Nós fornecer um método simples, semi-quantitativa para investigar a formação de biofilme<em> In vitro</em>. Este método tira vantagem do IAM Zeiss 2000-C microscópio de dissecção (com acessório de câmara) para monitorar a duração eo padrão de formação de biofilme, conforme avaliado pelo desenvolvimento de colônias rugosas.
Biofilmes ou superfície inscritos comunidades de células encapsuladas em uma matriz extracelular, representam um estilo de vida comum para muitas bactérias. Dentro de um biofilme, as células bacterianas apresentam frequentemente alterada fisiologia, incluindo maior resistência aos antibióticos e outros estresses ambientais 1. Além disso, os biofilmes podem desempenhar papéis importantes na série de micróbios interações. Biofilmes se desenvolvem quando bactérias de transição individual, células planctônicas para formar complexos, multicelulares comunidades 2. No laboratório, biofilmes são estudados por avaliação do desenvolvimento de fenótipos de biofilme específicos. Um fenótipo de biofilme comum envolve a formação de enrugadas ou rugoso colónias bacterianas em agar sólido meios 3. Formação da colônia enrugado fornece um meio particularmente simples e úteis para identificar e caracterizar as cepas bacterianas que exibem fenótipos biofilme alterados, e para investigar as condições ambientais que a formação de biofilme impacto. Wriformação de colónias nkled serve como um indicador da formação de biofilme em uma variedade de bactérias, incluindo ambas as bactérias Gram-positivas, tais como Bacillus subtilis 4, e bactérias gram-negativas, tais como Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, e Vibrio fischeri 8.
A bactéria marinha V. fischeri tornou-se um modelo para a formação de biofilme devido ao papel fundamental do biofilme durante a colonização do hospedeiro: biofilmes produzidos por V. fischeri promover a sua colonização das havaianas bobtail lula 8-10 Euprymna scolopes. Importante, fenótipos de biofilme observados in vitro correlaciona com a capacidade de V. células fischeri para efetivamente colonizar animais hospedeiros: linhagens deficientes para a formação de biofilme in vitro possuem um defeito de colonização 9,11, enquanto as estirpes apresentando aumentofenótipos de biofilme são reforçadas para a colonização 8,12. V. fischeri, portanto, fornece um sistema modelo simples para avaliar os mecanismos pelos quais as bactérias regulam a formação de biofilmes e como biofilmes colonização do hospedeiro impacto.
Neste relatório, nós descrevemos um método semi-quantitativo para avaliar a formação de biofilme com V. fischeri como um sistema modelo. Este método envolve o cuidado manchas de culturas bacterianas em concentrações e volumes definidos para meios de agar sólidos; uma cultura manchado é sinónimo de uma única colónia bacteriana. Esta técnica "cultura manchado 'pode ser utilizado para comparar os fenótipos de biofilme em bruto individuais, especificados prazos pontos (ponto final de testes), ou para identificar e caracterizar os fenótipos de biofilme sutis através do tempo-curso ensaios de desenvolvimento de biofilme e medições do diâmetro das colônias , que é influenciada pela formação de biofilmes. Assim, esta técnica fornece uma análise semi-quantitativa da formação de biofilme, pormitting avaliação do timing e padrões de desenvolvimento colônia enrugado e do tamanho relativo da estrutura de desenvolvimento, características que vão além da simples morfologia geral.
Neste trabalho, nós descrevemos um método semi-quantitativo para avaliar a formação de biofilme com V. fischeri como um organismo modelo. Especificamente, nós utilizamos um microscópio de dissecação com anexo câmara para monitorizar a formação de biofilmes e desenvolvimento como a formação de colónias enrugada ao longo do tempo sobre uma superfície de agar sólido. Neste protocolo, destacamos dois tipos específicos de métodos que comumente usam para avaliar a formação da colônia enrugado. O primeiro é o ensaio de ponto final, o que nos permite observar a final, arquitetura geral 3D, padronização, e diâmetro de uma cultura manchado em um ponto selecionado de tempo "final". Esta abordagem é mais útil para a avaliação estirpes mutantes ou condições que conduzem a defeitos dramáticas na formação de biofilmes. No entanto, essa abordagem não faz distinção entre diferenças mais sutis que ocorrem em momentos antes de o selecionado de ponto final. Para acompanhar mais de perto a formação de colônia enrugado, nós usamos um ensaio de evolução no tempo, que nos permite identificar o início de wrinkled formação de colônias e observar a sua evolução no tempo. Como um resultado desta abordagem, as diferenças mais subtis no momento da formação de colónias enrugada, a arquitectura 3D, e padronização pode ser identificado. Utilizou-se este ensaio curso de tempo para gerar dois semi-quantitativos ensaios de formação de biofilmes. Em primeiro lugar, o momento em que uma estirpe começa a desenvolver arquitectura 3D pode ser comparada com a de estirpes de controlo. Nós descobrimos que o atraso na formação de biofilmes de um mutante particular sob as mesmas condições é razoavelmente consistente 9. Por exemplo, nos dados mostrados na fig. 2, o mutante de forma consistente exibiram um atraso de cerca de 4 h em iniciar a formação de biofilmes. Uma medida semi-quantitativa segundo de formação de biofilme é a alteração no tamanho do diâmetro da colónia enrugada (spot). Descobrimos que o diâmetro das colónias enrugadas progressivamente difere da do não-biofilme colónias, atingindo cerca de uma diferença de 2 vezes no ponto de tempo final (Fig. 3 </strong>) (Morris e Visick, dados não publicados). Até o momento, não observamos um fenótipo sem a outra (ou seja, a formação de biofilme sem um aumento no diâmetro das colônias) (dados não publicados), embora continue a ser possível que alguns mutantes irão se comportar de forma diferente. Na verdade, tem sido relatado para V. cholerae que algum resultado colônias amassado em um aumento substancial no diâmetro das colônias, enquanto outros não 15. Ainda assim, avaliar a mudança de diâmetro ao longo do tempo poderia ajudar na caracterização de mutantes de biofilme potenciais e / ou fornecer uma medida adicional quantitativa de mutantes com atrasos no desenvolvimento. Das duas medidas de formação de biofilme (tempo e de diâmetro), determinando o início da formação de colónias enrugado é mais sensível, mas também mais subjectiva, do que a determinação do diâmetro do local. Mesmo assim, ambas as medidas proporcionar uma avaliação semi-quantitativa de um fenótipo que é extremamente útil para os investigadores de biofilme, mas não é facilmente passível de quantification.
