माउस मॉडल: intraluminal MCAO Cresyl वायलेट धुंधला द्वारा सेरेब्रल रोधगलितांश मूल्यांकन

Summary

intraluminal बीच चूहों में मस्तिष्क रोड़ा मॉडल यहां प्रस्तुत है. मस्तिष्क रोधगलितांश की हद तक एक neurologic स्कोर और cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना, टीटीसी के लिए एक विकल्प धुंधला हो जाना, महान लाभ की पेशकश करने के लिए समानांतर कई ब्याज मार्करों में परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया है.

Abstract

Stroke is the third cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic stroke accounts for approximately 80% of all strokes. However, the thrombolytic tissue plasminogen activator (tPA) is the only treatment of acute ischemic stroke that exists. This led researchers to develop several ischemic stroke models in a variety of species. Two major types of rodent models have been developed: models of global cerebral ischemia or focal cerebral ischemia. To mimic ischemic stroke in patients, in whom approximately 80% thrombotic or embolic strokes occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), the intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is quite relevant for stroke studies. This model was first developed in rats by Koizumi et al. in 1986 ¹. Because of the ease of genetic manipulation in mice, these models have also been developed in this species ^2-3.

Herein, we present the transient MCA occlusion procedure in C57/Bl6 mice. Previous studies have reported that physical properties of the occluder such as tip diameter, length, shape, and flexibility are critical for the reproducibility of the infarct volume ⁴. Herein, a commercial silicon coated monofilaments (Doccol Corporation) have been used. Another great advantage is that this monofilament reduces the risk to induce subarachnoid hemorrhages. Using the Zeiss stereo-microscope Stemi 2000, the silicon coated monofilament was introduced into the internal carotid artery (ICA) via a cut in the external carotid artery (ECA) until the monofilament occludes the base of the MCA. Blood flow was restored 1 hour later by removal of the monofilament to mimic the restoration of blood flow after lysis of a thromboembolic clot in humans. The extent of cerebral infarct may be evaluated first by a neurologic score and by the measurement of the infarct volume. Ischemic mice were thus analyzed for their neurologic score at different post-reperfusion times. To evaluate the infarct volume, staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) was usually performed. Herein, we used cresyl violet staining since it offers the opportunity to test many critical markers by immunohistochemistry. In this video, we report the MCAO procedure; neurological scores and the evaluation of the infarct volume by cresyl violet staining.

Protocol

क्षणिक मध्यम प्रमस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) 1. सर्जरी प्रक्रिया (1 चित्रा) क्षणिक मध्यम प्रमस्तिष्क धमनी रोड़ा (tMCAO) 2 पर किया जाता है – 3 महीने पुराने पुरुष C57BL / 6 चूहों (22-28g). इस प्रोटोकॉल IRCM bioethics समिति जानवरों की देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया था. सर्जिकल उपकरण वाष्पदावी विसंक्रण (121 ° 60 मिनट के लिए 15 साई सी) द्वारा निष्फल गया. प्रत्येक जानवर के बीच, वे गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ (15 सेकंड) का उपयोग निष्फल रहे थे. सर्जरी मेज और अन्य उपकरणों का उपयोग करते हुए 70% इथेनॉल साफ कर रहे हैं. सर्जरी से पहले दो घंटे, चूहों buprenorphine (0.03 bwip मिलीग्राम / किग्रा) के साथ analgesized थे. चित्रा 1 ए. गहरा isoflurane 5% के साथ चूहों बेहोश करना और फिर 2.5% isoflurane संज्ञाहरण बनाए रखने. चूहों के शरीर का तापमान एक हीटिंग पैड के साथ सर्जरी के दौरान लगातार बनाए रखा है. फर और एस कीटाणुरहितमें 70% इथेनॉल या Betadine साथ. चूंकि शेविंग बाल टुकड़ा रिहाई, microabrasions और सूजन है कि स्ट्रोक pathophysiology पर असर हो सकता है उत्पादन, हम माउस फर दाढ़ी नहीं है. एक midline गर्दन चीरा और धीरे अलावा मुलायम ऊतकों खींच. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (2000 STEMI, Zeiss) के तहत, एक कुंद विच्छेदन ट्रेकिआ बेनकाब और मांसपेशियों को वापस लेना मन्या धमनी का पता लगाने के लिए किया जाता है. ऊतकों आसपास से बाईं आम मन्या धमनी (सीसीए) ध्यान dissected है और सीसीए अस्थायी रूप से एक अस्थायी (1) 20 मिमी खंडों में 5-0 रेशम सीवन कटौती का उपयोग सीवन द्वारा occluded है. महान देखभाल vagal तंत्रिका को नुकसान नहीं करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. अलग बाईं आंतरिक आम मन्या (आईसीए) धमनी और बाहरी आम मन्या धमनी (ईसीए) के विभाजन. एक स्थायी सीवन (2) ईसीए के आसपास रखा गया है, के रूप में संभव के रूप में distally और ईसीए पर एक और अस्थायी थोड़ा तंग सीवन (3) को बाहर रखा गया हैद्विभाजन. क्लिप छोड़ दिया आईसीए (4) एक रिवर्स कार्रवाई चिमटी का उपयोग करने के लिए खून बह रहा से बचने के लिए. महान देखभाल vagal तंत्रिका को नुकसान नहीं करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. ईसीए (5) (2) स्थायी और अस्थायी (3) sutures के बीच में एक छोटा सा छेद काटें. 1B चित्रा. एक 12 मिमी लंबे सिलिकॉन लेपित 6-0 (9-10mm लेपित सिलिकॉन है) ईसीए (6) में monofilament सीवन (Doccol निगम) का परिचय है, पूरी तरह से स्थायी सीवन को बाहर ईसीए में कटौती और आईसीए में occluder पलटना . सीवन रक्तस्राव को रोकने के monofilament के आसपास कसकर बंधा हुआ है और रिवर्स कार्रवाई चिमटी हटा रहे हैं. occluder विलिस के घेरे में एमसीए के मूल को रोक देना शुरू की है. ईसीए और सीसीए के विभाजन से परे 9-10 मिमी के आसपास अपनी प्रविष्टि बंद करो. occluder अवरुद्ध है और स्थानांतरित करने के लिए अब और नहीं कर सकते हैं. देखभाल लिए pterygopalatine धमनी नहीं घुसना करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. ईसीए पर सीवन (3) छूत हैhtly स्थिति में monofilament को ठीक करने के लिए बंधे. त्वचा को एक autoclip घाव समापन प्रणाली के साथ बंद करें. खारा समाधान के 1 मिलीलीटर subcutaneously इंजेक्षन और एक अवरक्त हीटिंग दीपक के तहत सभी के बाद की अवधि रोड़ा (60 मिनट) के दौरान चूहों जगह. 2. मध्यम प्रमस्तिष्क धमनी रक्त प्रवाह की बहाली Reanesthesia