Noi forniamo un semplice, semi-quantitativa metodo per studiare la formazione di biofilm<em> In vitro</em>. Questo metodo sfrutta il STEMI Zeiss 2000-C dissezione Microscopio (con l'attacco della fotocamera) per monitorare sia i tempi e il modello di formazione di biofilm, come dimostrato dallo sviluppo di colonie rugose.
Biofilm, o superficie collegati comunità di cellule incapsulate in una matrice extracellulare, rappresentano uno stile di vita comune per molti batteri. All'interno di un biofilm, le cellule batteriche spesso mostrano alterata fisiologia, anche una maggiore resistenza agli antibiotici e altri stress ambientali 1. Inoltre, i biofilm possono svolgere ruoli importanti in interazioni ospite-microbo. I biofilm si sviluppano quando i batteri passaggio da individuo, le cellule planctoniche a formare complessi e multi-cellulari comunità 2. In laboratorio, biofilm sono studiate valutando lo sviluppo di biofilm fenotipi specifici. Un fenotipo biofilm comune comporta la formazione di colonie batteriche o rugose rugose su agar solido media 3. Formazione di colonie Rugosa fornisce uno strumento particolarmente semplice e utile per identificare e caratterizzare i ceppi batterici che presentano fenotipi alterati biofilm, e per studiare le condizioni ambientali che la formazione di biofilm impatto. Wrila formazione di colonie nkled serve come un indicatore della formazione di biofilm in una varietà di batteri, inclusi sia batteri Gram-positivi, come Bacillus subtilis 4, e batteri Gram-negativi, come Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, e Vibrio fischeri 8.
Il batterio marino V. fischeri è diventato un modello per la formazione del biofilm a causa del ruolo cruciale dei biofilm durante la colonizzazione host: biofilm prodotto da V. fischeri promuovere la sua colonizzazione delle Hawaii Bobtail calamari Euprymna 8-10 scolopes. È importante sottolineare che, fenotipi biofilm osservati in vitro correlano con la capacità di V. fischeri cellule di colonizzare efficacemente animali ospiti: ceppi di handicap per la formazione del biofilm in vitro in possesso di un difetto colonizzazione 9,11, mentre i ceppi esibendo un aumentofenotipi biofilm sono stati migliorati per la colonizzazione 8,12. V. fischeri fornisce quindi un sistema semplice modello per valutare i meccanismi con cui i batteri regolano la formazione di biofilm e come biofilm ospite colonizzazione impatto.
In questo rapporto, descriviamo un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come sistema modello. Questo metodo comporta l'attenta individuazione di colture batteriche a concentrazioni e volumi definiti su un supporto di agar solido, una cultura maculato è sinonimo di una singola colonia batterica. Questa tecnica di 'cultura spotted' può essere utilizzato per confrontare i fenotipi biofilm lordi a singoli, specifici punti temporali (end-point saggi), o per identificare e caratterizzare i fenotipi biofilm sottili attraverso il tempo portate saggi di sviluppo biofilm e misurazioni del diametro colonia , che è influenzata dalla formazione di biofilm. Così, questa tecnica fornisce una analisi semiquantitativa di formazione di biofilm, permitting valutazione dei tempi e patterning di sviluppo della colonia rugosa e le dimensioni relative della struttura in via di sviluppo, caratteristiche che si estendono al di là della semplice morfologia complessiva.
In questo lavoro, si descrive un metodo semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm utilizzando V. fischeri come organismo modello. In particolare, ci avvaliamo di un microscopio da dissezione con attacco telecamera per monitorare la formazione di biofilm e sviluppo, formazione di colonie rugosa nel corso del tempo su una superficie solida agar. In questo protocollo, si delineano due tipi specifici di metodi usiamo comunemente per valutare la formazione di rughe colonia. Il primo è il test end-point, che ci permette di osservare il finale, architettura complessiva 3D, modellazione, e il diametro di una cultura macchiato in un punto di scelta "finale" del tempo. Questo approccio è particolarmente utile per valutare i ceppi mutanti o condizioni che portano a difetti drammatici nella formazione di biofilm. Tuttavia, questo approccio non distingue tra più sottili differenze che si verificano ad intervalli di tempo prima della scelta end-point. Per monitorare più da vicino la formazione di rughe colonia, si usa un saggio di sviluppo nel tempo, che ci permette di identificare l'inizio di wrinkled formazione di colonie e guardare il suo sviluppo nel tempo. Come risultato di questo approccio, più sottili differenze nei tempi di formazione della colonia rugosa, architettura 3D, e patterning può essere identificato. Abbiamo usato questo test andamento nel tempo di generare due semi-quantitative saggi di formazione di biofilm. In primo luogo, il tempo in cui un ceppo inizia a svilupparsi architettura 3D può essere paragonato a quello di ceppi di controllo. Abbiamo trovato che il ritardo nella formazione di biofilm di un mutante particolare nelle stesse condizioni è abbastanza consistente 9. Ad esempio, nei dati mostrati nella fig. 2, il mutante costantemente esposto su un ritardo 4 h in avviare la formazione di biofilm. Un secondo semi-quantitativa misura della formazione del biofilm è il cambiamento delle dimensioni del diametro della colonia rugosa (spot). Abbiamo trovato che il diametro delle colonie rugose progressivamente differisce da quella di non-biofilm colonie, raggiungendo circa 2 volte differenza nel punto di fine (Fig. 3 </strong>) (Morris e Visick, dati non pubblicati). Fino ad oggi, non abbiamo osservato un fenotipo senza l'altra (cioè la formazione di biofilm senza un aumento del diametro delle colonie) (dati non pubblicati), anche se rimane possibile alcuni mutanti si comporterà in modo diverso. Infatti, è stato riportato per V. cholerae che qualche risultato rugosa colonie in un sostanziale aumento del diametro delle colonie, mentre altri no 15. Tuttavia, valutando la variazione di diametro nel corso del tempo potrebbe aiutare nella caratterizzazione di mutanti biofilm potenziali e / o fornire un'ulteriore misura quantitativa di mutanti con ritardi nello sviluppo. Dei due misure della formazione di biofilm (tempo e diametro), determinando l'inizio della formazione della colonia rugosa è più sensibile, ma anche più personale, di determinare il diametro dello spot. Anche così, entrambe le misure forniscono una valutazione semiquantitativa di un fenotipo che è estremamente utile per i ricercatori biofilm ma non facilmente suscettibili di quantification.