Ao realizar ensaios manchados cultura, é importante considerar as condições ambientais em que as cepas manchados são cultivadas. Formação de colônias enrugada é freqüentemente influenciada por várias condições ambientais, incluindo a disponibilidade de nutrientes, temperatura e umidade. Para reduzir a variabilidade entre as experiências, é útil para padronizar estas condições o máximo possível (ie padronizar as placas de agar para um volume definido e cultivando as estirpes manchados a uma temperatura controlada). Para o controlo adicional para a variabilidade entre os experimentos spotting, é importante incluir as estirpes de controlo adequadas dentro de cada conjunto de experiências. Finalmente, quando a interpretação dos dados a partir destes ensaios, é necessária a realização de qualquer uma experiência várias vezes (3 +), especialmente quando avaliar diferenças subtis na formação de colónias enrugada (eg, um atraso na formação de biofilme ou diferenças de padronização). Algumas limitações do presente protocolo são: 1) detering se as células têm um defeito no crescimento pode ser difícil: o crescimento de células em cultura líquida pode não reflectir com precisão as taxas de crescimento em meios sólidos, e uma determinação precisa do crescimento do biofilme formadoras de células, que podem ficar juntos, pode não ser possível; 2) as estirpes com defeitos de crescimento vai ser problemático para analisar; 3) pode não ser possível distinguir diferenças de diâmetro entre as estirpes com fenótipos de biofilme subtis, 4) para as estirpes que não crescem em um anel concêntrico, pode não ser possível medir com precisão mudanças de diâmetro, 5), enquanto padronização podem ser observados durante a formação do biofilme, não há maneira de quantificar a padronização do biofilme resultante; e 6) não há maneira de medir a dimensão Z-do biofilme com este conjunto experimental . Apesar destas limitações, este protocolo, no entanto, fornece um meio para obtenção de dados numéricos para auxiliar na avaliação da formação da colônia enrugado.
Neste protocolo, nós utilizamos um imagem específicasistema (ou seja, um microscópio Zeiss dissecação e ProgRes CapturePro software de imagem) para observar e avaliar a formação de colônia rugosa. O sistema de imagem descrita aqui é poderosa: a capacidade de detectar o início da formação de colónias enrugada, e, assim, avaliar o desenvolvimento com uma abordagem ao longo do tempo, é grandemente aumentada através do uso de um microscópio de dissecação. No entanto, se esta tecnologia não está disponível, o protocolo pode ser adaptado para uso com outro equipamento, incluindo uma câmara digital simples com um foco de zoom. Embora este protocolo centra-se na avaliação do desenvolvimento de colónias enrugado, também poderia ser modificado para avaliar a formação de película, uma forma de biofilme que se desenvolve quando as células estão a crescer em cultura líquida estaticamente. Este protocolo também pode ser útil na avaliação de outros indicadores de formação de biofilme, incluindo a incorporação de corantes específicos para as colônias manchados durante o desenvolvimento do biofilme. Estes incluem, mas não estão limitados a, corantes, tais como Congo Red e calcofluou que pode ligar à celulose, um componente comum de biofilmes bacterianas 16. Além disso, este protocolo, embora desenvolvido para utilização com V. fischeri, não está limitada a este organismo, mas pode ser generalizada para estudar a formação de biofilme em numerosos organismos diferentes, tais como Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 e Pseudomonas aeruginosa, que todos apresentam a formação de colónias enrugada. Finalmente, também pode ser adaptado para estudar morfologias de colónias outros que têm um padrão de desenvolvimento, tais como, potencialmente, o padrão que ocorre durante o crescimento de Myxococcus xanthus 17 e desenvolvimento de estruturas aéreas em Pseudomonas aeruginosa 18. Este protocolo é, portanto, de uso geral para os pesquisadores de microbiologia e biofilme.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi suportado pelo NHI R01 concessão GM59690 concedido a KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |