Summary
Bisulfite mutagenese er gullstandarden for å analysere DNA metylering. Vår modifisert protokoll kan for DNA metylering analyse på encellet nivå og ble utviklet spesielt for enkelte oocytter. Den kan også brukes til kløv-trinns embryoer.
Abstract
Epigenetikk omfatter arvelig alle og reversible endringer i kromatin som alter genet tilgjengelighet, og dermed er de primære mekanismer for regulering gentranskripsjon en. DNA metylering er en epigenetisk modifikasjon som fungerer hovedsakelig som en undertrykkende mark. Gjennom kovalente tillegg av en metylgruppe på cytosines i CPG dinucleotides, kan det rekruttere flere undertrykkende proteiner og histonmodifikasjonene å initiere prosesser involvert i kondenserende kromatin og kutte gener to. DNA metylering er viktig for normal utvikling som den spiller en avgjørende rolle i utviklingsarbeid programmering, celledifferensiering, undertrykkelse av retrovirale elementer, X-kromosom inaktivering og genomisk imprinting.
En av de mest kraftfulle metoder for DNA metylering analyse er bisulfite mutagenese. Natrium bisulfite er en DNA mutagen som deaminates cytosines inn uracils. Etter PCR forsterkning og seque ncing er disse konverteringshendelser oppdaget som thymines. Denaturert cytosines er beskyttet mot deaminering og dermed forbli som cytosines, slik at identifisering av DNA metylering på individnivå nukleotid nivå 3. Utvikling av bisulfite mutagenese analysen har avansert fra dem som opprinnelig rapporterte 4-6 mot de som er mer sensitive og reproduserbare 7. Et sentralt avansement ble innebygging mindre mengder DNA i en agarose perle, og dermed beskytter DNA fra den harde bisulfite behandling 8. Dette aktivert metylering analysen skal utføres på bassenger av ubefruktede egg og blastocyst-stadium embryoer 9. Den mest sofistikerte bisulfite mutagenese protokollen til dags dato er for individuelle blastocyst-stadium embryoer 10. Men siden blastocysts har i gjennomsnitt 64 celler (inneholder 120-720 pg av genomisk DNA), er denne metoden ikke virkningsfulle for metylering studier på enkelte oocytter eller spalting-trinns embryoer.
telt "> Tar ledetråder fra agarose innebygging av liten DNA beløp inkludert oocytter 11, her presenterer vi en metode der ubefruktede egg er direkte innebygd i en agarose og lysis løsning perle umiddelbart etter henting og fjerning av zona pellucida fra oocyte. Dette gjør oss til omgå de to hovedutfordringer enkelt oocyte bisulfite mutagenese:. beskytter en liten mengde DNA fra degradering og påfølgende tap i løpet av de tallrike protokollen trinnene Viktigere, som hentes fra enkeltrom eggceller, er spørsmålet om PCR skjevhet i bassengene eliminert Videre. , utilsiktet Cumulus celle forurensning kan påvises ved denne metoden siden enhver prøve med mer enn en metylering mønster kan utelukkes fra analysen 12. Denne protokollen gir en forbedret metode for vellykkede og reproduserbare analyser av DNA metylering ved encellet nivå og er ideell for individuelle oocytter samt cleavage-trinns embryoer.Protocol
DAG 1
Forbered følgende løsninger friske den dagen oocyte samling med sterilt, destillert vann slik som GIBCO vann. For å redusere sjansen for DNA forurensning, skift hansker ofte og bruke filter tips. Hold rørene vinkles vekk når de er åpne, og oppsummering alle rør når den ikke er i bruk. Vi anbefaler at løsningene er laget som n +1.
3% LMP agarose
30 mg lavt smeltepunkt (LMP) agarose
opp til 1 ml GIBCO H 2 O
oppløse @ 70 ° C
Lyse Solution
8 mL lyse buffer
1 mL proteinase K
1 mL 10% IGEPAL
plass på is til alt er klart til bruk
02:01 agarose: Lysis Solution (10 mL per individ oocyte, er beløpet for 3 oocytter)
20 mL 3% LMP agarose
10 mL Lysis Solution
Bland @ 70 ° C
SDS Lysis Buffer (501 mL per individ eggcelle)
| 1x TE pH 7,5 | 450 mL |
| 10% SDS | 50 mL |
| Proteinase K | 1 mL |
| 501 mL |
1. Eggcelle Collection
- Plasser dissekert mus oviduktene i M2 media, og rive den ampullae å trekke Cumulus cellen komplekset.
- Skille oocyttene fra Cumulus celle komplisert å bruke 0,3 mg / ml Hyaluronidase løsning i en 30 mL dråpe M2 media. Hold egg i løsningen bare så lenge det tar å fjerne Cumulus celler, som langvarig eksponering kan skade dem. Vask egg 3x i 30 mL dråpe M2 media, fjerning av cumulus celler med jevne mellomrom.
- Fjern zona pellucida hjelp sure tyrode løsning. Plasser egg i en 30 mL dråpe løsning først, og deretter overføre til en annen 30mL dråpe, som alle medier gjennomført sammen vil fortynne syren og redusere dens effektivitet. Hold egg i løsningen bare så lenge det tar å fjerne Zona, som langvarig eksponering kan skade dem. Merk: en økt konsentrasjon av sure tyrode løsning eller pronase kan brukes for humane prøver, som det menneskelige zona pellucida er mer motstandsdyktig mot behandling med surt tyrode løsning enn musen.
- Vask egg igjen i en 30 mL dråpe M2 media.
2. Agarose innebygging og Lysis
- For å utføre agarose embedding, plasser lysis løsning på en 70 ° C heatblock. Legg til forvarmet LMP agarose til lysis løsningen, som produserer en 2:1 agarose: lysis løsning.
- Plasser en enkelt oocyte på en ren glass lysbilde i minimale M2 media. Ta opp 10 mL av agarose: lysis løsning i en pipette tips, og (under et mikroskop) forsiktig utvise en liten mengde (~ 1 mL eller mindre) på glass-slide, slik at det å blande med minimal media. Forsiktig plukke opp oocyte inn pipettespissen og satte alt 10 mL inn en Eppendorf rør med 300 mL mineralolje så perle danner en sfære.
Merk: Denne prosessen må gjøres ganske raskt som den agarose vil stivne hvis temperaturen synker så lite som 5 ° C under 70 ° C. - Inkuber røret på is i 10 minutter. For å utføre lyse, fjerne 300 mL mineralolje og tilsett 500 mL av SDS lysis buffer. Inkuber over natten i en 50 ° C vannbad.
Merk: Lysis løsning (Tabell 1) kan også brukes til dette formålet.
DAG 2
Forbered følgende løsninger friske den dagen bisulfite mutagenese. For å redusere sjansen for DNA forurensning, skift hansker ofte og bruke filter tips. Hold rørene vinkles vekk når de er åpne, og oppsummering alle rør når den ikke er i bruk. Vi anbefaler at løsningene er laget som n +1.
| 3 M NaOH | <td> 2,4 g NaOH i 20 ml autoklaveres DDH 2 O|
| 0,1 M NaOH | 0,5 ml 3M i 14,5 ml autoklaveres DDH 2 O |
| 0,3 M NaOH | 1,5 ml 3M i 13,5 ml autoklaveres DDH 2 O |
2,5 M bisulfite Solution
- 3,8 g natrium bisulfite
5,5 ml GIBCO destillert H 2 O
1 ml 3 M NaOH
oppløse @ romtemperatur - 110 mg Hydroquinone
1 ml GIBCO destillert H 2 O
oppløse @ 90 ° C (for kun så lenge det tar å oppløse, blande regelmessig)
Når fullstendig oppløst, bland løsning (a) og (b)
* Holdes vekk fra lys *
3. Bisulfite Mutagenese
- Fullt fjerne 500 mL SDS lysis buffer og legge 300 mL mineralolje (~ 20 timer). Eventuelle lyse buffer gjenværende vil utvanne the agarose når det er oppvarmet og perlen vil være mer utsatt for løse opp i de påfølgende trinn. Fortsett med bisulfite mutagenese umiddelbart, eller lagre ved -20 ° C i opp til 5 dager.
- Hvis det er aktuelt, fjerner eggceller fra fryseren og la tine (kun til agarose perle er relativt gjennomsiktig). Inkuber i 2,5 minutter på en 90 ° C varme blokk, hvoretter Inkuber på is i 10 minutter.
Merk: Ikke bland eller røre, utvide lenger enn 2,5 minutter, eller svinge temperatur. - For å utføre denaturering, fjerne mineralolje og tilsett 1 ml 0.1m NaOH i hvert rør, flick og invertere 5-6 ganger.
- Inkuber i 15 minutter i en 37 ° C waterbath, invertere hver 3-4 minutt. Den perle skal flyte i NaOH.
- For å utføre bisulfite behandling, spinne røret forsiktig, deretter fjerne NaOH og legge 300 mL mineralolje og 500 mL bisulfite løsning. Inkuber røret i 3,5 timer i en 50 ° C waterbath. * Holdes vekk fra lys * Merk: Lengde på inkubasjon kan måtte empirisk bestemmes for genet av interesse.
- For å utføre desulfonation, inkuberes på is i 3 minutter, og deretter fjerne den mineralolje og bisulfite løsningen, spinne forsiktig, og tilsett 1 ml 0,3 M NaOH. Flick og invertere 5-6 ganger.
- Inkuber i 15 minutter i en 37 ° C waterbath, invertere hver 3-4 minutt. Den perle skal flyte i NaOH.
- Vask prøvene, ved først å spinne forsiktig, deretter fjerne NaOH og tilsett 1 ml 1x TE pH 7,5. Rist i 5-10 minutter ved romtemperatur (på en shaker). Spinn forsiktig igjen, så fjern 1x TE. Gjenta denne vaskeprosessen to ganger.
- Tilsett 1 ml autoklaveres DDH 2 O. Rist i 5-10 minutter ved romtemperatur (på en shaker). Spinn forsiktig, deretter fjerne H 2 O. Gjenta DDH 2 O vask to ganger.
- Sjekk pH av supernatanten, det bør være pH 5,0. Hvis fortsatt for grunnleggende, vaske igjen med H 2 O. Fjern alle supernatant, slik at bare agarose væread.
4. 1. og 2. runde PCR amplifikasjon
- Forbered 1 omg PCR-blanding ** mens vaske **
| 10 mm Primer Forward Ytre | 0,5 mL |
| 10 mm Primer Reverse Ytre | 0,5 mL |
| 240 ng / ml tRNA | 1 mL |
| H 2 O | 13 mL |
Legg til illustrasjon Ready-to-Go Hot Start PCR perler
Skyv solid agarose perle i PCR tube (~ 10 mL)
Varm opp til 70 ° C, og bland
Tilsett 25 mL mineralolje
Totalt: 50 mL
- Forsterke
Merk: Et eksempel på sykkelforholdene for mus Snrpn er denaturering i 2 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 30 sekunder ved 94 ° C, 1 minutt ved 50 ° C, og enminutt ved 68 ° C, og en endelig 10 minutters forlengelse trinn ved 68 ° C. Annealing temperatur for en omg PCR for mus H19 og Peg3 er 50 ° C. - Forbered 2. runde PCR mix
| 10 mm Primer Forward Indre | 0,5 mL |
| 10 mm Primer Reverse Indre | 0,5 mL |
| H 2 O | 19 mL |
Legg til illustrasjon Ready-to-Go Hot Start PCR perler
Tilsett 5 mL 1 omg produkt som en mal. Varm opp 1 omg produkt til 70 ° C i 1 minutt å myke opp agarose. Sørg for å pipetter under lag av mineralolje.
Tilsett 25 mL mineralolje
Totalt: 50 mL
Merk: Nestede primer sekvenser for Snrpn, H19, og Peg3 kan bli funnet i Market-Velker et al 10,12.
- Forsterke
Merk: Sykling vilkår for mus Snrpn er denaturering i 2 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 30 sekunder ved 94 ° C, 1 minutt ved 50 ° C, og 1 minutt ved 68 ° C, og en endelig 10 minutters forlengelse trinn ved 68 ° C 10. Mus H19 og Peg3 krever 50 ° C annealing temperatur for 2. runde PCR. - Som en diagnostisk test, kan andre omgangen prøver kuttes med en begrensning enzym som er metylering-eller belastning-spesifikk.
| 2. runde produkt | 4 mL |
| Restriksjonsenzym | 1 mL |
| Buffer | 1 mL |
| H 2 O | 4 mL |
- Electrophorese fordøyelsen produktene på en 8% akrylamid gel. Eventuelle heterogene band representerer mer enn en sequeNCE.
5. TA Cloning og Colony PCR
- Å klone 2. runde produktet, første heat til 70 ° C i 1 minutt å mykne agarose, så ligate inn vektor bruker Promega pGEM-T Vector System (Fisher Scientific Cat # A1360).
| 2. runde PCR | 1 mL |
| pGEMT-EASY vektor | 1 mL |
| Ligase | 1 mL |
| H 2 O | 2 mL |
| 2x hemorroider Buffer | 5 mL |
Inkuber over natten @ 4 ° C i PCR maskin.
- Tin kompetente E.coli cellene på isen i 15 minutter (Zymo Forskning Corp Cat # T3009). Legg 3 mL ligation reaksjon til 8 mL E.coli og inkuber ligation på is i 15 minutter.
- Heat sjokk i 40 sekunder i en 42 ° C waterbath,og inkuber på is i 2 minutter. Legg 60 mL SOC medium og Inkuber ved 37 ° C i 1 time (i shaker).
- Plasser alle reaksjonsblandingen på en LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp plate og inkuber plate ved 37 ° C over natten.
- Forbered koloni PCR mix
| 20 mM M13 forward primer | 0,7 mL |
| 20 mM M13 Reverse Primer | 0,7 mL |
| 5X Grønn Go Taq Buffer | 7,0 mL |
| 10 mM dNTP | 0,7 mL |
| Taq DNA polymerase | 0.28 mL |
| H 2 O | 25.62 mL |
| 35 mL Total |
Legg 35 mL Colony PCR Master Mix i en PCR rør. Plukk en hvit bakteriell koloni fra platen med en pipette, og virvel den inn i PCR reaksjonen.
- Forsterke med denaturering i 10 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser på 45 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 57 ° C, og 1 minutt ved 72 ° C, og en endelig 10 minutters forlengelse trinn ved 72 ° C. Electrophorese 4 mL på en 1,5% agarose gel. Send ~ 30 mL av PCR produkt for sekvensering.
Merk: For egg er 5 koloni PCR produktene sekvensert. - Når sekvensering resultater oppnås, kan metylering mønstre leses. Enhver original CG som forble som en CG var rødsprit, og noen originale CG som nå er en TG ble unmethylated.
6. Representative Resultater
I vårt arbeid, preget vi analysen metylering i enkelte egg og embryoer (figur 1). Etter nestet PCR amplifikasjon hjelp bisulfite konverterte primere, er det mulig å bekrefte en vellykket konvertering ved å visualisere en riktig fragment størrelse på en agarose gel (figur 2). En individuell eggcellerepresenterer en foreldrenes allel, og i teorien, har en trykt metylering mønster. Dermed kan andre omgangen PCR produktene testes for utilsiktet forurensning. Et restriksjonsenzym følsom for DNA metylering (som HinfI eller DpnII) kan brukes til å fordøye den andre runden PCR produkt for å vurdere om det inneholder en rødsprit eller unmethylated allel (figur 3). En denaturert C innen enzymet anerkjennelse sekvensen spaltes mens en unmethylated C som er konvertert til T er ikke lenger anerkjent av enzymet og er uklippet. Enhver MII oocyte prøven inneholder både denaturert og unmethylated alleler skal kastes, da det er indikasjon på Cumulus celle forurensning (figur 3). Etter ligation og transformasjon, kan vellykket koloni PCR amplifikasjon bli visualisert på en agarose gel for å sikre prøver med riktig produkt størrelsen blir sendt for sekvensering (figur 4). Til slutt sekvensen av fem individuelle clde fra en MII oocyte skal produsere fem identiske metylering mønstre og identiske nonCpG konverteringsfrekvenser (figur 5a). Eventuelle prøver som inneholder mer enn ett mønster bør kasseres (figur 5b). Siden eggløsning Mii oocytter har to kromosom eksemplarer eller en vedlagt polar kroppen, det er en mulighet for å få to like sequence mønster (figur 5c). Vi anbefaler forkaste data fra oocytter som har svært ulik metylering mønstre siden cumulus celle forurensning ikke kan utelukkes.
Figur 1. Skjematisk av Single oocytter bisulfite Mutagenese analysen.
Figur 2. Representative resultater fra 2. runde forsterkning for Snrpn fra en sangle MII oocyte på en 1,5% agarose gel. Lanes 1-4 er fire enkle Mii oocytter og kjørefelt 5 er en negativ kontroll (ingen eggcelle). Forventet fragment størrelse for Snrpn er 420 bp. L, stige.
Figur 3. Representative resultater fra 2. runde metylering-spesifikk begrensning fordøyelse for Snrpn fra en enkelt Mii oocyte på en 8% akrylamid gel. HinfI diagnostisk begrensning fordøyelse viser unmethylated DNA som huser en T som opphever begrensningen hotellet (420bp, 1 kjørefelt) eller denaturert DNA som inneholder en C innen anerkjennelse hotellet (cut, 262, 103, og 54 bp, kjørefelt 2). Fordøyelse viser både denaturert og unmethylated restriksjonsenzym steder (Cut & uncut band, tre kjørefelt) er tegn på Cumulus celle forurensning. L, stige.
Figur 4. Snrpn fra en enkelt Mii oocyte på en 1,5% agarose gel. Forventet fragment størrelse etter ligation av Snrpn i pGEM-T Easy vektor og bruker M13 forover og revers primer er 656 bp. 1-8 Lane, amplikonene fra kloner 1-8. Clone 5 har en feil fragment størrelse og skal ikke sendes for sekvensering.
