우리는 biofilm 형성을 조사하기위한 간단한 세미 양적 방법을 제공<em> 체외에서</em>. 이 방법은-C 2000 타이밍 및 biofilm 형성의 패턴을 모두 모니터링하는 (카메라 부착 포함) 현미경 분석 해 봅시다, 등 주름 콜로니의 개발에 의해 평가 자이스 혈구 stemi 활용합니다.
Biofilms이나 세포외 기질에 캡슐 세포의 표면 부착 사회는 많은 박테리아에 대한 일반적인 라이프 스타일을 나타냅니다. biofilm 내에서 세균 세포는 종종 항생제 및 기타 환경 스트레스 1 ~ 향상된 저항을 포함하여 생리를 변경냅니다. 또한 biofilms는 호스트 – 미생물 상호 작용에서 중요한 역할을 재생할 수 있습니다. Biofilms 개인의 경우 세균 전환을 개발, planktonic 전지는 복잡한 다세포 공동체에게 2를 형성합니다. 실험실에서 biofilms는 특정 biofilm의 phenotypes의 발전을 평가하여 공부하고 있습니다. 일반 biofilm의 표현형은 단단한 한천 매체 3의 주름이나 주름이 많은 세균 콜로니 형성을 포함한다. 주름 식민지 형성 식별하고 특성 변경된 biofilm의 phenotypes을 전시 박테리아 변종을, 그리고 충격 biofilm 형성 그 환경 조건을 조사하기 위해 특히 간단하고 유용한 방법을 제공합니다. Wrinkled 식민지 형성은 이러한 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6, 녹농균 7과 바실러스 subtilis 4 및 그람 음성 세균과 같은 그람 양성 세균, 모두 포함한 박테리아의 다양한에서 biofilm 형성의 지표 역할을하고, 장염 fischeri 8.
해양 세균 V. fischeri는 호스트 식민지 동안 biofilms의 중요한 역할에 의한 biofilm 형성을위한 모델이되었다 : 제작한 biofilms V. fischeri는 하와이 꼬리 자른 오징어 Euprymna scolopes의 8-10 자사의 식민지를 추진. 중요한 것은, 체외에서 관찰 biofilm의 phenotypes는 V.의 능력과 상관 관계 fischeri 세포는 효과적으로 호스트 동물을 식민지 방법 : 종자가 증가 할 전시하면서 체외의 biofilm 형성을 위해 장애인 변종은 식민지 결함 9,11을 가지고biofilm의 phenotypes는 식민지 8,12위한 개선됩니다. V. fischeri 따라서 박테리아가 biofilm 형성 방법과 biofilms 영향을 미치는 호스트 식민지를 조절하는 메커니즘을 평가하는 간단한 모델 시스템을 제공합니다.
이 보고서에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 시스템으로 fischeri. 이 방법은 고체 한천 매체를 향해 정의의 농도와 볼륨에서 세균성 문화의 야생 신중을 포함, 더럽혀진 문화는 하나의 세균성 식민지에 대한 동의어입니다. 이 '점박이 문화'기술은 하나의 지정된 시간 포인트 (엔드 포인트 assays)에서 총 biofilm의 phenotypes을 비교하거나 식민지 직경의 biofilm 개발과 측정 시간 코스 assays를 통해 미묘한 biofilm의 phenotypes를 식별하고 특성을 위해 활용할 수 어느가 biofilm 형성에 의해 영향을받습니다. 따라서이 기법은 당, biofilm 형성 세미 양적 분석을 제공합니다주름 식민지 개발과 개발 구조를 간단하게 전체적인 형태 넘어 확장 특성의 상대적 크기의 타이밍과 patterning의 평가를 mitting.
이 작품에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 생물로서 fischeri. 특히, 우리는 고체 한천 표면에 시간이 지남에 주름이 식민지 형성 등 biofilm 형성과 발전을 모니터하는 카메라 첨부 파일이있는 해부 현미경을 활용. 이 프로토콜에서는, 우리는 일반적으로 주름 식민지 형성을 평가하기 위해 사용하는 방법 두 가지 구체적인 유형을 설명합니다. 첫 번째는 우리가 선택한 "최종"시점에 최종적으로 전체적인 3D 아키텍처, patterning, 그리고 더럽혀진 문화의 직경을 관찰 수있는 엔드 포인트 분석이다. 이러한 접근 방식은 biofilm 형성을 극적으로 결함을 초래할 돌연변이 변종 또는 조건을 평가하기위한 가장 유용합니다. 그러나, 이러한 방식은 선택된 엔드 포인트 전에 시간 지점에서 발생하는 많은 미묘한 차이를 구분하지 않습니다. 보다 긴밀하게 주름 식민지 형성을 모니터링하기 위해, 우리는 우리 w의 시작을 식별할 수있는 시간 코스 분석을 사용시간의 경과에 식민지 형성과 발전을 지켜을 rinkled. 이 접근법의 결과로 주름 콜로니 형성, 3D 건축 및 patterning의시기에 더 미묘한 차이는 확인할 수 있습니다. 우리는 biofilm 형성의 두 세미 양적 assays을 생성하기 위해이 시간 코스 분석를 사용했습니다. 첫째, 긴장이 3D 아키텍처를 개발하기 위해 시작되는 시간을 제어 계통의 비교할 수 있습니다. 우리는 동일한 조건 하에서 특정 돌연변이의 biofilm 형성의 지연 9 상당히 일관성있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 그림 데이터 인치 2 돌연변이가 지속 biofilm 형성을 시작에서 4 H 지연에 대해 전시. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 법안은 주름 식민지 (장소)의 직경의 크기의 변화입니다. 우리는 (그림 3 주름 콜로니 직경이 점차적으로 종료 시점에서 2 배 차이에 대해 접근이 아닌 biofilm 식민지의와는 다른 것으로 나타났습니다 </strong>)을 (모리스와 Visick, 게시되지 않은 데이터). 그것이 어떤 뮤턴트 다르게 동작합니다 가능한 남아 있지만 현재까지, 우리는 (되지 않은 데이터) (즉, 식민지 직경의 증가없이 biofilm 형성) 다른없이 한 표현형을 관찰하지 않았습니다. 실제로, 그것은 V. 대해보고되었습니다 식민지 직경에있는 상당한 증가에 약간 주름이 식민지 결과가 다른 15 없지만 것을 cholerae. 그럼에도 불구하고 시간이 지남에 따라 직경의 변화를 평가하는 것은 잠재적인 biofilm의 돌연변이 및 / 특성화에 투입하거나 개발 지연과 뮤턴트의 추가적인 양적 척도를 제공할 수 있습니다. biofilm 형성의 두 가지 대책 (시간 및 직경)의, 주름 식민지 형성의 시작을 결정하는 것은 현장의 직경을 결정하는 것보다, 더 많은 주관적 더 민감하지만. 그럼에도 불구하고 두 조치는 biofilm 연구에 매우 유용하지만, quantificatio으로 즉시 의무가 없습니다 표현형의 세미 양적 평가를 제공N.
발견 교양 assays를 수행하면 발견 변종이 배양해되는 환경 조건을 고려하는 것이 중요합니다. 주름 식민지 형성은 주로 양분 가용성, 온도 및 습도 등 다양한 환경 조건에 의해 영향을받습니다. 실험 사이의 다양성을 줄이기 위해서는 가능한 (즉 설정된 볼륨 한천 플레이트를 표준화하고 통제된 온도에서 culturing 발견 변종)가 이러한 조건을 표준화하는 데 유용합니다. 야생 실험 사이의 다양성에 대한 제어, 실험의 각 집합 내에서 해당 컨트롤 변종을 포함하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 이러한 assays에서 데이터를 해석하면, 그것은 주름 식민지 형성의 미묘한 차이 (예를 들어, biofilm 형성 또는 patterning 차이가 지연될)을 평가 특히 어느 한 실험에 여러 번 (3 +)을 수행할 필요가 있습니다. 이 프로토콜 중 일부 제한 사항은 다음과 같습니다 1) determin세포 성장에 결함을 가지고 있는지 ING가 어려울 수 있습니다 : 액체 문화에 세포의 성장은 정확하게 성장 고체 미디어 요금 및 불가 능할 수 있습니다 뭉쳐 있습니다 biofilm – 형성 세포의 성장의 정확한 결정을 반영하지 않을 수 있습니다; 2) 성장 결함있는 종자는 분석이 문제가 될 것이다; 3) 그것은 미묘한 biofilm의 phenotypes와 변종 사이의 직경 차이를 구별하지 못할 수도 있습니다 4) 동심 반지 성장하지 변종 위해 정확하게 측정할 수 없을 수도 있습니다 직경의 변화,이 실험적인 설정과 biofilm의 Z-치수를 측정 할 수 없어도), 6, 5) patterning이 biofilm 형성 동안 관찰할 수 있지만 거기에 결과 biofilm의 patterning을 수량 수있는 방법은 없다 . 이러한 제한에도 불구하고,이 프로토콜은 그럼에도 불구하고 주름 식민지 형성을 평가에 투입하는 수치 데이터를 얻을 수있는 수단을 제공합니다.
이 프로토콜에서는 특정 이미지를 활용시스템은 주름 식민지 형성을 관찰하고 평가하는 (즉, 자이스 혈구 해부 현미경과 ProgRes CapturePro 이미징 소프트웨어). , 주름 식민지 형성의 시작을 감지하고, 따라서 시간 코스 방식으로 개발을 평가할 수있는 능력이 크게 해부 현미경의 사용을 통해 향상됩니다 여기서 설명 이미징 시스템은 강력하다. 이 기술을 사용할 수없는 경우에는 프로토콜은 줌 초점 간단한 디지털 카메라 등 다른 장비와 함께 사용을 위해 적응 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주름 식민지 개발의 평가에 초점을 맞추고 있지만, 또한 박막 형성, 세포가 액체 문화에 정적으로 성장하는 때 개발 biofilm의 형태를 평가하기 위해 수정이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 biofilm 개발 중 점박이의 식민지로 특정 염료의 결합을 포함하여 biofilm 형성의 다른 지표를 평가에 유용합니다. 이들은 포함하지만, 그러한 콩고 레드와 calcoflu 같은 염료에 국한되지 않습니다또는 이것은 셀룰로오스, 16 세균성 biofilms의 일반적인 구성 요소에 바인딩할 수 있습니다. 또한이 프로토콜을 사용하기 위해 개발된 비록 V. fischeri는이 유기체에 한정되지 않고 있지만 이러한 바실러스 subtilis 4, 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6 및 녹농균 7, 모두 전시 주름 식민지 형성 등 여러 가지 생물에서 biofilm 형성을 연구에 일반화 될 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 또한 녹농균 18의 Myxococcus xanthus 17 성장과 항공 구조를 개발 중에 발생 patterning, 잠재적 등의 발달 패턴을 가지고 다른 식민지의 morphologies 공부를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미생물학과 biofilm 연구자에 대한 일반적인 사용하므로입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NHI R01 부여 KLV에게 수여 GM59690에 의해 지원되었다.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |