Summary
Hydrogensulfit mutagenese er den gyldne standard for analyse af DNA methylering. Vores modificeret protokol giver mulighed for at DNA-methylering analyse på enkelt-celle niveau, og er specielt designet til individuelle oocytter. Det kan også anvendes til spaltning-embryoer.
Abstract
Epigenetik omfatter alle arvelige og reversible ændringer af kromatin, der ændrer gen tilgængelighed, og dermed er de primære mekanismer til at regulere gentranskription 1. DNA methylering er en epigenetisk modifikation, der fungerer overvejende som en undertrykkende mærke. Gennem den kovalente addition af en methylgruppe på cytosiner i CpG-dinukleotider, kan det rekruttere yderligere undertrykkende proteiner og histon modifikationer til at indlede processer involveret i kondenserende chromatin og silencing gener 2. DNA metylering er essentiel for normal udvikling som den spiller en kritisk rolle i udviklingsmæssige programmering, celledifferentiering, undertrykkelse af retrovirale elementer, X-kromosom inaktivering og genomisk prægning.
En af de mest effektive metoder til DNA-methylering analyse bisulfit mutagenese. Natriumbisulfit er en DNA mutagen som deaminerer cytosiner i uraciler. Efter PCR-amplifikation og seque ncing, er disse konvertering begivenheder registreret som thyminer. Denatureret cytosinerne er beskyttet mod deaminering og dermed forblive som cytosinerne, muliggør identifikation af DNA methylering på det enkelte nukleotid niveau 3. Udvikling af bisulfit mutagenese assayet er frem fra de oprindeligt rapporterede 4-6 til dem, der er mere følsomme og reproducerbare 7. Et centralt avancement blev indlejre mindre mængder af DNA i en agaroseperle, og derved beskytte DNA fra den barske behandling med bisulfit 8. Dette aktiveret methylering analyse, der skal udføres på puljer af oocyter og blastocyst-stadie embryoner 9. Den mest avancerede hydrogensulfit mutagenese protokol til dato er for de enkelte blastocyst-embryoer 10. Men da blastocyster har i gennemsnit 64-celler (indeholdende 120-720 pg genomisk DNA), er denne fremgangsmåde ikke effektiv til methylering undersøgelser individuelle oocytter eller spaltning embryoer.
telt "> tage spor fra agarose indlejring af små DNA-mængder, herunder oocytter 11, her præsenterer vi en metode, hvor oocyter er direkte indlejret i en agarose og lysis løsning perle umiddelbart efter hentning og fjernelse af zona pellucida fra oocyt. Det gør os i stand til at omgå de to vigtigste udfordringer i en enkelt oocyt hydrogensulfit mutagenese:. beskytter et minut mængde af DNA fra nedbrydning og efterfølgende tab i løbet af de mange protokoller trin vigtigt, da data er indhentet fra enkelte oocyter, er spørgsmålet om PCR skævhed i pools elimineret Endvidere. , utilsigtet Cumulus celle forurening er påviselig ved denne metode, da enhver prøve med mere end en methylering mønster kan udelukkes fra analyse 12. Denne protokol giver en forbedret metode til succesfulde og reproducerbar analyser af DNA methylering på enkelt-celle niveau og er ideel individuelle oocytter samt spaltning embryoer.Protocol
DAG 1
Forbered følgende løsninger friske på dagen for ægudtagning med sterilt, destilleret vand såsom GIBCO vand. For at reducere risikoen for DNA forurening, skifte handsker ofte og bruger filter tips. Holde rørene vinklet væk når den er åben, og opsummere alle rør, når den ikke er i brug. Vi anbefaler, at løsninger er lavet som n +1.
3% LMP-agarose
30 mg lavt smeltepunkt (LMP) Agarose
op til 1 ml GIBCO H2O
opløse @ 70 ° C
Lyseopløsning
8 pi lysisbuffer
1 pi proteinase K
1 pi 10% IGEPAL
anbring på is indtil klar til brug
02:01 Agarose: Lysis Solution (10 gl per person oocyt, beløbet er for 3 oocyter)
20 pi 3% LMP-agarose
10 ul lyseopløsning
Bland @ 70 ° C
SDS Lysis Buffer (501 gi pr person oocyt)
| 1x TE pH 7,5 | 450 ul |
| 10% SDS | 50 pi |
| Proteinase K | 1 pi |
| 501 ul |
1. Ægudtagning
- Placer de dissekerede musen æggelederne i M2 medier og rive ampuller til at udtrække Cumulus cellen kompleks.
- Adskille oocytter fra cumulus cellen komplekset med 0,3 mg / ml hyaluronidase opløsning i en 30 ul dråbe M2 medier. Hold oocytter i opløsning, så længe det tager at fjerne de cumulusceller, da langvarig udsættelse kan beskadige dem. Vaske oocyterne 3x i 30 ul dråbe M2 medium, fjernelse cumulusceller periodisk.
- Fjerne zona pellucida ved hjælp sur Tyrodes opløsning. Placer oocytter i en 30 gl dråbe løsning først, og derefter overføre til en anden 30gl drop, som ethvert medie, der sammen vil udvande syre og reducere dens effektivitet. Hold oocytter i opløsning, så længe det tager at fjerne zona, da langvarig udsættelse kan beskadige dem. Bemærk: en forøget koncentration af sure Tyrodes opløsning eller pronase kan anvendes til humane prøver, som den menneskelige zona pellucida er mere resistente over for behandling med en sur Tyrodes opløsning end mus.
- Vaske oocyterne igen i en 30 ul dråbe M2 medier.
2. Agarose Embedding og Lysis
- For at udføre agarose indlejring, skal du placere lyse løsning på en 70 ° C heatblock. Tilsæt forvarmede LMP-agarose til lyseopløsning, der producerer et 2:1 agarose: lyseopløsning.
- Placere en enkelt oocyt på en ren glasplade i minimale M2 medium. Fylder 10 ul af agarose: lyseopløsning til en pipettespids, og (under et mikroskop) forsigtigt udvise en lille mængde (ca. 1 pi eller mindre) på objektglasset, som gør det muligt at blande med Minimal medier. Forsigtigt afhente oocytten i pipettespidsen, og lægge alle 10 ul i et Eppendorf-rør med 300 gl mineralolie, således at vulsten danner en kugle.
Bemærk: Denne proces skal ske forholdsvis hurtigt som agarosen hærder, hvis temperaturen falder så lidt som 5 ° C under 70 ° C. - Inkuber røret på is i 10 minutter. For at udføre lysering fjerne 300 pi mineralolie, og der tilsættes 500 pi SDS lysisbuffer. Inkuber natten over i et 50 ° C vandbad.
Bemærk: lyseopløsning (tabel 1) kan også anvendes til dette formål.
DAG 2
Fremstille de følgende opløsninger friske på dagen bisulfit mutagenese. At reducere risikoen for DNA-kontaminering, ændre handsker ofte og anvende filter spidser. Holde rørene vinklet væk når den er åben, og opsummere alle rør, når den ikke er i brug. Vi anbefaler, at løsninger er lavet som n +1.
| 3 M NaOH | <td> 2,4 g NaOH i 20 ml autoklaveret DdH 2 O|
| 0,1 M NaOH | 0,5 ml 3 M i 14,5 ml autoklaveret ddH2O |
| 0,3 M NaOH | 1,5 ml 3 M i 13,5 ml autoklaveret ddH2O |
2,5 M bisulfitopløsning
- 3,8 g natriumbisulfit
5,5 ml GIBCO destilleret H2O
1 ml 3 M NaOH
opløses @ stuetemperatur - 110 mg hydroquinon
1 ml GIBCO destilleret H2O
opløse @ 90 ° C (kun så længe det tager at opløse, blande regelmæssigt)
Når den er fuldt opløst, bland opløsningen (a) og (b)
* Hold væk fra lys *
3. Hydrogensulfit Mutagenese
- Fuldt fjerne 500 pi SDS-lysis-buffer, og der tilsættes 300 pi mineralolie (~ 20 timer). Enhver lysepuffer resterende vil fortynde the agarose, når det opvarmes, og vulsten vil være mere modtagelige for opløsning i de efterfølgende trin. Fortsæt med hydrogensulfit mutagenese straks, eller opbevares ved -20 ° C i op til 5 dage.
- Hvis det er relevant, fjerne oocyter fra fryseren og lad tø (kun indtil agaroseperle er forholdsvis gennemsigtig). Inkuber i 2,5 minutter på en 90 ° C varmeblok, hvorefter Inkuber på is i 10 minutter.
Bemærk: Du må ikke blande eller røre, strække længere end 2,5 minutter, eller svinger temperaturen. - For at udføre denaturering, fjerne mineralsk olie og tilsæt 1 ml 0,1 M NaOH til hvert rør, svirp og vend 5-6 gange.
- Inkuber i 15 minutter i et 37 ° C vandbad inverterende hver 3-4 minutter. Perlen bør flyde i NaOH.
- For at udføre behandling med bisulfit, drej røret forsigtigt, og fjern derefter NaOH og tilsæt 300 gl mineralolie og 500 pi bisulfitopløsning. Inkuber røret i 3,5 timer i et 50 ° C vandbad. * Holdes væk fra lys * Bemærk: Længde af inkubation muligvis bestemmes empirisk for genet af interesse.
- For at udføre desulfonation, inkuberes på is i 3 minutter, derefter fjerne mineralsk olie og bisulfitopløsning, spin forsigtigt, og der tilsættes 1 ml 0,3 M NaOH. Flick og vendes 5-6 gange.
- Inkuber i 15 minutter i et 37 ° C vandbad inverterende hver 3-4 minutter. Perlen bør flyde i NaOH.
- Vask prøverne, ved først at spinde forsigtigt, fjerner derefter NaOH og der tilsættes 1 ml 1x TE pH 7,5. Omrystes i 5-10 minutter ved stuetemperatur (på et rysteapparat). Spin forsigtigt igen, og fjern derefter 1x TE. Gentag denne vaskeproces to gange.
- Tilsæt 1 ml autoklaveret DdH 2 O. Omrystes i 5-10 minutter ved stuetemperatur (på et rysteapparat). Spin forsigtigt, derefter fjerne H 2 O. Gentage ddH2O vask to gange.
- Kontrollere pH af supernatanten, og det bør være pH 5,0. Hvis der stadig for grundlæggende, vask igen med H 2 O. Fjern al supernatanten, så kun agarose væreannonce.
4. 1 st og 2 nd Round PCR-amplifikation
- Forbered 1 m runde PCR-blanding ** mens vask **
| 10 uM Primer fremad Ydre | 0,5 gl |
| 10 uM Primer Reverse Ydre | 0,5 gl |
| 240 ng / ml tRNA | 1 pi |
| H2O | 13 gl |
Tilføj til Illustrationerne Klar-til-Go Hot Start PCR-perler
Forsigtigt skubbe den faste agaroseperle i PCR-rør (~ 10 ul)
Opvarm til 70 ° C og blandes
Tilsættes 25 ul mineralolie
Totalt: 50 pi
- Amplify
Bemærk: Et eksempel på cyklusbetingelser for mus Snrpn er denaturering i 2 minutter ved 94 ° C efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 1 minut ved 50 ° C, og enminut ved 68 ° C, og endelig 10 minutter forlængelse trin ved 68 ° C. Annealingstemperatur for 1. runde PCR for muse H19 og Peg3 er 50 ° C. - Forberede 2. runde PCR-blanding
| 10 uM Primer fremad Inner | 0,5 gl |
| 10 uM Primer Reverse Inner | 0,5 gl |
| H2O | 19 gl |
Tilføj til Illustrationerne Klar-til-Go Hot Start PCR-perler
Tilsættes 5 ul 1. runde produkt som en skabelon. Opvarm 1. rundt produkt til 70 ° C i 1 minut for at blødgøre agarose. Vær sikker på at pipettere under laget af mineralolie.
Tilsættes 25 ul mineralolie
Totalt: 50 pi
Note: Indlejrede Primersekvenserne for Snrpn, H19, og Peg3 kan findes i Market-Velker et al 10,12.
- Amplify
Bemærk: cyklusbetingelser for muse Snrpn er denaturering i 2 minutter ved 94 ° C efterfulgt af 40 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 1 minut ved 50 ° C, og 1 minut ved 68 ° C, og endelig 10 minutter brudforlængelse trin ved 68 ° C 10. Mus H19 og Peg3 kræver en 50 ° C annealing temperatur 2. runde PCR. - Som en diagnostisk test, kan den anden runde prøver skæres med et restriktionsenzym som er methylering-eller stamme-specifik.
| 2 nd Runde produkt | 4 gl |
| Restriktionsenzym | 1 pi |
| Buffer | 1 pi |
| H2O | 4 gl |
- Elektroforese fordøjelsesprodukterne på en 8% acrylamidgel. Eventuelle heterogene bands repræsenterer mere end en sequence.
5. TA Cloning og koloni-PCR
- At klone 2. runde produkt først opvarmes til 70 ° C i 1 minut for at blødgøre agarose og derefter liger i vektoren under anvendelse af Promega pGEM-T-vektorsystem-(Fisher Scientific Cat # A1360).
| 2 nd Runde PCR | 1 pi |
| pGemT-EASY vektor | 1 pi |
| Ligase | 1 pi |
| H2O | 2 ul |
| 2x ligeringspuffer | 5 ul |
Inkuber natten over ved 4 ° C i PCR maskine.
- Optø kompetente E. coli-celler på is i 15 minutter (Zymo Research Corp Cat # T3009). Tilsæt 3 pi Ligeringsreaktionen til 8 pi E.coli og inkuberes ligering på is i 15 minutter.
- Varmechok i 40 sekunder i et 42 ° C vandbad,og inkuberes på is i 2 minutter. Tilsættes 60 pi SOC medium og inkuberes ved 37 ° C i 1 time (i rysteapparat).
- Anbring hele reaktionsblandingen på en LB / agar / IPTG / Xgal / Amp plade og inkuber plade ved 37 ° C natten over.
- Forberede koloni PCR-blanding
| 20 uM M13 fremad-primer | 0,7 gl |
| 20 uM M13 Reverse Primer | 0,7 gl |
| 5X Green Go Taq Buffer | 7,0 gl |
| 10 mM dNTP | 0,7 gl |
| Taq DNA-polymerase | 0,28 gl |
| H2O | 25,62 gl |
| 35 pi alt |
Tilsæt 35 ul koloni-PCR master-blanding ind i et PCR-rør. Vælge et hvidt bakteriekoloni fra pladen med en pipettespids, og hvirvel det i PCR-reaktionen.
- Amplificere med denaturering i 10 minutter ved 94 ° C, efterfulgt af 30 cykler af 45 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 57 ° C, og 1 minut ved 72 ° C, og endelig 10 minutter forlængelse ved 72 ° C. Elektroforese 4 gl af en 1,5% agarosegel. Sende ~ 30 ul PCR-produktet til sekventering.
Bemærk: For-oocytter, er 5 koloni-PCR produkter sekventeres. - Når sekventering resultater opnås, kan mønstre for methylering læses. Enhver original CG, der forblev som en CG blev methyleret, og alle originale CG, der nu er en TG blev umethylerede.
6. Repræsentative resultater
I vores arbejde, præget vi analysen methylering i individuelle oocytter og embryoner (figur 1). Efter nested PCR-amplifikation under anvendelse bisulfit omdannet primere, er det muligt at bekræfte en konvertering ved visualisering af et korrekte fragment størrelse på en agarosegel (fig. 2). En individuel oocytrepræsenterer en parental allel, og i teorien en påtrykt methylering mønster har. Som sådan kan den anden runde PCR-produkter undersøges for utilsigtet kontaminering. Et restriktionsenzym følsomme over for methylering af DNA (f.eks HinfI eller DpnII) kan anvendes til at fordøje den anden runde PCR-produktet for at vurdere, om den indeholder en methyleret eller ikke-methyleret allel (figur 3). En methyleret C i enzymet genkendelsessekvens spaltes under en ikke-methyleret C, omdannes til T ikke længere genkendes af enzymet og er uskåret. Enhver MII oocytter prøve indeholdende både methylerede og ikke-methylerede alleler skal kasseres, da det er en indikation af cumulus celle kontaminering (figur 3). Efter ligering og transformation, kan vellykket koloni-PCR-amplifikation visualiseres på en agarosegel for at sikre prøverne med den korrekte produktstørrelsen sendes til sekventering (fig. 4). Endelig sekvensen af fem individuelle cldem fra en MII oocyt skal producere fem identiske methylering mønstre og identiske nonCpG konverteringsfrekvenser (figur 5a). Eventuelle prøver, der indeholder mere end et mønster bør kasseres (fig. 5b). Idet ovulerede MII oocytter har to kromosom kopier eller en vedhæftet pollegeme, er der mulighed for at opnå to tilsvarende sekvens mønstre (figur 5C). Vi anbefaler at frasortere data fra oocyter, der har meget uens methylering mønstre siden cumulus celler forurening ikke kan udelukkes.
Figur 1. Skematisk af det indre oocyt hydrogensulfit Mutagenese analysen.
Figur 2. Repræsentative resultater fra 2 anden runde forstærkning for Snrpn fra en sangle MII oocytter på en 1,5% agarosegel. Bane 1-4 er fire enkelte MII oocytter og bane 5 er en negativ kontrol (ingen oocyt). Forventede amplikon størrelse til Snrpn er 420 bp. L, stigen.
Figur 3. Repræsentative resultater fra 2. runde methylering-specifik restriktionsfordøjelse for Snrpn fra en enkelt MII oocytter på en 8% acrylamidgel. HinfI diagnostisk restriktionsskæring viser ikke-methyleret DNA, som huser et T, der afskaffer restriktionssite (420bp, bane 1) eller methyleret DNA, som indeholder en C under genkendelsessted (cut, 262, 103 og 54 bp, bane 2). Fordøjelse viser både denatureret og ikke-methyleret restriktionsenzymsteder (afskæring og uskåret bånd, bane 3) er indikativ for Cumulus celle kontaminering. L, stigen.
Figur 4. Snrpn fra en enkelt MII oocytter på en 1,5% agarosegel. Forventede amplikon størrelse efter ligering af Snrpn ind i pGEM-T Easy vektor og under anvendelse af M13 fremad-og revers-primere er 656 bp. Bane 1-8, ampliconer fra kloner 1-8. Klon 5 har en forkert amplikonstørrelse og skal ikke sendes til sekventering.
Figur 5 Repræsentative sekventering resultater Snrpn fra en enkelt MII oocyt. Snrpn methyleres i oocytter. Sorte cirkler indikerer methylerede CpG'er. Hvide cirkler indikerer umethylerede CpG'er. CpG antallet og placeringen er repræsentant for en B6 belastning hunmus. a) Forventede sekventering resultater Snrpn fra en enkelt MII oocytter. Kun en enkelt streng af DNA bør amplificere alle fem kloner. Oocytter med en enkelt methylering mønster og identiske ikke-CpG omdannelse pattern bør indgå i analyser (procent omdannelse af ikke-CpG'er angivet til højre blev beregnet som antallet af ikke-CpG cytosinerne konverteret til thymin som en procentdel af de samlede ikke-CpG cytosinerne). b) Sekventering resultater for Snrpn fra en enkelt MII oocyt med cumulus celler forurening. Bemærk den manglende lighed mellem methylering og ombygning mønstre tyder på dissemineret streng forstærkning. c) Sekventering resultater for Snrpn fra en enkelt MII oocyt med begge kromosom kopier eller pollegeme integration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne ene oocyt analysen indeholder mange trin med et nummer, der er kritiske og kræver særlig pleje. Den første er oocyt vask. Det er især vigtigt at vaske hver oocyt flere gange i frisk medium falder efter hyaluronidase behandling for at fjerne så mange cumulusceller som muligt. Endvidere, når der overføres oocytterne til sur Tyrodes opløsning zona pellucida fjernelse sørge omgivende medium er fri af cumulusceller. Den oocyt er meget klistret efter zona fjernet, og eventuelle omkringliggende cumulusceller kan let blive holdt sig til ægget. Det er meget vanskeligt at fjerne en cumulus celle, der er fastgjort til en zona-frie oocyt. Mens denne protokol giver mulighed for påvisning af Cumulus celle forurening på senere tidspunkter, er det ikke konstruktivt, eller økonomisk, til at gennemgå den fulde protokollen om oocyter, som sandsynligvis vil blive kasseret.
Det andet afgørende skridt er oocyt indlejring. Når indlejring af oocytten i agarose og Lyser opløsning, er det vigtigt at bemærke, at lavt smeltepunkt (LMP) agarose vil hærde ved temperaturer så lidt som 5 ° C under 70 ° C. Som sådan anbefaler vi blanding af agarose og lysis opløsning ved 70 ° C, og derefter anbringe den enkelte oocytten på objektglasset i minimalt medium. Når det er klart, pipette agarose / lyseopløsning og indlejre oocytten i en forberedt eppendorfrør under mineralsk olie i en omhyggelig endnu rettidigt.
Det er kritisk, varmeinaktivering af proteinase K udføres ved 90 ° C i 2,5 minutter. Afvigelse fra dette kan ikke anbefales. Højere temperaturer og længere tider kan beskadige DNA'et, mens lavere temperaturer eller kortere tider ikke kan inaktivere proteinase K.
Som en påmindelse, er natriumhydrogensulfit og hydroquinon lysfølsom. Løsninger skal være parat og derefter pakket ind i folie, gule rør og / eller placeret i en mørk skuffe indtil brug. Når den bisulfit opløsningen er blevet tilsat til tHan rør, bør røret være dækket med folie eller et mørkt dækket pose ved inkubering ved 50 ° C. Vi bruger tomme folieposer fra GE Healthcare, der oprindeligt indeholdt de varme start-PCR-perler.
Endelig, som med de fleste PCR, anbefaler vi at forberede hver runde i tide. Urimelige forsinkelser, især efter blanding ved 70 ° C, vil reducere succesrate på forstærkning.
På nuværende tidspunkt, er en begrænsning af den protokol, at den succesrate af bisulfit omdannet DNA-forstærkning fra individuelle oocyter svinger fra 40% til 65% afhængigt af genet forstærkede fragment. Mens yderligere fejlfinding kan øge denne andel, der er et trade-off mellem hydrogensulfit omdannelsen behandlingen er for lang eller hård, og ikke har tilstrækkelige omregningskurser (> 85-90%). En anden begrænsning er, at tiden bisulfit mutagenese ikke kan skelne mellem undertrykkende 5-methylcytosin og demethylering mellemproduktet 5-hydroxymethylcytosine 13.
Adskillige modifikationer kan være nødvendig på basis af genet eller regionen af interesse. Den bisulfit omdannelse tid kan kræve optimering for den højeste omdannelsesprocentdel med den laveste DNA-beskadigelse. Vi foreslår en række 2,5 til 4 timer (halvtimes intervaller) til behandling med bisulfit. Yderligere optimering kan involvere PCR-primer designet for konverterede sekvenser af interesse (for eksempel http://www.urogene.org/methprimer/ ) samt optimering af PCR-programmer baseret på fragmentet længde og CG-indholdet (se Patterson et al. for yderligere bisulfit mutagenesemetoder optimering 7). En sidste ændring er, at gel ekstraktion af den 2. runde PCR-produkt kan være påkrævet, hvis der er rigelige primer-dimere eller ikke-specifikke ampliconer, der integrerer ind i vektoren ved klonet.