पहले, neuroscore सर्जरी की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए जाँच की जा सकती है. के रूप में पहले से वर्णित चूहों anesthetize और autoclips को हटा दें. थोड़ा ईसीए पर सीवन (3) खोलने के लिए monofilament वापसी और रक्त reperfusion की अनुमति. स्थायी रूप से खून की कमी को रोकने के लिए ईसीए पर अस्थायी सीवन टाई. monofilament पुन: उपयोग के लिए रखा जाता है. सीसीए पर अस्थायी (1) सीवन रक्त recirculation की अनुमति निकालें. घाव को बंद करें. चूहों के एक और 1 मिलीग्राम खारा समाधान subcutaneously प्राप्त करना चाहिए. 1 घंटा के लिए अवरक्त हीटिंग दीपक के तहत चूहों रखें. जाँच है कि पशु गतिशीलता आएगा के बाद, माउस अपने पिंजरे में वापस आ रहा है और हीटिंग पैड और 72 घंटे के लिए तौलिए के तहत छोड़ दिया. ध्यान दें कि पिंजरे का केवल आधा हीटिंग पैड पर रखा गया है करने के लिए चूहों को उनके पर्यावरण का चयन करने की अनुमति. क्योंकि शल्य चिकित्सा के बाद वजन घटाने आम तौर पर मनाया जाता है, मसला हुआ भोजन खाने को प्रोत्साहित करने के लिए एक पेट्री डिश में रखा गया है. बारह घंटे के बाद सर्जरी, चूहों buprenorphine (0.03 bwip मिलीग्राम / किग्रा) की एक और खुराक प्राप्त किया. 3. शाम ऑपरेशन नकली आपरेशन के लिए सभी प्रक्रियाओं कि occluder नहीं डाला जाता है के अलावा समान हैं. 4. Neuroscore न्यूरोलॉजिकल घाटा reperfusion के बाद और बाद में चोट की गंभीरता की डिग्री के आकलन tMCAO की सफलता के मूल्यांकन की अनुमति. स्नायविक घाटे के रूप में पहले 5 वर्णित रन बनाए हैं </> समर्थन और 1, 24, 48 और 72 घंटे के बाद reperfusion पर प्रदर्शन किया. विस्तारित छह सूत्री पैमाने पर प्रयोग किया जाता है: 0: सामान्य. 1: हल्के साथ या असंगत रोटेशन के बिना जब पूंछ द्वारा उठाया व्यवहार चक्कर लगाना, <50% contralateral ओर करने के लिए बारी बारी से करने का प्रयास कर सकते हैं. 2: हल्के चक्कर काटते सुसंगत,> 50% contralateral ओर करने के लिए बारी बारी से करने का प्रयास. 3: मजबूत सुसंगत और चक्कर काटते तत्काल, माउस 1-2 सेकंड के लिए अधिक से अधिक एक रोटेशन की स्थिति, अपनी नाक लगभग इसकी पूंछ तक पहुँचने के साथ रखती है. 4: गंभीर barreling में प्रगति रोटेशन, चलने या ठीक पलटा नुकसान. 5: अचैतन्य का या मरणासन्न. 5. Cresyl वायलेट धुंधला (2 चित्रा) पीबीएस समाधान छिड़काव के बाद, दिमाग जल्दी isopentane में जमे हुए हैं और -80 पर संग्रहीत °सी. माउस दिमाग भी 4% (पीएफए) paraformaldehyde योजना बनाई immunohistochemistry पढ़ाई पर निर्भर करता है के साथ perfused जा सकता है. राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों (17 सुक्ष्ममापी) के Cryostat कटौती प्रदर्शन कर रहे हैं. हर 30 से बाहर धारा एक ही स्लाइड पर एकत्र किया जाता है एक प्रतिनिधि मस्तिष्क चोट है. मात्रा मात्रा का ठहराव के लिए, 2 स्लाइड्स cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना और एक छवि विश्लेषण प्रणाली से दाग रहे हैं (वंशज निगम, फ्रेडरिक, एमडी) घाव का मूल्यांकन किया गया. मनमाना इकाइयों (पिक्सेल) में चोट मात्रा की गणना की गई है, और contralateral गैर lesioned क्षेत्र के प्रत्येक अनुभाग के लिए एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया. अन्य स्लाइड्स -80 डिग्री सेल्सियस पर immunohistochemistry अध्ययन के लिए रखा जाता है. वैकल्पिक रूप से, पीएफए ​​तय मस्तिष्क 30-50 सुक्ष्ममापी vibratome और रोधगलितांश मापा के रूप में हान एट अल. (2009) 6 द्वारा सिफारिश की मात्रा का उपयोग में कटौती की जा सकती है.