Figur 5. Representant sekvensering resultater for Snrpn fra en enkelt Mii oocyte. Snrpn er denaturert i oocytter. Svarte sirklene viser denaturert CpGs. Hvite sirkler indikerer unmethylated CpGs. CpG antall og plassering er representant for en B6 belastning hunnmus. a) Forventet sekvensering resultater for Snrpn fra en enkelt Mii oocyte. Bare en enkelt strand av DNA bør forsterke i alle fem kloner. Oocytter med ett metylering mønster og identisk ikke-CpG konvertering pattern bør inkluderes i analysene (prosent konvertering av ikke-CpGs indikert til høyre ble beregnet som antall ikke-CPG cytosines konvertert til tymin i prosent av totale ikke-CPG cytosines). b) sekvensering resultater for Snrpn fra en enkelt Mii oocyte med cumulus celle forurensning. Legg merke til ulikheter mellom metylering stater og konvertering mønstre som indikerer multippel strand forsterkning. c) sekvensering resultater for Snrpn fra en enkelt Mii oocyte med begge kromosom kopier eller polar kropp inkludering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne singelen oocyte analysen inneholder mange skritt med et nummer som er kritiske og krever spesiell omsorg. Den første er oocyte vask. Det er spesielt viktig å vaske hver eggcelle flere ganger i frisk medium synker etter Hyaluronidase behandling for å fjerne så mange cumulus celler som mulig. Videre, ved overføring oocytter til sure tyrode løsning for zona pellucida fjerning sørge omgivende mediet er klar over cumulus celler. Den oocyte er veldig klissete etter Zona fjerning, og eventuelle omkringliggende cumulus celler kan lett bli klistret til oocyte. Det er svært vanskelig å fjerne en cumulus celle som er festet til en zona-fri oocyte. Mens denne protokollen tillater påvisning av Cumulus celle forurensning på senere tidspunkter, er det ikke konstruktivt, eller økonomisk, for å gjennomgå hele protokollen på ubefruktede egg som sannsynligvis vil bli forkastet.
Den andre kritiske trinnet er oocyte embedding. Når innebygging av oocyte i agarose og LYSer løsningen, er det viktig å merke seg at lavt smeltepunkt (LMP) agarose vil forherde ved temperaturer så lite som 5 ° C under 70 ° C. Derfor anbefaler vi å blande agarose og lysis løsning ved 70 ° C, og deretter plassere den enkelte oocyte på glasset raset i minimal medium. Når ferdig, pipette den agarose / lysis løsning og legge den oocyte inn en forberedt Eppendorf rør henhold mineralolje, i en forsiktig likevel betimelig måte.
Det er viktig at varmen inaktivering av proteinase K utføres ved 90 ° C i 2,5 minutter. Avvik fra dette anbefales ikke. Høyere temperaturer eller lengre tid kan skade DNA, mens lavere temperaturer eller kortere tider ikke kan inaktivere proteinase K.
Som en påminnelse, natrium bisulfite og hydrokinon er lys sensitive. Løsninger bør være forberedt og deretter pakket i folie, gult rør og / eller plasseres i en mørk skuff inntil bruk. Når bisulfite løsningen har blitt lagt til than tube, bør røret være dekket med folie eller en mørk tildekket pose når ruger ved 50 ° C. Vi bruker tomme folie poser fra GE Healthcare som opprinnelig inneholdt de varme start PCR perler.
Til slutt, som med de fleste PCRs, anbefaler vi å forberede hver runde på en riktig måte. Overdreven forsinkelser, spesielt etter blanding ved 70 ° C, vil redusere suksessrate på forsterkning.
På det nåværende tidspunkt, er en begrensning av protokollen at suksessen rate av bisulfite konvertert DNA forsterkning fra individuelle egg varierer fra 40% til 65% avhengig av genet fragment forsterkes. Mens ytterligere feilsøking kan øke denne andelen, det er en trade-off mellom bisulfite konverteringen behandling blir for lang eller hard og ikke å ha tilstrekkelig konverteringsfrekvenser (> 85-90%). En annen begrensning er at for øyeblikket bisulfite mutagenese ikke kan skille mellom undertrykkende 5-methylcytosine og demetylering mellomliggende 5-hydroxymethylcytosine 13.
Flere endringer kan være nødvendig basert på genet eller region av interesse. Den bisulfite konvertering tid kan kreve optimalisering for høyest konvertering andelen med lavest DNA skade. Vi foreslår en rekke 2,5 til 4 timer (halv time intervaller) for bisulfite behandling. Videre optimalisering kan innebære PCR primer design for konverterte sekvenser av interesse (for eksempel http://www.urogene.org/methprimer/ ), samt optimalisering av PCR programmer basert på fragment lengde og CG innhold (se Patterson et al. for ytterligere bisulfite mutagenese optimaliseringsalternativer 7). En siste endring er at gel utvinning av 2. runde PCR produkt kan være nødvendig hvis det er rikelig Primer-dimer eller uspesifikke amplikonene som vil integrere inn i vektoren når klonet.
