Summary
Bisulfit mutagenes är den gyllene standarden för att analysera DNA-metylering. Vår modifierat protokoll tillåter DNA-metylering analys på encelliga nivå och har utformats särskilt för enskilda oocyter. Den kan också användas för klyvning-stegs-embryon.
Abstract
Epigenetik innebär att man måste ärftliga alla och reversibla modifieringar kromatin som alter-genen tillgänglighet, och sålunda är de primära mekanismerna för reglering av gentranskription 1. DNA-metylering är en epigenetisk modifiering som fungerar främst som en repressiv varumärke. Genom kovalent addition av en metylgrupp på cytosiner i CpG-dinukleotider, kan det rekrytera ytterligare undertryckande proteiner och histon modifieringar för att initiera processer involverade i kondensera kromatin och tysta gener 2. DNA-metylering är en förutsättning för normal utveckling som den spelar en avgörande roll i utvecklingsarbetet programmering, celldifferentiering, undertryckande av retrovirala element, X-kromosom inaktivering och genomisk prägling.
En av de mest kraftfulla metoder för DNA-metylering analys är bisulfit mutagenes. Natriumbisulfit är en DNA-mutagen som deaminerar cytosiner i uraciler. Efter PCR-amplifiering och seque ncing är dessa omvandlingshändelser identifieras som tyminer. Metylerade cytosiner skyddas från deaminering och därmed kvarstår som cytosiner, som möjliggör identifiering av DNA-metylering på individnivå nukleotid nivå 3. Utveckling av bisulfit mutagenes analysen har avancerat från de ursprungligen rapporterades 4-6 mot sådana som är mer känsliga och reproducerbar 7. En viktig utveckling var att bädda mindre mängder av DNA i en agaros pärla, och därigenom skydda DNA från den hårda bisulfit behandlingen 8. Detta möjliggjorde metylering analys som skall utföras på pooler av oocyter och blastocyst-stegs embryon 9. Den mest sofistikerade bisulfit mutagenes protokollet hittills är för enskilda blastocyst-stegs embryon 10. Eftersom blastocyster har i genomsnitt 64 celler (innehållande 120-720 pg av genomisk DNA), är denna metod inte effektiv för metylering studier om enskilda oocyter eller klyvning av karriären embryon.
tält "> Med ledtrådar från agaros inbäddning av min DNA belopp inklusive oocyter 11, här presenterar vi en metod där oocyter är direkt inbäddade i en agaros och lys lösningen sträng omedelbart efter hämtning och avlägsnande av zona pellucida från äggcellen. Detta gör att vi kan kringgå de två viktigaste utmaningarna i samma äggcell bisulfit mutagenes. skydda en liten mängd av DNA från nedbrytning och efterföljande förlust under många protokoll stegen viktigt som data erhålls från enstaka oocyter är frågan om PCR partiskhet i pooler elimineras dessutom. , oavsiktlig cumulus cellkontaminering kan detekteras med denna metod eftersom varje prov med mer än en metylering mönster kan uteslutas från analysen 12. Detta protokoll ger en förbättrad metod för framgångsrika och reproducerbara analyser av DNA-metylering vid encelliga nivå och är idealisk för enskilda oocyter samt klyvning av karriären embryon.Protocol
DAG 1
Bered följande lösningar färska på dagen för äggcellen samling med sterilt, destillerat vatten såsom GIBCO vatten. För att minska risken för DNA-kontaminering, byta handskar ofta och använd filter tips. Håll rör vinklade bort när den är öppen och sammanfatta alla rör när den inte används. Vi rekommenderar att lösningar görs under det att n 1.
3% LMP-agaros
30 mg låg smältpunkt (LMP) Agaros
upp till 1 ml GIBCO H 2 O
upplösa @ 70 ° C
Lyslösning
8 | il lysbuffert
1 il proteinas K
1 il 10% IGEPAL
Placera på is fram till användning
02:01 Agaros: lyseringslösning (10 pl per individ äggcellen är beloppet för 3 oocyter)
20 | il 3% LMP-agaros
10 pl lyseringslösning
Blanda @ 70 ° C
SDS Lysis Buffer (501 ul per individ äggcell)
| 1 x TE pH 7,5 | 450 pl |
| 10% SDS | 50 pl |
| Proteinas K | 1 il |
| 501 pl |
1. Oocyt Collection
- Placera de dissekerade mus äggledarna i M2 media och riva ampuller för att extrahera den komplexa cumulus cellen.
- Separera oocyter från cumulus cellen komplexet med användning av 0,3 mg / ml hyaluronidas lösning i en 30 pl droppe av M2 medier. Håll oocyter i lösning så länge som det tar att ta bort cumulus celler, som långvarig exponering kan skada dem. Tvätta oocyter 3x i 30 ul droppe M2 media, ta bort cumulusceller regelbundet.
- Ta zona pellucida med sur Tyrodes lösning. Placera oocyter i en 30 pl droppe lösning först och sedan överföra till en annan 30il droppe, eftersom alla medier som tillsammans kommer att späda ut syran och minska dess effektivitet. Håll oocyter i lösning så länge som det tar att ta bort zona, eftersom långvarig exponering kan skada dem. Notera: en ökad koncentration av sura Tyrodes lösning eller pronas kan användas för humana prover, som den humana zona pellucida är mer resistent mot behandling med sura Tyrodes lösning för mus.
- Tvätta de oocyter en gång till i en 30 pl droppe av M2 medier.
2. Agaros Inbäddning och lys
- För att utföra agaros inbäddning, placera lys lösningen på ett 70 ° C heatblock. Lägg till förvärmda LMP agarosen till lys lösningen, vilket ger en 2:1 agaros: lys lösning.
- Placera en äggcell på en ren glasskiva i minimala M2 media. Ta upp 10 | il av agaros: lys-lösning i en pipettspets, och (under mikroskop) försiktigt ut en liten mängd (~ 1 | il eller mindre) på objektglas, vilket gör att den blandas med minimal media. Försiktigt plocka upp oocyten in i pipettspetsen och sätta alla 10 | il i en Eppendorf-rör med 300 ^ il mineralolja så att vulsten bildar en sfär.
Obs: denna process måste göras ganska snabbt eftersom agarosen hårdnar om temperaturen sjunker så lite som 5 ° C under 70 ° C. - Inkubera röret på is under 10 minuter. För att utföra lys, ta bort 300 pl mineralolja och tillsätt 500 pl av SDS lysbuffert. Inkubera över natt i en 50 ° C vattenbad.
Anmärkning: Lys lösning (Tabell 1) kan också användas för detta ändamål.
DAG 2
Framställa följande lösningar färska på dagen för bisulfit mutagenes. För att minska risken för DNA-kontaminering, byta handskar ofta och använd filter tips. Håll rör vinklade bort när den är öppen och sammanfatta alla rör när den inte används. Vi rekommenderar att lösningar görs under det att n 1.
| 3 M NaOH | <TD> 2,4 g NaOH i 20 ml autoklaverat ddHaO 2 O|
| 0,1 M NaOH | 0,5 ml 3M 14,5 ml autoklaverat ddHaO 2 O |
| 0,3 M NaOH | 1,5 ml 3M i 13,5 ml autoklaverat ddHaO 2 O |
2,5 M bisulfitlösning
- 3,8 g natriumbisulfit
5,5 ml GIBCO destillerat H2O
1 ml 3 M NaOH
upplösa @ rumstemperatur - 110 mg hydrokinon
1 ml GIBCO destillerat H2O
upplösa @ 90 ° C (för enbart så länge som det tar att lösa upp, blanda regelbundet)
När den är helt upplöst, blanda lösningen (a) och (b)
* Håll borta från ljus *
3. Bisulfit Mutagenes
- Fullständigt avlägsnande av 500 | il SDS-lys-buffert och tillsätt 300 | il mineralolja (~ 20 timmar). Varje lyseringsbuffert återstående späder the agaros när den upphettas och vulsten kommer att vara mer mottagliga för upplösning i de efterföljande stegen. Fortsätt med bisulfit mutagenes omedelbart eller förvara vid -20 ° C i upp till 5 dagar.
- I förekommande fall, ta bort oocyter från frysen och låt tina (bara tills agaros pärla är relativt genomskinligt). Inkubera under 2,5 minuter på en 90 ° C värmeblock, varefter Inkubera på is under 10 minuter.
Obs: Blanda inte eller rör, förlänga längre än 2,5 minuter, eller fluktuerar temperatur. - Att utföra denaturering, avlägsna mineraloljan och tillsätt 1 ml 0,1 M NaOH till varje rör, Flick och invertera 5-6 gånger.
- Inkubera under 15 minuter i en 37 ° C vattenbad och inverterande var 3-4 minuter. Pärlan ska flyta i NaOH.
- För att utföra bisulfit behandling, snurra röret försiktigt ta bort NaOH och tillsätt 300 pl mineralolja och 500 fil bisulfit lösning. Inkubera röret i 3,5 timmar i en 50 ° C vattenbad. * Håll borta från ljus * Anmärkning: längden av inkubation kan behöva bestämmas empiriskt för genen av intresse.