Representative Results

neuroscore मूल्यांकन बाद स्ट्रोक tMCAO की सफलता की पुष्टि और के बाद reperfusion tMCAO की क्षमता निर्धारित करता है. हमारे हाथ में, सभी चूहों intraluminal प्रस्तुत एक हल्के लगातार (2 neuroscore) कर्लिंग और न्यूरोलॉजिकल घाटा कम से कम 72 घंटा आम तौर पर स्थिर प्रक्रिया अधीन है. ज्यादातर चूहों एक हल्के लगातार कर्लिंग (2 neuroscore) दिखा रहे हैं. कर्लिंग के अभाव दिखा चूहे अध्ययन से बाहर रखा जाता है. हालांकि, neuroscore मूल्यांकन हमें एक घायल हिप्पोकैम्पस और एक अक्षुण्ण हिप्पोकैम्पस साथ उन के साथ चूहों के बीच भेद करने के लिए अनुमति नहीं है. कोई मृत्यु सर्जरी दिन के दौरान मनाया गया, सुझाव है कि subarachnoid हेमोरेज घटित नहीं था. Subarachnoid नकसीर एक माउस में पहचाना जाता है, यह एक व्यवस्थित विश्लेषण से बाहर रखा है. Doccol निगम, जो घर तैयार monofilaments से चिकनी है से सिलिकॉन लेपित monofilament के प्रयोग की सफलता बढ़ जाती हैtMCAO और subarachnoid हेमोरेज कम कर देता है. इस मॉडल में 24 घंटे और 72 घंटे के बीच मृत्यु दर 14% है, के रूप में आम तौर पर रोड़ा के 60 मिनट के लिए सूचना दी. मनाया मृत्यु दर शायद इस माउस तनाव में एक बड़े रोधगलितांश मात्रा के कारण है. एक मजबूत घाव reproducibility भी (मानक विचलन 15% है) देखा गया है, जो बहुत neuroprotection अणुओं जहां उनके प्रभाव (ओं) मॉडल की परिवर्तनशीलता द्वारा छिपा हो सकता है का अध्ययन दिलचस्प है. मस्तिष्क चोट के बाद tMCAO की हद तक का मूल्यांकन करने के लिए, हम cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना (2 चित्रा) टीटीसी बजाय का उपयोग क्रम में सामग्री का एक बहुत प्रासंगिक मार्करों 6 का परीक्षण करने के लिए चुना है. घाव की हद तक अपेक्षाकृत अनुरूप है. हालांकि, हमने देखा कि कुछ चूहों में हिप्पोकैम्पस (चूहों के 30% के आसपास) घायल हो गया था. यह ध्यान दें कि cresyl बैंगनी धुंधला हो 1 सप्ताह के लिए किया जा सकता है बाद में लागू करने के लिए दिलचस्प है. साहित्य में, मस्तिष्क रोधगलितांश का प्रतिशत एक से बदलताअन्य अध्ययन करने के लिए. यह माउस तनाव, संज्ञाहरण, मस्तिष्क वर्गों की मोटाई, monofilament इस्तेमाल किया, या 7 6, इस्तेमाल किया धुंधला हो जाना पसंद पर निर्भर करता है. चित्रा 1. रोड़ा के मध्य मस्तिष्क धमनी की सिलिकॉन लेपित intraluminal monofilament का उपयोग योजना. माउस मस्तिष्क और मस्तिष्क लगातार sutures और क्लिप दिखा सिलिकॉन लेपित monofilament की शुरूआत तैयार धमनियों के एक सरलीकृत योजना बी विलिस के चक्र के माध्यम से monofilament की स्थिति का प्रतिनिधित्व किया है. monofilament आईसीए में ईसीए के माध्यम से शुरू की है एमसीए एसीए, पूर्वकाल प्रमस्तिष्क धमनी के आधार रोक देना, बीए, आधारी धमनी, सीसीए, आम मन्या धमनी, सी. विलिस, विलिस के सर्किल, ईसीए, बाह्य मन्या artery, आईसीए, आंतरिक मन्या धमनी, एमसीए, मध्यम प्रमस्तिष्क धमनी, पीसीए, पीछे संवाद स्थापित करने धमनी, PPA, pterygopalatine धमनी. चित्रा 2. माउस cresyl वायलेट के साथ 72 घंटे के बाद reperfusion infarct क्षेत्र (मुख्य रूप से striatum, प्रांतस्था और आसन्न मस्तिष्क क्षेत्रों) के बाद दाग मस्तिष्क के प्रतिनिधि राज्याभिषेक वर्गों सफेद (cresyl बैंगनी से बेदाग) में दिखाई देता है. चोट मात्रा (सफेद हिस्सा, दाएँ गोलार्द्ध) सीमांकित था और contralateral गैर lesioned क्षेत्र (बाएँ गोलार्द्ध) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया.