Quando si esegue maculati test in coltura, è importante considerare le condizioni ambientali in cui vengono coltivati i ceppi maculati. Formazione di colonie Rugosa è spesso influenzata da varie condizioni ambientali, compresa la disponibilità di nutrienti, temperatura e umidità. Per ridurre la variabilità tra esperimenti, è utile standardizzare queste condizioni il più possibile (cioè standardizzazione delle piastre di agar a un determinato volume e coltivando i ceppi maculati a temperatura controllata). Per un ulteriore controllo per la variabilità tra esperimenti avvistamento, è importante includere i appropriati ceppi di controllo all'interno di ciascuna serie di esperimenti. Infine, l'interpretazione dei dati ottenuti in questi test, è necessario eseguire una qualsiasi esperimento più volte (3 +), specialmente nel valutare sottili differenze di formazione di colonie rugosa (ad esempio, un ritardo nella formazione di biofilm o differenze patterning). Alcune limitazioni di questo protocollo sono: 1) deterING se le cellule hanno un difetto nella crescita può essere difficile: la crescita delle cellule in coltura liquida possono non corrispondere accuratamente i tassi di crescita su terreni solidi, e una determinazione accurata di crescita del biofilm che formano le cellule, che possono stare insieme, potrebbe non essere possibile; 2) ceppi con difetti di crescita sarà problematico da analizzare; 3) può non essere possibile distinguere differenze di diametro tra ceppi con fenotipi biofilm sottili, 4) per ceppi che non crescono in un anello concentrico può non essere possibile misurare accuratamente cambiamenti di diametro, 5) mentre patterning possono essere osservati durante la formazione di biofilm, non vi è alcun modo per quantificare il modellamento del biofilm risultante, e 6) non c'è modo per misurare la Z-dimensione del biofilm con questa configurazione sperimentale . Nonostante questi limiti, questo protocollo prevede tuttavia un mezzo per ottenere dati numerici per aiutare a valutare la formazione di rughe colonia.
In questo protocollo, ci avvaliamo di un imaging specifichesistema (ad esempio, un microscopio Zeiss dissezione e Progres CapturePro software di imaging), di osservare e valutare la formazione di rughe colonia. Il sistema di imaging descritto qui è potente: la capacità di rilevare l'inizio della formazione della colonia rugosa, e quindi valutare lo sviluppo con un approccio corso di tempo, è notevolmente aumentata con l'uso di un microscopio da dissezione. Tuttavia, se questa tecnologia non è disponibile, il protocollo può essere adattato per l'uso con altre apparecchiature, tra cui una semplice macchina fotografica digitale con un obiettivo zoom. Mentre questo protocollo si concentra sulla valutazione di sviluppo colonia rugosa, potrebbe anche essere modificato per valutare la formazione di pellicola, una forma di biofilm che si sviluppa quando le cellule crescono staticamente in coltura liquida. Questo protocollo può rivelarsi utile anche per valutare altri indicatori della formazione di biofilm, tra cui l'incorporazione di coloranti specifici nelle colonie macchiati durante lo sviluppo di biofilm. Questi includono, ma non sono limitati a, coloranti come Congo Red e calcofluo che possono legarsi alla cellulosa, un componente comune di biofilm batterici 16. Inoltre, questo protocollo, anche se sviluppato per l'uso con V. fischeri, non è limitata a questo organismo, ma può essere generalizzato per studiare la formazione di biofilm in numerose differenti organismi, come Bacillus subtilis 4, 5 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 e Pseudomonas aeruginosa, che mostra tutti formazione di colonie rugosa. Infine, può anche essere adattato per studiare morfologie di colonia altri che hanno un modello di sviluppo, come, potenzialmente, il patterning che si verifica durante la crescita del Myxococcus xanthus 17 e sviluppo struttura aerea in Pseudomonas aeruginosa 18. Questo protocollo è quindi di uso generale per i ricercatori di microbiologia e di biofilm.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da NHI R01 concessione GM59690 assegnato a KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |