Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te onderzoeken<em> In vitro</em>. Deze methode maakt gebruik van de Zeiss STEMI 2000-C stereomicroscoop (met camera bijlage) om zowel de timing en het patroon van biofilmvorming te volgen, zoals beoordeeld door de ontwikkeling van gerimpelde kolonies.
Biofilms, of oppervlakte-aangesloten gemeenten van de cellen ingekapseld in een extracellulaire matrix, vormen een gemeenschappelijke levensstijl voor veel bacteriën. Binnen een biofilm, bacteriële cellen vertonen vaak veranderd fysiologie, waaronder verbeterde resistentie tegen antibiotica en andere milieu-invloeden 1. Daarnaast kunnen biofilms spelen een belangrijke rol in de gastheer-microbe interacties. Biofilms ontstaan wanneer bacteriën overgang van individuele, op planktonische cellen vormen complexe, multi-cellulaire gemeenschappen 2. In het laboratorium worden biofilms bestudeerd door de beoordeling van de ontwikkeling van specifieke biofilm fenotype. Een veel voorkomende biofilm fenotype omvat de vorming van gekreukt of geplooid bacteriële kolonies op vaste agar 3. Gerimpelde kolonievorming zorgt voor een bijzonder eenvoudige en nuttige manier te identificeren en karakteriseren van bacteriële stammen vertonen veranderde biofilm fenotypes, en milieu-omstandigheden die van invloed zijn biofilmvorming te onderzoeken. Wrinkled kolonievorming dient als een indicator van biofilmvorming in verschillende bacteriën, zowel Gram-positieve bacteriën, zoals Bacillus subtilis 4 en Gram-negatieve bacteriën, zoals Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 en Vibrio fischeri 8.
De mariene bacterie V. fischeri is uitgegroeid tot een model voor de biofilmvorming te wijten aan de cruciale rol van biofilms tijdens de gastheer kolonisatie: biofilms geproduceerd door V. fischeri ter bevordering van de kolonisatie van de Hawaiiaanse bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Belangrijk biofilm fenotypen in vitro correleren met het vermogen van V. fischeri cellen daadwerkelijk koloniseren gastdieren: stammen inbreuk biofilmvorming in vitro bezitten kolonisatie defect 9,11, terwijl stammen vertonen verhoogdebiofilm fenotypes zijn verbeterd voor kolonisatie 8,12. V. fischeri biedt daarom een eenvoudig model systeem om de mechanismen die bacteriën reguleren biofilmvorming en hoe biofilms invloed gastheer kolonisatie te beoordelen.
In dit rapport beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelsysteem. Bij deze methode wordt de zorgvuldige spotten van bacteriële culturen op bepaalde concentraties en hoeveelheden op vaste agar media; een gevlekte cultuur is synoniem voor een enkele bacteriële kolonie. Deze 'gespot cultuur' techniek kan worden gebruikt om de bruto biofilm fenotypes te vergelijken op een enkele, bepaalde tijd-punten (eindpunt assays), of op te sporen en subtiele biofilm fenotypes karakteriseren door de tijd-gangen-assays van biofilm ontwikkeling en metingen van de kolonie met een diameter , die wordt beïnvloed door biofilmvorming. Aldus deze techniek is een semi-kwantitatieve analyse van biofilmvorming perdoorzenden van de evaluatie van de timing en patroonvorming van de gerimpelde kolonie ontwikkeling en de relatieve omvang van de te ontwikkelen structuur, kenmerken die verder gaan dan de eenvoudige algemene morfologie.
In dit werk beschrijven we een semi-kwantitatieve methode om te beoordelen biofilmvorming met behulp van V. fischeri als modelorganisme. In het bijzonder hebben we gebruik maken van een dissectie microscoop met camera gehechtheid aan biofilmvorming en ontwikkeling als gerimpelde kolonievorming loop van de tijd op een stevige ondergrond agar te controleren. In dit protocol, schetsen we twee specifieke types van methodes die we vaak gebruiken om gerimpelde kolonievorming te beoordelen. De eerste is de end-point test, die ons in staat stelt om de definitieve, totale 3D-architectuur, patronen, en de diameter van een gevlekte cultuur te observeren op een geselecteerde "definitieve" tijdstip. Deze aanpak is vooral nuttig voor de beoordeling van mutant stammen of omstandigheden die leiden tot dramatische defecten in biofilmvorming. Echter, deze aanpak geen onderscheid tussen meer subtiele verschillen die op het moment punten voor de geselecteerde eindpunt. Om meer te voet te volgen gerimpeld kolonievorming, gebruiken we een tijdsverloop test, die ons in staat stelt het identificeren van de start van de wrinkled kolonievorming en kijken naar de ontwikkeling in de tijd. Als gevolg van deze aanpak kan meer subtiele verschillen in timing van gerimpelde kolonievorming, 3D-architectuur en patronen worden geïdentificeerd. Wij hebben deze tijdsverloop assay twee semi-kwantitatieve bepalingen van biofilmvorming te genereren. Ten eerste kan het tijdstip waarop een spanning begint te ontwikkelen 3D architectuur worden vergeleken met die van controlestammen. Wij hebben gevonden dat de vertraging in biofilmvorming een bepaalde mutant onder dezelfde omstandigheden vrij consistent 9. Bijvoorbeeld in de gegevens in Fig. 2 mutant vertoonde steeds ongeveer 4 h vertraging bij de inleiding biofilmvorming. Een tweede semi-kwantitatieve maat biofilmvorming de verandering in de omvang van de diameter van de gerimpelde kolonie (spot). Wij hebben gevonden dat de diameter van gerimpelde kolonies geleidelijk verschilt van die van niet-biofilm kolonies tot ongeveer een 2-voudig verschil eind tijdstip (Fig. 3 </strong>) (Morris en Visick, niet gepubliceerde gegevens). Tot op heden hebben we niet waargenomen een fenotype zonder de ander (dat wil zeggen, biofilmvorming zonder een toename van de kolonie diameter) (niet-gepubliceerde gegevens), ook al blijft het mogelijk een aantal mutanten zullen zich anders gedragen. Inderdaad is het gerapporteerd voor V. cholerae dat sommige gerimpelde kolonies resulteren in een aanzienlijke verhoging van de kolonie diameter en andere niet 15. Toch kon beoordeling van de verandering in diameter tijd te helpen bij de karakterisering van mutanten mogelijk biofilm en / of een extra kwantitatieve meting van mutanten met vertragingen in de ontwikkeling. Van beide maatregelen van biofilmvorming (tijd diameter) vaststellen van het begin van gerimpelde kolonievorming gevoeliger, maar ook subjectieve dan het bepalen van de diameter van de vlek. Maar toch, beide maatregelen zorgen voor een semi-kwantitatieve beoordeling van een fenotype dat is zeer nuttig om biofilm onderzoekers, maar niet gemakkelijk vatbaar is voor quantification.
Bij het uitvoeren van gespot gekweekte testen, is het belangrijk om te overwegen de milieu-omstandigheden waarin de gevlekte stammen worden gekweekt. Gerimpelde kolonievorming wordt vaak beïnvloed door verschillende omgevingsfactoren, met inbegrip van de beschikbaarheid van voedingsstoffen, temperatuur en vochtigheid. Ter vermindering van de variabiliteit tussen de experimenten, is het nuttig om deze voorwaarden te standaardiseren zoveel mogelijk (dat wil zeggen het standaardiseren van de agar platen tot een bepaald maximum en het kweken van de gevlekte stammen bij een gecontroleerde temperatuur). Om verdere controle voor verschillen tussen het spotten van experimenten, is het belangrijk om de juiste controle stammen binnen elke reeks experimenten. Tenslotte het interpreteren van de gegevens van deze assays is nodig om een experiment meerdere keren (3 +), voert het bijzonder bij de beoordeling kleine verschillen in gerimpeld kolonievorming (bijvoorbeeld een vertragingstijd in biofilmvorming of patronen verschillen). Enkele beperkingen van dit protocol zijn: 1) vaststelING of cellen een defect in de groei hebben kan lastig zijn: groei van cellen in vloeibare cultuur kan niet altijd volledig zijn groei op vaste media, en een nauwkeurige bepaling van de groei van biofilm-vormende cellen, die samen kunnen blijven plakken, is wellicht niet mogelijk; 2) stammen met groeistoornissen zal problematisch zijn om te analyseren, 3) het kan niet mogelijk zijn om met een diameter verschillen tussen de stammen met subtiele biofilm fenotypen onderscheiden; 4) voor de stammen die niet opgroeien in een concentrische ring het misschien niet mogelijk is om nauwkeurig te meten veranderingen in doorsnede; 5) terwijl de patronen waar te nemen tijdens de biofilmvorming, is er geen manier om de patronen van de daaruit voortvloeiende biofilm te kwantificeren, en 6) is er geen manier om de Z-dimensie van de biofilm te meten met deze experimentele set-up . Ondanks deze beperkingen wordt in dit protocol biedt toch een middel om numerieke gegevens te verkrijgen om te helpen bij de beoordeling van gerimpeld kolonievorming.
In dit protocol maken we gebruik van een specifieke beeldvormingsysteem (dat wil zeggen, een Zeiss stereomicroscoop en Progres CapturePro imaging software) te observeren en te evalueren gerimpeld kolonievorming. Het afbeeldingsstelsel hier beschreven sterk: het vermogen tot het begin van gerimpelde kolonievorming te detecteren en derhalve evalueren ontwikkeling met een tijdsverloop benadering wordt aanzienlijk verbeterd door het gebruik van een stereomicroscoop. Indien deze technologie niet beschikbaar is, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met andere apparatuur, zoals een eenvoudige digitale camera met een zoom focus. Hoewel dit protocol richt zich op de beoordeling van gerimpelde kolonie ontwikkeling, het kan ook worden aangepast om vlies vorming, een vorm van biofilm die ontstaat wanneer de cellen zijn statisch groeien in vloeibare cultuur te evalueren. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de beoordeling van andere indicatoren van biofilmvorming, inclusief het opnemen van specifieke kleurstoffen in de bonte koloniën tijdens de biofilm ontwikkeling. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, kleurstoffen, zoals Congo Red en calcofluof die kunnen binden aan cellulose, een gemeenschappelijk deel van bacteriële biofilms 16. Bovendien, dit protocol, hoewel ontworpen voor gebruik met V. fischeri is niet beperkt tot dit organisme, maar kan worden gegeneraliseerd tot studie biofilmvorming in vele verschillende organismen, zoals Bacillus subtilis 4 Vibrio cholerae 5 Vibrio parahaemolyticus 6 en Pseudomonas aeruginosa 7, die vertonen alle gerimpeld kolonievorming. Tenslotte kan ook worden aangepast aan andere kolonie morfologie een ontwikkelingspatroon, zoals mogelijk de patronen die optreedt tijdens de groei van Myxococcus Xanthus 17 en lucht structuurontwikkeling Pseudomonas aeruginosa 18 hebben bestuderen. Dit protocol is dus van algemeen nut voor de microbiologie en de biofilm onderzoekers.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NHI R01 subsidie GM59690 toegekend aan KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |