Summary
Bisulfite mutagenesis के डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण करने के लिए सोने के मानक है. हमारे संशोधित प्रोटोकॉल एकल कोशिका के स्तर पर डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और व्यक्तिगत oocytes के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था. यह भी दरार मंच भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1 दिन
बाँझ, जैसे GIBCO पानी आसुत जल के साथ oocyte संग्रह के दिन पर निम्नलिखित ताजा समाधान तैयार करें. डीएनए संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, दस्ताने अक्सर बदलने के लिए और फिल्टर सुझावों का उपयोग करें. ट्यूब दूर angled है जब खुला रखें, और सभी ट्यूबों संक्षिप्त नहीं जब उपयोग में. हम अनुशंसा करते हैं कि समाधान के रूप में n +1 बना रहे हैं.
3% LMP से agarose
30 मिलीग्राम कम गलनांक (LMP) agarose
1 मिलीलीटर GIBCO है एच 2 हे
70 @ भंग डिग्री सेल्सियस
Lysis समाधान
8 μl lysis बफर
1 μl proteinase कश्मीर
1 μl 10% IGEPAL है
बर्फ पर उपयोग के लिए तैयार है जब तक जगह
02:01 agarose: lysis समाधान (व्यक्ति oocyte प्रति 10 μl, राशि 3 oocytes के लिए है)
20 μl 3% LMP से agarose
10 μl lysis समाधान
70 @ मिश्रण डिग्री सेल्सियस
एसडीएस Lyबहन बफर (व्यक्तिगत oocyte प्रति 501 μl)
| 1x ते पीएच 7.5 | 450 μl |
| 10% एसडीएस | 50 μl |
| Proteinase कश्मीर | 1 μl |
| 501 μl |
1. Oocyte संग्रह
- विच्छेदित हैं M2 मीडिया में माउस oviducts प्लेस, और का आंसू ampullae मेघपुंज सेल जटिल निकालने.
- Oocytes मेघपुंज सेल जटिल 0.3 मिलीग्राम / M2 मीडिया के एक 30 μl ड्रॉप में मिलीलीटर hyaluronidase समाधान का उपयोग कर से अलग करें. समाधान में oocytes केवल के रूप में लंबे समय के रूप में यह मेघपुंज कोशिकाओं को हटा लेता है, के रूप में लंबा जोखिम उन्हें नुकसान हो सकता है रखना. 3x oocytes 30 M2 मीडिया की μl ड्रॉप में, समय समय पर मेघपुंज कोशिकाओं को हटाने धो लें.
- Zona pellucida का उपयोग अम्लीय है tyrode समाधान निकालें. एक 30 के समाधान के μl ड्रॉप में oocytes पहली जगह है, और फिर एक और 30 के हस्तांतरणμl ड्रॉप, के रूप में किसी भी मीडिया के साथ किया एसिड को कमजोर और इसकी क्षमता को कम करेगा. समाधान में oocytes केवल के रूप में लंबे समय के रूप में यह ज़ोना निकालने के लिए, के रूप में लंबा जोखिम उन्हें नुकसान हो सकता है लेता रखें. नोट: अम्लीय है tyrode समाधान या pronase है की एक वृद्धि की एकाग्रता मानव नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में मानव zona pellucida अधिक माउस से अम्लीय tyrode समाधान के साथ इलाज के लिए प्रतिरोधी है.
- M2 मीडिया के एक 30 μl ड्रॉप में एक बार से अधिक oocytes धो लें.
2. Agarose एम्बेडिंग और lysis
- Agarose एम्बेडिंग करने के लिए, एक 70 डिग्री सेल्सियस heatblock पर lysis समाधान जगह है. Lysis समाधान: सेल समाधान, एक 2:1 agarose उत्पादन में preheated LMP से agarose जोड़ें.
- कम से कम M2 के मीडिया में एक साफ गिलास स्लाइड पर एक oocyte रखें. सेल समाधान एक विंदुक टिप में, और एक खुर्दबीन के नीचे धीरे से एक छोटी राशि निष्कासित (~ 1 μl या कम) गिलास स्लाइड पर, यह एक राग के साथ मिश्रण करने के लिए अनुमति देता है: agarose की 10 μl ले लोअल मीडिया. धीरे से ऊपर विंदुक टिप में oocyte लेने के और Eppendorf ट्यूब में 300 μl खनिज तेल के साथ सभी 10 μl इतना मनका एक क्षेत्र रूपों डाल दिया.
