Summary
Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.
Abstract
Zoals alle negatief-RNA virussen is het genoom van influenza virussen verpakt in de vorm van virale ribonucleoproteïne complexen (vRNP), waarbij de enkelstrengs genoom is ingekapseld door het nucleoproteïne (NP) en verbonden met de trimere polymerase complex bestaande van de PA, PB1, en PB2 subeenheden. In tegenstelling tot de meeste RNA virussen, influenzavirussen uitvoeren viraal RNA synthese in de kernen van geïnfecteerde cellen. Interessant virale mRNA synthese gebruikt cellulaire pre-mRNA als primers, en is voorgesteld dat dit proces plaatsvindt op chromatine 1. Interacties tussen de virale polymerase en de gastheer RNA polymerase II, alsmede tussen NP en gastheer nucleosomen ook gekenmerkt 1,2.
Onlangs de productie van recombinante influenzavirussen codeert voor een een-Strep-tag genetisch gefuseerd met de C-terminus van het PB2 subeenheid van het virale polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) zijnen beschreven. Deze recombinante virussen kunnen de zuivering van pB2-bevattende complexen, zoals vRNPs van geïnfecteerde cellen. Voor het verkrijgen gezuiverd vRNPs worden celculturen geïnfecteerd en vRNPs zijn affiniteit gezuiverd lysaten uit deze cellen. Echter, de lysis procedures voor date gebaseerd op een stap wasmiddel lysis, die ondanks de aanwezigheid van een algemeen nuclease, vaak extract chromatine gebonden materiaal alleen inefficiënt.
Ons voorbereidend werk gesuggereerd dat een groot deel van de nucleaire vRNPs niet werden gewonnen tijdens de traditionele cellysis, en daarom geen affiniteit gezuiverd. Om deze extractie-efficiëntie te verhogen en te scheiden chromatine-gebonden van niet-chromatine-gebonden nucleaire vRNPs, hebben we aangepast een stapsgewijze subcellulaire extractie protocol om influenza virus-geïnfecteerde cellen. Kortom, deze procedure scheidt eerste kernen van de cel en extraheert oplosbare nucleaire eiwitten (hier aangeduid als de "nucleoplasmatische" fractie).De resterende onoplosbare kernmateriaal wordt dan geknipt met Benzonase een aspecifieke DNA / RNA nuclease, gevolgd door twee zoutwinning stappen: eerst met 150 mM NaCl (zogenaamde "ch150"), dan 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Deze zoutwinning stappen werden gekozen op basis van onze waarneming dat 500 mM NaCl was voldoende voor het oplossen van meer dan 85% van de nucleaire vRNPs maar toch kan de binding van gelabeld vRNPs om de affiniteit matrix.
Na subcellulaire fractionering van geïnfecteerde cellen, is het mogelijk om affiniteit zuiveren PB2-gelabeld vRNPs van elke fractie en analyse van de eiwit-en RNA componenten met Western Blot en primer extension, respectievelijk. Onlangs hebben we gebruikt deze methode om dat vRNP export complexen vorm te ontdekken tijdens de late punten na de infectie op de chromatine-fractie geëxtraheerd met 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
Een schematische stroomdiagram van het protocol is weergegeven in Fig. 1 en een tabel van reagentia wordt hieronder weergegeven.
1. Infectie (16 - 24 uur)
- Zaad van HeLa-cellen in 5 150 mm plastic kweekschalen cel in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) hoge glucose medium, zodat zij bereikt ongeveer 80% confluentie worden de volgende dag (ongeveer 5 x 10 8 cellen). Het is belangrijk dat de cellen niet tot 100% confluentie.
- Op de volgende dag, Strep-gelabeld influenzavirus stock verdunnen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,3% runderserumalbumine (BSA) een veelvoud van infectie van 3.
- Verwijder het groeimedium van de cellen eenmaal gewassen met PBS en 10 ml PBS met het virus aan de cellen. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats de infectie medium met DMEM hoge glucose en verder incubatie bij 37 ° C.
2. Subcellulaire fractionering (3 uur)
- Ze wast cellen met koude PBS en daarna cellen te schorten in koude PBS met een rubberen schraper en transfer naar een 50 ml conische buis.
- Pellet cellen in een tafelblad centrifuge 5 min bij 1000 rpm en te zuigen PBS.
- Hersuspenderen celpellet in 10 ml koud sucrose buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM Mg acetaat (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% proteaseremmer mix) . Na de schorsing, gaan cellen door middel van een 200 ul pipetpunt bevestigd aan een 10 ml plastic serum pipet naar cel klonten te verstoren.
- Incubeer 10 minuten op ijs. Voorzichtig periodiek omkeren om cellen te mengen.
- Voeg Nonidet P-40 (NP-40) tot een eindconcentratie van 0,5% en vortex hoge snelheid gedurende 15 sec. Onmiddellijk centrifugeer 10 min bij 3500 xg bij 4 ° C in een table-top centrifuGE.
- Verwijder supernatant en bewaar bij 4 ° C. Dit is het cytoplasmatische fractie. De pellet dient kleiner witter dan de oorspronkelijke cel pellet. Alle fracties kan worden opgeslagen voor ten minste 4 uur bij 4 ° C.
- Was de pellet in 5 ml koud sacharose buffer, re-centrifuge als in stap 2.5 en Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- De pellet (met kernen) in 1,5 ml koud nucleoplasmatische extractie buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% proteaseremmer mengsel).
- Transfer naar een gekoeld, geheel van glas 4 ml Dounce homogenisator met een strakke stamper en homogeniseren van de kernen met 20 slagen.
Vermijd schuimvorming tijdens homogenisering. De weerstand moet stijgen na ongeveer 10 slagen. Efficiënte homogenisering kan worden bevestigd onder een fase contrast microscoop. - Breng de gehomogeniseerde kernen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer 20 minuten op een draaiend wiel op 4 °C.
- Centrifugeer bij 16.000 x g in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Verwijder supernatant en bewaar bij 4 ° C. Dit is nucleoplasmatische fractie.
- Resuspendeer in 1,5 ml digestie buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% proteaseremmer mengsel, 100 U / ml Benzonase (voor RNA analyse vervanging met 20 U / ml RNase zonder DNase I)) voorverwarmd tot 37 ° C en 10 min geïncubeerd bij 37 ° C.
- Voeg 42 ul 5 M NaCl (voor eindconcentratie van 150 mM NaCl) en geïncubeerd 20 min verder bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 16.000 x g in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Verwijder supernatant en bewaar bij 4 ° C. Dit is ch150 fractie.
- Resuspendeer incuberen in 1,5 ml koud hoge zout buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% proteaseremmer mengsel) en 20 min op ijs.
- Centrifugeer bij 16.000 x g </ Em> in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Verwijder supernatant en bewaar bij 4 ° C. Dit is ch500 fractie.
3. Strep-tag Zuivering (2 uur)
- Voeg 300 ul 5 M NaCl het cytoplasmatische fractie (uiteindelijke concentratie van 150 mM NaCl).
- Aliquot 100 ul van verpakte Strep-Tactin Sepharose korrels per fractie in een 15 ml conische buis.
- Voeg 10 volumes Strep wasbuffer (20 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl ch500 monsters), 1 mM EDTA) tot korrels, keren de buis te mengen en 5 min bij 1000 x g gecentrifugeerd in een tafelblad centrifugeren.
- Verwijder het supernatant, herhaalt u stap 3.3 twee keer en dan de hiel pellet opnieuw in suspensie in een gelijk volume van Strep wasbuffer.
- Voeg 200 ul van gewassen Strep-Tactin kraal slurry aan elke fractie (in 1,5 ml PCR voor nuceloplasmic, ch150 en ch500 fracties en een 15 ml conische buis voor cytoplasmatische fractie).
- Draaienbuizen 1 uur bij 4 ° C op een roterend wiel.
- Centrifugeer buizen 1 min bij 1000 x g bij 4 ° C. Gooi supernatant.
- Voeg 1 ml koud Strep wasbuffer elke buis. Overdracht kralen uit 15 ml buis (cytoplasmatische fractie) tot 1,5 ml buis. Was alle buizen 1 min bij 4 ° C, centrifugeren na zoals in stap 3.7. Tweemaal Herhaal deze wasstap.
- Na de laatste wasstap, verwijdert alle sporen van wasbuffer met een platte pipetpunt. Voeg 100 ul elutiebuffer (Strep wasbuffer die 2,5 mM desthiobiotin) en voorzichtig mengen.
- Incubeer 15 min op ijs. Voorzichtig af en toe door elkaar kralen door te tikken op de bodem van de buizen.
- Centrifugebuizen 1 min bij 1000 x g bij 4 ° C in microcentrifuge. Verzamel supernatant met geëlueerde Strep-tag vRNPs.
4. Representatieve resultaten
De efficiëntie van de fractionering wordt best beoordeeld door Western blot analyse van het gefractioneerde lysaten met ANTIBodies specifiek voor subcellulaire markers (afb. 2). Specifiek moeten succesvolle subnucleaire fractionering weinig of geen cellulaire RNA polymerase II (Pol II) in de nucleoplasmatische of oplosbare nucleaire fractie 4 en met de meeste worden geëxtraheerd met 150 mM NaCl 5. Achteruitgang van Pol II is reproduceerbaar waargenomen influenza virus geïnfecteerde cellen in vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen, in overeenstemming met de literatuur 6.
Zuivering van vRNPs het best beoordeeld door zilver of Coomassie kleuring, zoals een cytoplasmatisch eluaat in Fig. 3. In onze ervaring wordt het grootste deel Strep-PB2 gezuiverd in als onderdeel van een volledig gevormde vRNP, dat wil zeggen weinig oplosbare polymerase wordt vastgelegd. Dit komt tot uiting in de hoge NP: PA/PB1/PB2 verhouding tussen waargenomen door zilver of Coomassie kleuring. Een lagere verhouding suggereert buffer verontreiniging met RNAses, omdat verschillende alomtegenwoordige RNAses (zoals RNase A) bekend splitsen virale RNA zodanig te dissociat de polymerase van NP multimeren 7. Interessant behandeling met Benzonase alleen, terwijl voldoende om virale RNA verteren, lijkt geen invloed op de stochiometrische verhoudingen van vRNP eiwitten. Hoewel we niet kunnen verklaren dit fenomeen zagen we verstoring van vRNPs na digestie met andere RNAses (gegevens niet getoond), wat suggereert dat Benzonase kan verlaten bepaalde structureel belangrijke RNA regio's intact. Na zuivering van vRNPs van het cytoplasma en nucleoplasma (uitgevoerd zonder nuclease spijsvertering) kunnen 8 zwakke maar discrete banden met een hoog molecuulgewicht worden waargenomen door zilveraankleuring, die overeenkomen met de voorspelde molecuulgewicht van het influenza 8 genoom segmenten (zie ref. Drie ).
De relatieve hoeveelheden van vRNPs gezuiverd uit elke fractie 9 uur na infectie worden getoond in Fig. 4. De verdeling van vRNPs varieert in de loop van infectie, met sterkste accumulatie in de ch150 fractie in de vroege tijdstippen, enverhoogde accumulatie in het nucleoplasma en cytoplasma op late tijdstippen.
Figuur 1. Stroomschema van de subcellulaire fractionering. Overgenomen uit ref. 3.
Figuur 2. Western blot analyse van subcellulaire fracties van Influenza virus-geïnfecteerde cellen. 10 9 HeLa cellen werden geïnfecteerd met influenza virusstam WSN voor 9 uur voorafgaand aan de subcellulaire fractionering. Gelijke hoeveelheden van totaal eiwit werd geladen in elke baan en geanalyseerd met behulp getoonde antilichamen. RNA polymerase II (Pol II) werd gedetecteerd met kloon 8WG16, dat alle vormen van de C-terminale domein (het hypophosphorylated band belangrijkste) herkent. Overgenomen uit ref. 3.
Figuur 3.Zilverkleuring analyse van gezuiverde vRNPs. HeLa cellen werden geïnfecteerd met rWSN (als negatieve controle) of rWSN-PB2-Strep voor 9 uur, gevolgd door zuivering van de Strep cytoplasmatische fractie. Asterisk geeft bands die niet zichtbaar zijn na het RNase spijsvertering. Overgenomen uit ref. 3.
Figuur 4. Zilverkleuring analyse van vRNPs gezuiverd uit verschillende celfracties. 10 9 HeLa cellen werden geïnfecteerd met rWSN-PB2-Strep of rWSN voor 9 uur, gevolgd door subcellulaire fractionering en Strep zuivering. Gelijke hoeveelheden van eluaat uit elke fractie werden geladen. Overgenomen uit ref. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl veel studies hebben recent geïdentificeerde individuele eiwitten of cellulaire netwerken die betrokken zijn bij influenza virus infectie 8, de functionele betekenis van de meerderheid van deze interacties blijft onduidelijk. Gezien de absolute afhankelijkheid van chromatine-gebaseerde functies voor influenza virus RNA synthese en de complexe biochemische en biofysische aard van de kern 9, zullen nieuwe technieken nodig zijn om deze functies toe te lichten. De subnucleaire fractionering presenteren wij hier, in combinatie met affiniteitszuivering van vRNPs, kan de karakterisering van cruciaal viraal RNA fabrieken die voorheen ontoegankelijk.
Veel subcellulaire fractionering protocollen zijn eerder in de literatuur beschreven. We zagen dat de meeste van deze traditionele methoden leiden tot voortijdige lekkage van vRNPs van de kern, een fenomeen dat ook beschreven voor Pol II 10. Door een korte incubatie van pre-zwollen cellen met een laag concentration van een zwak wasmiddel, NP-40, efficiënt plasmamembraan lysis plaatsgevonden zonder belangrijke nucleaire lekkage. Interessant uitvoeren van onze subcellulaire fractionering met A549 en HEK293T cellen dan HeLa cellen tot sterk nucleair lekkage van vRNPs in beide cellijnen. Verlaging van de NP-40 concentratie ca. 0,2% verminderd dit probleem, maar vanwege enige variatie van deze cellijnen, optimale condities te empirisch worden bepaald. Een andere mogelijke altermative is het gebruik van niet-menselijke, influenza virus-gevoelige cellijnen zoals MDCK en Vero cellen.
Onze zoutwinning protocol verschilt van de traditionele chromatine extractie procedures die vaak gebruik maken van lagere zoutconcentraties en / of hoge EDTA concentraties. Ons protocol scheidt chromatine in twee specifieke fracties, een Pol II-high/histone-low fractie en haar wederzijds. Kunnen echter ook andere chromatine extractiemethoden ook verenigbaar zijn met de affiniteitszuivering van VRNPs. Aangezien de meeste chromatine extractieprocedures gericht op DNA-eiwit interacties ten opzichte eiwit-eiwit interacties worden nieuwe technieken om goed extraheren chromatine gebonden multi-eiwitcomplexen 11.
In het algemeen dient de lengte van infectie empirisch worden door verschillen tussen stammen en cellijnen vastgesteld. De rWSN-PB2-Strep stam met een moi van 3 hebben we uitgevoerd subcellulaire fractionering op de tijdstippen variëren van 3 tot 10 uur na infectie. In onze ervaring minder dan 3 uur infectie te weinig geeft gezuiverd vRNPs nuttige Western blot analyse, terwijl infectie langer dan 3 uur resulteert in sterke cytopathisch effect en een daaropvolgende mengen fracties.
De mogelijkheid om intact, strak chromatine-gebonden virale complexen te isoleren biedt verschillende mogelijkheden. Hoewel we gebruik gemaakt van een recombinant virus dat een Strep-gelabeld PB2 andere affinity tags kunnen ook worden gebruikt, en tradnele immunoprecipitatie richten op andere virale eiwitten. Voorts, terwijl de analyse van vRNPs beperkt is tot de karakterisering van de eiwit-en RNA componenten die de gezuiverde complexen ook gebruikt worden om functionele voeren in vitro synthese assays. Tenslotte kan de scheiding van vRNPs in grove functionele soort door subnucleaire fractionering ook mogelijk de nader onderzoek van verschillende recentelijk beschreven post-translationele modificaties van virale eiwitten voor een efficiënte RNA synthese 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Nada Naffakh en Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) bedanken voor de rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