Discussion

विभिन्न मॉडलों स्ट्रोक रोगियों में स्ट्रोक परिणाम की नकल करने के लिए विकसित किया गया है. स्ट्रोक मॉडल के पसंद जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है. intraluminal MCAO रोगियों में ischemic स्ट्रोक का सबसे आम प्रकार के मॉडल mimics और कम आक्रामक और Tamura ^4,7 मॉडल की तुलना में अधिक सुसंगत है. यह neuroprotection neurorepair, और कोशिका मृत्यु विश्लेषण के लिए एक बहुत दिलचस्प मॉडल है. intraluminal मॉडल की सफलता के जो नियंत्रित किया जा पशु लिंग, उम्र और वजन, तापमान, संज्ञाहरण और सर्जरी के समय, जैसे कई कारकों पर निर्भर करता है. occluder (टिप व्यास, लंबाई, आकार, और fexibility) शारीरिक proprieties MCAO ⁴ की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं. के साथ साथ, हम 12 मिमी लंबे 6-0 Doccol निगम 9-10 मिमी के साथ सिलिकॉन लेपित monofilament का उपयोग करें. इस monofilament के महान लाभ subarachnoid हेमोरेज को कम करने के लिए है और क्योंकि इसकी लंबाई सभी आईसीए कवरलंबाई, अवशिष्ट रक्त प्रवाह, जो विलिस और PPA सर्कल के पूर्वकाल और कूल्हों संवाद स्थापित करने धमनियों से आता रोका है और ⁸ रोधगलितांश मात्रा कम हो जाती है में परिवर्तनशीलता (हमारे हाथ में परिवर्तनशीलता के 15%). सीसीए के सिवनी भी रोधगलितांश ⁹ मात्रा की परिवर्तनशीलता घट जाती है.

मस्तिष्क की चोट निम्नलिखित tMCAO की हद तक अलग अलग तरीकों से मूल्यांकन किया जा सकता है. जैसा कि पहले उल्लेख न्यूरोलॉजिकल घाटा को मापा जा सकता है. हालांकि, यह मुश्किल है इस तरह से एक कारगर उपाय है. रोधगलितांश की हद सामान्यतः टीटीसी धुंधला हो जाना द्वारा किया जाता है. हाल ही में, चुंबकीय अनुनाद तकनीक भी, neuroprotective उपचार के लिए एक विशेष रूप से दिलचस्प तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं. अंतर्निहित सेलुलर neurorepair, कोशिका मृत्यु या सेल प्रसार जैसे स्ट्रोक में शामिल तंत्र को समझने, immunohistochemistry द्वारा विभिन्न मार्करों के अध्ययन महत्वपूर्ण और बहुत जानकारीपूर्ण है. इस प्रकार, हमारे protocमस्तिष्क अनुभाग तैयारी की राजभाषा इन विश्लेषण की अनुमति के महान लाभ है, और इस्तेमाल चूहों की संख्या कम से कम. इसके अलावा, Tureyen एट अल ¹⁰ रिपोर्ट है कि वहाँ cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना और टीटीसी के बीच अच्छे संबंध है.

Materials

Description	Company	Catalogue number
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Fiber-Light High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.
Anesthesia system for isoflurane
Isoflurane	CDMV	108737
Heating blanket	Gaymar Medsearch	TP22G
Infrared heating lamp
Ultra fine tweezers, style 5	Electron Microscopy Sciences	78320-5TI
Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight	Electron Microscopy Sciences	72932-01
Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades	Electron Microscopy Sciences	77926-5S
Negative action tweezers, style KOPINC 5	Electron Microscopy Sciences	72850-F
Dissecting scissors 5 1/2″ Straight	Cedarlane	72960
Autoclip starter set	Harvard apparatus	34-0557
BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk	Fisher	01-804-5
5-0 suture	Harvard apparatus	517763
Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture	Doccol Corporation	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14-823-2F
Needles 26G1/2	Fisher	BD-305111
C57BL/6 mice	IRCM