नोट: इस प्रक्रिया agarose के रूप में काफी तेजी से किया जाना चाहिए कठोर अगर तापमान के रूप में छोटे रूप में 5 डिग्री 70 डिग्री सेल्सियस से नीचे सी बूँदें - बर्फ पर 10 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं. को सेल करने के लिए, 300 μl खनिज तेल को हटाने और एसडीएस lysis बफर के 500 μl जोड़ें. एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रातोंरात सेते हैं.
नोट: lysis समाधान (तालिका 1) भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2 दिन
निम्नलिखित bisulfite mutagenesis के दिन पर ताजा समाधान तैयार. डीएनए संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, दस्ताने अक्सर बदलने के लिए और फिल्टर सुझावों का उपयोग करें. ट्यूब दूर angled है जब खुला रखें, और सभी ट्यूबों संक्षिप्त नहीं जब उपयोग में. हम अनुशंसा करते हैं कि समाधान के रूप में n +1 बना रहे हैं.
| 3 एम NaOH | <p> 20 मिलीलीटर autoclaved DDH 2 हे में 2.4 जी NaOH|
| 0.1 एम NaOH | 14.5 मिलीग्राम autoclaved, DDH 2 हे में 0.5 3M की मिलीलीटर |
| 0.3 एम NaOH | 13.5 मिलीग्राम autoclaved, DDH 2 हे में 1.5 3M की मिलीलीटर |
2.5 एम bisulfite समाधान
- 3.8 ग्राम सोडियम bisulfite
5.5 मिलीलीटर GIBCO है आसुत एच 2 हे
1 मिलीग्राम 3 एम NaOH
@ कमरा तापमान भंग - 110 मिलीग्राम Hydroquinone
1 मिलीलीटर GIBCO है आसुत एच 2 हे
@ ° C से 90 (के लिए केवल रूप में लंबे समय के रूप में यह भंग करने लगते हैं, नियमित रूप से मिश्रण) भंग
जब पूरी तरह से भंग है, समाधान का मिश्रण (क) और (ख)
* प्रकाश * से दूर रखें
3. Bisulfite mutagenesis
- पूरी तरह से 500 μl एसडीएस lysis बफर हटाने और 300 μl खनिज तेल (~ 20 घंटे) जोड़ें. कोई lysis बफर शेष वें कमजोर होगीई agarose जब यह गर्म है और मनका और बाद के चरणों में भंग करने के लिए अतिसंवेदनशील हो जाएगा. तुरंत bisulfite mutagenesis के साथ आगे बढ़ना है, या -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिन के लिए दुकान.
- यदि लागू हो, फ्रीजर से oocytes को हटाने और पिघलना जाने (केवल जब तक agarose मनका अपेक्षाकृत पारदर्शी है). एक 90 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर 2.5 मिनट के लिए बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं जो निम्नलिखित, सेते हैं.
नोट: मिश्रण या हलचल नहीं करो, अब से 2.5 मिनट का विस्तार, या तापमान में उतार - चढ़ाव. - विकृतीकरण प्रदर्शन, खनिज तेल को हटा दें और प्रत्येक ट्यूब झटका, 1 मिलीग्राम 0.1M NaOH जोड़ने और 5-6 बार पलटना.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में 15 मिनट, inverting के हर 3-4 मिनट के लिए सेते हैं. मनका NaOH में नाव चाहिए.
- Bisulfite उपचार करने के लिए, ट्यूब धीरे स्पिन, तो NaOH हटाने और 300 μl खनिज तेल और 500 μl bisulfite समाधान जोड़ने के. 3.5 घंटे के लिए एक 50 डिग्री सेल्सियस waterbath में ट्यूब सेते हैं. * प्रकाश * से दूर रखें नोट: ऊष्मायन की लंबाई empirically ब्याज की जीन के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है.