Vi har tidligere vist, at detteProtokollen er effektiv til individuelle MII oocytter 12. Vi har også testet dens effektivitet på voksende oocyter ved en række forskellige oocyt diametre, med de samme satser for vellykket forstærkning af konverteret DNA. Vigtigere, i sammenligning med andre bisulfit mutagenese fremgangsmåder, som ikke er effektive til methylering undersøgelser på en individuel celle, muliggør denne protokol analyse af DNA metylering af individuelle oocytter og tidlige embryoner. Dette er vigtigt for reproduktive og udviklingsmæssige biologiske undersøgelser, specielt da det vedrører de manipulationer af kimceller og af tidlige embryoner. Fremtidige anvendelser kan indbefatte analyse af DNA-mønstre for methylering i enkelte celler af enhver oprindelse, herunder in vivo-afledte og dyrkede celler. Derudover har vi udviklet et individ blastocyst assay, der genskaber DNA og RNA fra den samme embryo, der giver mulighed for både ekspression og methylering data, der skal opnås. En fremtidig anvendelse vil indebære at ændre Single oocyt-assayet til at inddrive RNA til ekspression analyser samt DNA for methylering assays. Anden optimering ville være at udføre duplex assays for den samme oocyt, der ligner El Hajj et al 14, som ville gøre det muligt for methylering detektion ved en somatisk methyleret, oocyt-embryo unmethyated genet, hvilket tillader påvisning af cumulus celle kontaminering.
DNA metylering analyser kan variere fra genom-dækkende til locusspecifik. Genom-dækkende metoder såsom methyleret DNA immunopræcipitation (MeDIP) sammen med mikroarrays eller sekventering kræver typisk store mængder af materiale. Locusspecifikke metoder, der omfatter kombination bisulfit restriktionsanalyse (COBRA) under anvendelse af methylering-specifikke restriktionsenzymer eller MethylDetector kittet (Active motivet) er mindre end optimale for enkelte blastocyst analyser, hvilket resulterer i utilstrækkelig genvinding af DNA og PCR forspænding og manglende reproducerbarhed. En alternativ fremgangsmåde til enkelt oocyt og eArly embryo methyleringsanalyse anvendes EZ-methylering af DNA kit (Zymo Research) med begrænset fortynding bisulfit pyrosekventering teknik 14, selv om de rapporterede resultater, de bisulfit omdannet DNA-amplifikation var lavere end den her beskrevne fremgangsmåde.
Hydrogensulfit mutagenese er den gyldne standard for analyse af DNA methylering, og det er klart, at analysen af enkelte celler er et vigtigt skridt fremad. Agarose indlejring tillader mindre prøvestørrelser kan analyseres med behandling med bisulfit, såsom agarose beskytter mod DNA nedbrydning og forhindrer DNA-tab i løbet af adskillige protokoller trin. Imidlertid, når der sammenlignes med blastocyst en enkelt oocyt har 3-6 pg af genomisk DNA. Vores ændrede protokol, der integrerer enkelt oocyter i agarose indeholder lyseringspuffer, forhindrer DNA tab starten i den indledende lyse trin, og modererer den barske behandling med bisulfit. Sammenfattende er fordelen ved en enkelt oocyt analyse, at den tilladerpåvisning af utilsigtet Cumulus celle forurening samt demaskering sjældne begivenheder, og fjerne eventuelle PCR skævheder i poolede prøver. Alt dette ændrede protokol giver kvalitetsdata på methylering tilstand individuelle oocytter og tidlige embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af University of Western Ontario, Institut for obstetrik og gynækologi, og et tilskud ER06-02 til 188 fra Ministryof Forsknings-og Innovationsstyrelsen, Early Researcher Award. MMD blev støttet af en CIHR Training Program i reproduktion, Tidlig udvikling og indflydelse på sundheden (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
