-syntese i kerner af inficerede celler. Interessant viral mRNA-syntese anvender cellulære præ-mRNA'er som primere, og det er blevet foreslået, at denne proces finder sted kromatin 1. Vekselvirkninger mellem virale polymerase og værten RNA-polymerase II, samt mellem NP-og værtsceller nukleosomer er også blevet karakteriseret 1,2.
Nylig generering af rekombinante influenzavira koder for et One-Strep-Tag genetisk fusioneret til den C-terminale ende af PB2-underenheden af det virale polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) har væreen beskrevet. Disse rekombinante vira tillader oprensning af PB2-holdige komplekser, herunder vRNPs, fra inficerede celler. Til opnåelse af oprenset vRNPs er cellekulturer inficeret, og vRNPs er affinitetsoprenset fra lysater afledt fra disse celler. Imidlertid har lysis procedurer, der anvendes til dato været baseret på et trin detergent lysis, der på trods af tilstedeværelsen af en generel nuklease, ofte ekstrahere kromatin-bundet materiale kun ineffektivt.
Vores foreløbige arbejde foreslog, at en stor del af nukleare vRNPs ikke blev udvundet under den traditionelle cellelysis, og kunne derfor ikke være affinitet renset. For at øge denne udvinding effektivitet, og at adskille kromatin-bundet fra ikke-kromatin-bundne nukleare vRNPs, vi tilpasset en trinvis subcellulære udvinding protokol til influenza virus-inficerede celler. Kort fortalt denne procedure 1:e adskiller kerner fra cellen og derefter udtrækker opløselige kerneproteiner (her betegnet "nucleoplasmic" fraktion).Den resterende uopløselige nukleare materiale spaltes derefter med Benzonase, en uspecifik DNA / RNA-nuklease, efterfulgt af to saltekstraktion trin: først under anvendelse af 150 mM NaCl (betegnet "CH150"), derefter 500 mM NaCl ("ch500") (fig. 1 ). Disse salte ekstraktionstrin blev valgt baseret på vores observation, at 500 mM NaCI var tilstrækkelig til at opløseliggøre over 85% af nukleare vRNPs men stadig tillader binding af mærkede vRNPs til affinitetsmatricen.
Efter subcellulær fraktionering af inficerede celler, er det muligt at affinitetsoprense PB2-mærkede vRNPs fra hver enkelt fraktion og analysere deres protein-og RNA-komponenter ved hjælp af Western Blot, og primerforlængelse, hhv. For nylig har vi anvendt denne metode til at opdage, at vRNP udførsel komplekser form under sene efter infektion på kromatin fraktion blev ekstraheret med 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Mens mange undersøgelser for nylig identificeret individuelle proteiner eller cellulære net, der er involveret i influenzavirusinfektion 8, den funktionelle betydning af de fleste af disse interaktioner er stadig uklar. Betragtning absolut afhængighed af kromatin-baserede funktioner for influenzavirus RNA-syntese, og komplekset biofysiske og biokemiske beskaffenhed af kernen 9, vil nye teknikker skulle belyse disse funktioner. Den subnuclear fraktionering vi præsenterer her, kombineret med affi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Nada Naffakh og Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) for rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