Vi har tidligere vist at detteprotokollen er effektiv for individuelle Mii oocytter 12. Vi har også testet sin effektivitet på voksende egg på en rekke forskjellige eggcelle diametre, med de samme tallene for vellykket forsterkning av konvertert DNA. Viktigere, i forhold til andre bisulfite mutagenese prosedyrer, som ikke er virkningsfulle for metylering studier på en enkelt celle, gjør denne protokollen analyse av DNA metylering av individuelle egg og tidlige embryoer. Dette er viktig for reproduksjon og utvikling biologi studier, spesielt i tilknytning til de manipulasjoner av kjønnsceller og tidlige embryoer. Fremtidige søknader kan omfatte analyse av DNA metylering mønstre i enkeltceller av enhver opprinnelse, inkludert in vivo-deriverte og dyrkede celler. I tillegg har vi utviklet en individuell blastocyst analyse som gjenoppretter DNA og RNA fra samme fosteret, noe som åpner for både uttrykk og metylering data skal innhentes. En fremtidig søknad vil innebære endring av single oocyte analysen til å gjenopprette RNA for uttrykk analyser samt DNA for metylering analyser. Et annet optimalisering vil være å utføre duplex analyser for samme oocyte, tilsvarende El Hajj et al 14, som ville tillate for metylering deteksjon ved en somatisk denaturert, oocyte-embryo unmethyated genet, og dermed tillater påvisning av Cumulus celle forurensning.
DNA metylering analyser kan variere fra genom-wide til locus-spesifikk. Genome-wide metoder som metylert DNA immunoprecipitation (MeDIP) i forbindelse med mikromatriser eller sekvensering vanligvis krever rikelig mengder materiale. Locus-spesifikke metoder som inkluderer kombinert bisulfite begrensning analyse (COBRA) med metylering-spesifikke restriksjonsenzymer, eller MethylDetector kit (Aktiv Motif), er mindre enn optimal for single blastocyst analyser, noe som resulterer i utilstrekkelig utvinning av DNA, PCR skjevhet og mangel på reproduserbarhet. En alternativ tilnærming til én eggcelle og eArly embryo metylering analyse benyttet EZ-DNA metylering kit (Zymo Research) med et begrenset fortynning bisulfite pyrosequencing teknikk 14, selv om de rapporterte suksessraten av bisulfite konvertert DNA amplifikasjon var lavere enn metoden beskrevet her.
Bisulfite mutagenese er gullstandarden for å analysere DNA metylering, og det er klart at analysen av enkeltceller er et viktig skritt fremover. Agarose embedding tillater mindre utvalgsstørrelser som skal analyseres med bisulfite behandling, som agarose beskytter mot DNA fornedrelse og hindrer DNA-tap under mange protokoll trinn. Men sammenlignet med blastocyst, har en enkel oocyte ca 3-6 pg av genomisk DNA. Vår endret protokollen, som bygger enkle egg i agarose inneholder lysis buffer, hindrer DNA tap begynnelsen på den første lysis trinn og moderate det harde bisulfite behandling. Oppsummert er fordelen med enkelt oocyte analyse at den tillaterpåvisning av utilsiktet Cumulus celle forurensning samt avsløre sjeldne hendelser, og eliminere eventuelle PCR skjevheter i samleprøver. Samlet gir dette endret protokollen datakvalitet på metylering tilstand av individuelle egg og tidlige embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av University of Western Ontario, Institutt for obstetrikk og gynekologi, og en bevilgning ER06-02-188 fra Ministryof forskning og innovasjon, Early Forsker Award. MMD ble støttet av en CIHR Training Program i Reproduksjon, Tidlig utvikling og påvirkningen på helse (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