- प्रदर्शन desulfonation, 3 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, तो खनिज तेल और bisulfite समाधान निकालने के लिए, धीरे स्पिन, और 1 मिलीलीटर 0.3 एम NaOH जोड़ें. झटका और 5-6 बार पलटना.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में 15 मिनट, inverting के हर 3-4 मिनट के लिए सेते हैं. मनका NaOH में नाव चाहिए.
- नमूने धो, 1 धीरे कताई द्वारा, तो NaOH हटाने और 1 मिलीग्राम 1x ते 7.5 पीएच जोड़ें. कमरे के तापमान (एक प्रकार के बरतन) में 5-10 मिनट के लिए हिलाओ. धीरे फिर से घुमाओ, तो 1x ते हटा दें. इस कपड़े धोने की प्रक्रिया दो बार दोहराएँ.
- 1 मिलीग्राम autoclaved DDH 2 ओ जोड़ें कमरे के तापमान (एक प्रकार के बरतन) में 5-10 मिनट के लिए हिलाओ. धीरे स्पिन, तो एच 2 ओ दूर DDH 2 हे धोने के दो बार दोहराएँ.
- सतह पर तैरनेवाला के पीएच की जाँच करें, यह पीएच 5.0 होना चाहिए. यदि अभी भी बहुत बुनियादी, एच 2 ओ के साथ फिर से धोना सभी निकालें सतह पर तैरनेवाला, छोड़ने के केवल agarose होविज्ञापन.
4. 1 सेंट और 2 एन डी दौर पीसीआर प्रवर्धन
- जबकि ** धोने 1 सेंट दौर पीसीआर मिश्रण ** तैयार
| 10 माइक्रोन आगे बाहरी प्राइमर | 0.5 μl |
| 10 माइक्रोन प्राइमर बाहरी रिवर्स | 0.5 μl |
| 240 एनजी / मिलीलीटर tRNA | 1 μl |
| एच 2 हे | 13 μl |
Illustra तैयार हो जाओ गरम प्रारंभ पीसीआर मोती जोड़ें
ध्यान से पीसीआर ट्यूब (~ 10 μl) में ठोस agarose मनका स्लाइड
70 डिग्री सेल्सियस और मिश्रण करने के लिए गर्मी
25 μl खनिज तेल जोड़ें
कुल: 50 μl
- बढ़ाना
नोट: माउस Snrpn के लिए साइकिल चालन की स्थिति का एक उदाहरण 2 मिनट के लिए 94 पर विकृतीकरण डिग्री सेल्सियस, 94 पर 30 सेकंड 40 चक्रों के बाद डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 168 मिनट डिग्री सेल्सियस, और एक अंतिम 68 में 10 मिनट बढ़ाव कदम डिग्री सेल्सियस 1 H19 माउस के लिए सेंट दौर पीसीआर और Peg3 के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तापमान एनीलिंग - 2 एन डी दौर पीसीआर मिश्रण तैयार
| 10 माइक्रोन आगे इनर प्राइमर | 0.5 μl |
| 10 माइक्रोन प्राइमर इनर रिवर्स | 0.5 μl |
| एच 2 हे | 19 μl |
Illustra तैयार हो जाओ गरम प्रारंभ पीसीआर मोती जोड़ें
5 μl एक टेम्पलेट के रूप में 1 सेंट दौर उत्पाद जोड़ें. 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट agarose नरम 1 सेंट दौर उत्पाद गर्मी. यकीन है कि खनिज तेल की परत के नीचे विंदुक.
25 μl खनिज तेल जोड़ें
कुल: 50 μl
नोट: Snrpn, H19, और Peg3 के लिए नेस्टेड प्राइमर दृश्यों बाजार में - Velker एट 10 अल में पाया जा सकता है,12.
- बढ़ाना
नोट: माउस Snrpn के लिए साइकल चलाना स्थितियों 2 मिनट के लिए 94 पर विकृतीकरण ° सी, 94 पर 30 सेकंड 40 चक्रों के बाद डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस से कम 1 मिनट और 68 से कम 1 मिनट डिग्री सेल्सियस, और एक अंतिम 10 मिनट बढ़ाव में 68 कदम 10 ° सी. माउस H19 और Peg3 की आवश्यकता होती है एक 50 डिग्री सेल्सियस तापमान के लिए 2 एन डी दौर पीसीआर annealing है. - एक नैदानिक परीक्षण के रूप में, दूसरे दौर के नमूने प्रतिबंध एंजाइम है कि मेथिलिकरण या तनाव विशिष्ट के साथ काटा जा सकता है.
| 2 एन डी दौर उत्पाद | 4 μl |
| प्रतिबंध एनजाइम | 1 μl |
| बफर | 1 μl |
| एच 2 हे | 4 μl |
- एक 8% acrylamide जेल पर पाचन उत्पादों Electrophorese. किसी भी विषम बैंड एक अधिक seque का प्रतिनिधित्व करते हैंnce के.
5. प्रादेशिक सेना क्लोनिंग और कालोनी पीसीआर
- 2 एन डी दौर उत्पाद, 70 से पहले गर्मी क्लोन ° agarose, तब सदिश Promega pGEM टी वेक्टर सिस्टम (फिशर साइंटिफिक बिल्ली A1360 #) का उपयोग में कटी घमनी को बांधना सी 1 मिनट के लिए नरम करने के लिए.
| 2 एन डी दौर पीसीआर | 1 μl |
| pGEMT - आसान वेक्टर | 1 μl |
| Ligase | 1 μl |
| एच 2 हे | 2 μl |
| 2x Ligation बफर | 5 μl |
रात भर ° सी 4 @ पीसीआर मशीन सेते हैं.
- 15 मिनट के लिए बर्फ पर सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (Zymo अनुसंधान कॉर्प बिल्ली T3009) पिघलना. 3 μl बंधाव 8 μl ई. कोलाई और बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं बंधाव प्रतिक्रिया जोड़ें.
- एक 42 डिग्री सेल्सियस waterbath में 40 सेकंड के लिए गर्मी झटका,और 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. 37 ° C पर 1 घंटे (आरंभक में) के लिए 60 μl समाज मध्यम और अंडों पर बैठना जोड़ें.
- लेग / अगर / IPTG / / Xgal amp और 37 ° रात भर सी सेते हैं थाली थाली पर प्रतिक्रिया मिश्रण के सभी रखें.
- कॉलोनी पीसीआर मिश्रण तैयार
| 20 माइक्रोन M13 फॉरवर्ड प्राइमर | 0.7 μl |
| 20 माइक्रोन M13 रिवर्स प्राइमर | 0.7 μl |
| 5X ग्रीन जाओ Taq बफर | 7.0 μl |
| 10 मिमी dNTP | 0.7 μl |
| Taq डीएनए पोलीमरेज़ | 0.28 μl |
| एच 2 हे | 25.62 μl |
| 35 μl कुल |
एक पीसीआर ट्यूब में 35 μl कालोनी पीसीआर मास्टर मिश्रण जोड़ें. थाली से एक विंदुक टिप, और यह पीसीआर प्रतिक्रिया में ज़ुल्फ़ के साथ एक सफेद बैक्टीरियल कॉलोनी उठाओ.
- 94 पर 10 मिनट के लिए विकृतीकरण साथ बढ़ाना ° सी, 94 पर 45 सेकंड 30 चक्रों के बाद डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड 57 डिग्री सेल्सियस, और 72 पर 1 मिनट डिग्री सेल्सियस, और एक अंतिम 10 मिनट 72 बढ़ाव कदम डिग्री सेल्सियस एक 1.5% agarose जेल पर 4 μl Electrophorese. ~ अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पाद के 30 μl भेजें.
नोट: oocytes के लिए, 5 कॉलोनी पीसीआर उत्पादों अनुक्रम कर रहे हैं. - एक बार अनुक्रमण परिणाम प्राप्त कर रहे हैं, मेथिलिकरण पैटर्न पढ़ा जा सकता है. किसी भी मूल तटरक्षक कि एक तटरक्षक के रूप में बना रहा methylated में किया गया था, और किसी भी मूल तटरक्षक कि अब एक टीजी unmethylated किया गया था.
6. प्रतिनिधि परिणाम
हमारे काम में, हम परख व्यक्तिगत oocytes और भ्रूण (चित्रा 1) में मेथिलिकरण अंकित है. नेस्टेड पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग bisulfite परिवर्तित प्राइमरों के बाद, यह संभव है एक agarose जेल (चित्रा 2) पर सही टुकड़ा आकार visualizing द्वारा एक सफल रूपांतरण की पुष्टि एक व्यक्ति oocyte.एक माता पिता एलील प्रतिनिधित्व करता है, और सिद्धांत रूप में, एक अंकित मेथिलिकरण पैटर्न. जैसे, दूसरे दौर पीसीआर उत्पादों unintentional संदूषण के लिए परीक्षण किया जा सकता है. एक प्रतिबंध डीएनए मेथिलिकरण (जैसे HinfI या DpnII) के लिए प्रति संवेदनशील एंजाइम को दूसरे दौर पीसीआर उत्पाद को पचाने का आकलन है कि यह एक methylated या unmethylated एलील (चित्रा 3) शामिल हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एंजाइम मान्यता अनुक्रम के भीतर एक methylated सी cleaved है, जबकि एक unmethylated सी टी में कनवर्ट किया जाता अब कोई एंजाइम द्वारा मान्यता प्राप्त है और काटा हुआ है. कोई MII oocyte दोनों methylated और unmethylated alleles युक्त नमूना, त्याग किया जाना चाहिए के रूप में यह मेघपुंज सेल संदूषण (चित्रा 3) का संकेत है. बंधाव और परिवर्तन के बाद, सफल कॉलोनी पीसीआर प्रवर्धन एक agarose जेल पर देखे जा करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए सही उत्पाद आकार के साथ नमूने अनुक्रमण के लिए भेजा जाता है (चित्रा 4) कर सकते हैं. अंत में, पांच व्यक्ति सीएल का अनुक्रमएक MII oocyte से लोगों को पांच समान मेथिलिकरण पैटर्न और समान nonCpG के रूपांतरण दर (चित्रा 5a) का उत्पादन करना चाहिए. किसी भी नमूने है कि एक से अधिक पैटर्न होते हैं (चित्रा 5 ब) त्याग किया जाना चाहिए. चूंकि ovulated MII oocytes दो गुणसूत्र प्रतियां या एक संलग्न ध्रुवीय शरीर है, वहाँ दो समान अनुक्रम पैटर्न (चित्रा 5c) प्राप्त करने के लिए एक संभावना है. हम oocytes है कि अत्यधिक भिन्न मेथिलिकरण पैटर्न मेघपुंज सेल संदूषण के बाद से इंकार नहीं किया जा सकता है discarding के डेटा की सलाह देते हैं.
चित्रा 1 एकल Oocyte bisulfite mutagenesis परख के योजनाबद्ध.
चित्रा 2. गाओ से 2 एन डी Snrpn के लिए दौर प्रवर्धन से प्रतिनिधि परिणाम1.5% agarose जेल पर ले MII oocyte. 1-4 लेन चार एकल MII oocytes हैं और 5 लेन एक नकारात्मक नियंत्रण नहीं oocyte है. Snrpn के लिए की उम्मीद amplicon आकार 420 बीपी है. एल सीढ़ी,.
चित्रा 3. 2 एन डी दौर मेथिलिकरण विशिष्ट Snrpn के लिए एक 8% acrylamide जेल पर एक MII oocyte से प्रतिबंध पाचन से प्रतिनिधि परिणाम HinfI नैदानिक प्रतिबंध पाचन unmethylated डीएनए जो एक टी है कि प्रतिबंध साइट समाप्त बंदरगाहों (420bp, लेन 1) से पता चलता है. या डीएनए methylated जो मान्यता साइट के भीतर सी (कट, 262, 103, और 54 बीपी, 2 लेन). पाचन दोनों methylated और unmethylated प्रतिबंध एंजाइम साइटों (कटौती और काटा हुआ बैंड, 3 लेन) दिखा मेघपुंज सेल संदूषण का संकेत कर रहे हैं. एल सीढ़ी,.
चित्रा 4. Snrpn के लिए एक 1.5% agarose जेल पर एक MII oocyte से पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रतिनिधि परिणाम. की उम्मीद amplicon आकार pGEM टी आसान वेक्टर में Snrpn के ligation के बाद और M13 आगे का उपयोग और रिवर्स प्राइमरों 656 बीपी है. 1-8 लेन 1-8 क्लोन से amplicons. 5 क्लोन एक गलत amplicon के आकार है और अनुक्रमण के लिए नहीं भेजा जाना चाहिए.
चित्रा 5 प्रतिनिधि एक एकल MII oocyte से Snrpn के लिए परिणाम अनुक्रमण Snrpn. Oocytes में methylated में है. काले हलकों methylated CpGs संकेत मिलता है. सफेद हलकों unmethylated CpGs से संकेत मिलता है. CPG संख्या और नियुक्ति एक बी -6 तनाव महिला माउस के लिए प्रतिनिधि है. ) एक एकल MII oocyte से Snrpn के परिणाम अनुक्रमण की उम्मीद है. केवल डीएनए के एक एकल भूग्रस्त सभी पांच क्लोन में बढ़ाना चाहिए. एक एकल मेथिलिकरण पैटर्न और समान रूपांतरण गैर CPG गपशप के साथ oocytesn विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए (प्रतिशत गैर CpGs के रूपांतरण सही करने के लिए गैर CPG कुल गैर - CPG cytosines के एक प्रतिशत के रूप में थिमाइन परिवर्तित cytosines की संख्या के रूप में गणना संकेत दिया गया था). ख) और मेघपुंज सेल संदूषण के साथ एक एकल MII oocyte से Snrpn के लिए अनुक्रमण परिणाम. नोट: मेथिलिकरण राज्यों और रूपांतरण पैटर्न कई किनारा प्रवर्धन का संकेत के बीच विषमता है. ग) दोनों गुणसूत्र प्रतियां या ध्रुवीय शरीर समावेश के साथ एक एकल MII oocyte से Snrpn के परिणाम अनुक्रमण.
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Discussion
इस एक oocyte परख के एक संख्या के साथ कई कदम है कि महत्वपूर्ण हैं और विशेष देखभाल की आवश्यकता होती हैं. पहले oocyte धोने है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है प्रत्येक oocyte ताजा मध्यम में कई बार hyaluronidase उपचार के लिए संभव के रूप में कई मेघपुंज कोशिकाओं के रूप में दूर धोने के बाद बूँदें. इसके अलावा, जब zona pellucida हटाने के लिए अम्लीय tyrode समाधान oocytes स्थानांतरित करने लगता है मध्यम आसपास मेघपुंज कोशिकाओं की स्पष्ट है. oocyte ज़ोना हटाने के बाद बहुत चिपचिपा है, और किसी भी आसपास मेघपुंज कोशिकाओं को आसानी से oocyte के लिए अटक हो सकता है. यह बहुत मुश्किल है एक मेघपुंज सेल कि oocyte ज़ोना मुक्त करने के लिए अटक गया है हटाने. हालांकि यह प्रोटोकॉल बाद में समय अंक पर मेघपुंज सेल संदूषण का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, यह रचनात्मक है, और न ही किफायती नहीं है oocytes है कि संभावना खारिज कर दिया जाएगा पर पूरा प्रोटोकॉल से गुजरना है.
दूसरा महत्वपूर्ण कदम oocyte एम्बेडिंग है. जब agarose और LYS में में oocyte एम्बेडसमाधान है, यह महत्वपूर्ण है कि कम पिघलने बिंदु (LMP) 5 ° 70 से नीचे सी डिग्री सेल्सियस के रूप में छोटे रूप में तापमान में agarose कड़ा नोट जैसे, हम agarose और 70 में lysis समाधान डिग्री सेल्सियस मिश्रण करने की सलाह देते हैं, और तब न्यूनतम मध्यम में गिलास स्लाइड पर व्यक्तिगत oocyte दे. एक बार तैयार, पिपेट agarose / lysis समाधान और तैयार Eppendorf ट्यूब में एक सावधान अभी तक समय पर ढंग में खनिज तेल के तहत oocyte एम्बेड.
यह महत्वपूर्ण है कि proteinase कश्मीर की गर्मी निष्क्रियता 90 ° C 2.5 मिनट के लिए प्रदर्शन किया. इस से विचलन नहीं की सिफारिश की है. उच्च तापमान या अब समय के डीएनए को नुकसान पहुंचा है, जबकि कम तापमान या कम बार proteinase लालकृष्ण निष्क्रिय नहीं हो सकता है हो सकता है
एक अनुस्मारक के रूप में, सोडियम bisulfite और उदकुनैन के संवेदनशील प्रकाश कर रहे हैं. समाधान तैयार है और फिर पन्नी में लिपटे होना चाहिए, ट्यूब एम्बर और / या का उपयोग करें जब तक अंधेरे दराज में रखा. एक बार bisulfite समाधान के लिए जोड़ा गया हैवह ट्यूब, ट्यूब पन्नी या एक अंधेरे कवर बैग के साथ कवर किया जाना चाहिए, जब यह 50 डिग्री सेल्सियस पर incubating के हम जीई हेल्थकेयर से खाली पन्नी थैलियों कि मूल रूप से गर्म शुरू पीसीआर मोती निहित का उपयोग करें.
अंत में, सबसे अधिक PCRs साथ के रूप में, हम एक समय पर ढंग में प्रत्येक दौर की तैयारी करने की सलाह देते हैं. 70 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के बाद विशेष रूप से अत्यधिक देरी, प्रवर्धन की सफलता दर कम हो जाएगा.
वर्तमान समय में, प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि bisulfite परिवर्तित व्यक्तिगत oocytes से डीएनए प्रवर्धन की सफलता दर 40% से 65% टुकड़ा प्रवर्धित जीन पर निर्भर करता है पर्वतमाला. जबकि अतिरिक्त परेशानी - शूटिंग इस प्रतिशत में वृद्धि हो सकती है, वहाँ एक bisulfite रूपांतरण उपचार बहुत लंबा है या कठोर और पर्याप्त रूपांतरण दर (85-90%) नहीं होने के बीच एक व्यापार बंद है. एक दूसरी सीमा है कि वर्तमान में bisulfite mutagenesis के दमनकारी 5 मिथाइलसिटोसाइन और demethylation 5 लुका मध्यवर्ती के बीच भेद नहीं कर सकते13 droxymethylcytosine.
कई संशोधनों के जीन या हित के क्षेत्र के आधार पर की आवश्यकता हो सकती है. bisulfite रूपांतरण समय सबसे कम डीएनए की क्षति के साथ उच्चतम रूपांतरण प्रतिशत के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. हम bisulfite उपचार के लिए 2.5 से 4 घंटे की एक सीमा (आधा घंटे की वेतन वृद्धि) की सलाह देते हैं. आगे अनुकूलन शामिल कर सकते हैं ब्याज की परिवर्तित दृश्यों (उदाहरण के लिए के लिए पीसीआर प्रथम डिजाइन http://www.urogene.org/methprimer/ ), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीसीआर कार्यक्रमों का अनुकूलन टुकड़ा लंबाई और तटरक्षक सामग्री (पैटरसन एट अल देखने के लिए है पर आधारित है. अतिरिक्त bisulfite mutagenesis के अनुकूलन 7 विकल्प). एक अंतिम संशोधन 2 एन डी दौर पीसीआर उत्पाद की कि जेल निष्कर्षण है अगर वहाँ प्रचुर मात्रा में प्राइमर dimers या गैर विशिष्ट amplicons के वेक्टर में एकीकृत जब क्लोन की आवश्यकता हो सकती है.
हम पहले कि यह पता चला हैप्रोटोकॉल से व्यक्ति MII oocytes के लिए प्रभावी है 12. हम भी बढ़ती oocytes पर परिवर्तित डीएनए के सफल प्रवर्धन के एक ही दर के साथ अलग oocyte व्यास की एक श्रृंखला में अपनी क्षमता का परीक्षण,. महत्वपूर्ण बात, अन्य bisulfite mutagenesis के प्रक्रियाओं, जो एक व्यक्ति के सेल पर मेथिलिकरण अध्ययन के लिए प्रभावशाली नहीं हैं की तुलना में, इस प्रोटोकॉल व्यक्तिगत oocytes और जल्दी भ्रूण के डीएनए मेथिलिकरण के विश्लेषण में सक्षम बनाता है. यह प्रजनन और विकास जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से के रूप में यह जर्म कोशिकाओं और जल्दी भ्रूण के जोड़तोड़ से संबंधित है. भविष्य अनुप्रयोगों में vivo व्युत्पन्न और संवर्धित कोशिकाओं में शामिल किसी भी मूल के एकल कक्षों में डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न के विश्लेषण शामिल हो सकते हैं. इसके अतिरिक्त, हम एक व्यक्ति ब्लास्टोसिस्ट परख है कि एक ही भ्रूण से डीएनए और आरएनए ठीक विकसित किया है, दोनों अभिव्यक्ति और मेथिलिकरण डेटा प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. एक भविष्य आवेदन singl संशोधित शामिलई oocyte परख अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए शाही सेना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मेथिलिकरण assays के लिए डीएनए को ठीक करने के लिए. एक और अनुकूलन करने के लिए एक ही oocyte के लिए द्वैध assays, अल हज एट 14 अल समान, कि मेथिलिकरण का पता लगाने के लिए एक somatically methylated, oocyte भ्रूण unmethyated जीन की अनुमति है, जिससे मेघपुंज सेल संदूषण का पता लगाने की अनुमति प्रदर्शन होगा.
डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण जीनोम चौड़ा से ठिकाना विशेष रेंज कर सकते हैं. जैसे प्रोटीन के साथ संयोजन के रूप में डीएनए methylated immunoprecipitation (MeDIP) या अनुक्रमण जीनोम चौड़ा तरीकों आमतौर पर सामग्री की प्रचुर मात्रा की आवश्यकता होती है. ठिकाना विशिष्ट तरीके कि संयुक्त bisulfite प्रतिबंध (कोबरा) विश्लेषण मेथिलिकरण विशिष्ट एंजाइमों प्रतिबंध का उपयोग, या MethylDetector किट (सक्रिय आकृति), शामिल एक ब्लास्टोसिस्ट विश्लेषण के लिए इष्टतम से कम कर रहे हैं, डीएनए, पीसीआर पूर्वाग्रह की कमी की अपर्याप्त वसूली में जिसके परिणामस्वरूप reproducibility के. एकल oocyte और ई के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोणआर्ली भ्रूण मेथिलिकरण विश्लेषण एक सीमित कमजोर पड़ने 14 तकनीक pyrosequencing bisulfite साथ ईज़ी डीएनए मेथिलिकरण किट (Zymo रिसर्च) का उपयोग किया है, हालांकि रिपोर्ट bisulfite परिवर्तित डीएनए प्रवर्धन की सफलता दर से विधि यहाँ वर्णित कम था.
Bisulfite mutagenesis के डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण करने के लिए सोने के मानक है, और यह स्पष्ट है कि एकल कक्षों के विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम आगे है. Agarose एम्बेडिंग छोटा नमूना आकार bisulfite उपचार के साथ विश्लेषण किया जा परमिट, के रूप में agarose डीएनए गिरावट के खिलाफ की रक्षा और कई प्रोटोकॉल चरणों के दौरान डीएनए नुकसान से बचाता है. हालांकि, जब ब्लास्टोसिस्ट की तुलना में, एक एकल oocyte जीनोमिक डीएनए के लगभग 3-6 स्नातकोत्तर है. हमारे संशोधित प्रोटोकॉल, जो agarose युक्त lysis बफर में एक oocytes एम्बेड करता प्रारंभिक lysis कदम और कठोर bisulfite उपचार नरमपंथियों में डीएनए नुकसान शुरुआत से बचाता है. सारांश में, एकल oocyte विश्लेषण का लाभ यह है कि यह अनुमति देता हैअनजाने मेघपुंज सेल संदूषण का पता लगाने के रूप में दुर्लभ घटनाओं unmasking और जमा नमूने में किसी भी पीसीआर पूर्वाग्रहों को नष्ट करने के रूप में अच्छी तरह से. कुल मिलाकर, इस संशोधित प्रोटोकॉल व्यक्तिगत oocytes और जल्दी भ्रूण के मेथिलिकरण राज्य पर डेटा की गुणवत्ता प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम में विश्वविद्यालय वेस्टर्न ओंटारियो, प्रसूति एवं स्त्री रोग विभाग के द्वारा समर्थित किया गया था, और एक अनुदान Ministryof अनुसंधान और नवाचार, जल्दी शोधक पुरस्कार से ER06-02-188. एमडी प्रजनन, जल्दी विकास और स्वास्थ्य (REDIH) ग्रेजुएट छात्रवृत्ति पर प्रभाव में CIHR ट्रेनिंग प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
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