- För att utföra desulfonering, inkubera på is i 3 minuter, ta sedan bort mineralolja och bisulfitlösning, snurra försiktigt och tillsätt 1 ml 0,3 M NaOH. Flick och invertera 5-6 gånger.
- Inkubera under 15 minuter i en 37 ° C vattenbad och inverterande var 3-4 minuter. Pärlan ska flyta i NaOH.
- Tvätta proverna, genom att först spinning försiktigt ta bort NaOH och tillsätt 1 ml 1 x TE pH 7,5. Skaka under 5-10 minuter vid rumstemperatur (på en skakapparat). Snurra försiktigt igen, då bort 1x TE. Upprepa denna tvättprocessen två gånger.
- Tillsätt 1 ml autoklaverat ddHaO 2 O. Skaka under 5-10 minuter vid rumstemperatur (på en skakapparat). Snurra försiktigt ta bort H 2 O. Upprepa ddHaO 2 O tvätt två gånger.
- Kontrollera pH för supernatanten, det bör vara pH 5,0. Om det fortfarande så grundläggande, tvätta igen med H 2 O. Ta bort alla supernatant, vilket innebär att endast agarosen attannons.
4. 1: a och 2: a rundan PCR-amplifiering
- Förbered 1 st runda PCR mix ** samtidigt tvättar **
| 10 | iM primer framåt yttre | 0,5 pl |
| 10 | iM primer bakåt yttre | 0,5 pl |
| 240 ng / ml tRNA | 1 il |
| H 2 O | 13 pl |
Lägg till Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR pärlor
Skjut försiktigt fast agarosen pärlan i PCR-röret (~ 10 ^)
Värm till 70 ° C och blanda
Tillsätt 25 pl mineralolja
Totalt: 50 pl
- Amplifiera
Anmärkning: Ett exempel på cykliska betingelser för mus Snrpn är denaturering under 2 minuter vid 94 ° C, följt av 40 cykler av 30 sekunder vid 94 ° C, 1 minut vid 50 ° C, och 1minut vid 68 ° C, och en slutlig 10 minuters förlängningssteg vid 68 ° C. Glödgningstemperaturen för en första omgången PCR för mus H19 och PEG3 är 50 ° C. - Förbered 2: a omgången PCR mix
| 10 | iM primer främre inre | 0,5 pl |
| 10 | iM primer bakåt Inre | 0,5 pl |
| H 2 O | 19 pl |
Lägg till Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR pärlor
Tillsätt 5 pl 1 produkt st rund som en mall. Värma 1 m rund produkt till 70 ° C under 1 minut för att mjuka upp agaros. Var noga med att pipettera under skiktet av mineralolja.
Tillsätt 25 pl mineralolja
Totalt: 50 pl
Obs: Kapslade primersekvenserna för Snrpn, H19 och PEG3 kan hittas i Market-Velker et al 10,12.
- Amplifiera
Anmärkning: cykelbetingelser för mus Snrpn är denaturering under 2 minuter vid 94 ° C, följt av 40 cykler av 30 sekunder vid 94 ° C, 1 minut vid 50 ° C och 1 minut vid 68 ° C, och en slutlig 10 minuters förlängning steg vid 68 ° C 10. Mus H19 och PEG3 kräver en 50 ° C hybridiseringstemperatur för 2: a omgången PCR. - Som ett diagnostiskt test, kan den andra omgången prover kapas med ett restriktionsenzym som är metylering-eller stam-specifika.
| 2: a rundan produkt | 4 il |
| Restriktionsenzym | 1 il |
| Buffert | 1 il |
| H 2 O | 4 il |
- Elektrofores spjälkningsprodukterna på en 8% akrylamidgel. Alla heterogena band står för mer än en sequeNCE.
5. TA-kloning och Koloni-PCR
- Att klona 2: a omgången produkt, första värme till 70 ° C under 1 minut för att mjuka upp agaros, därefter ligera in i vektor med användning av Promega pGEM-T-vektor-systemet (Fisher Scientific katalognummer # A1360).
| 2: a rundan PCR | 1 il |
| pGEMT-EASY vektor | 1 il |
| Ligas | 1 il |
| H 2 O | 2 il |
| 2x ligeringsbuffert | 5 pl |
Inkubera över natten vid 4 ° C i PCR-maskin.
- Tina kompetenta E. coli-celler på is under 15 minuter (Zymo Research Corp katalognummer T3009). Tillsätt 3 pl ligerings-reaktionen till 8 | il E. coli och inkubera ligering på is under 15 minuter.
- Värmechock under 40 sekunder i en 42 ° C vattenbad,och inkubera på is under 2 minuter. Tillsätt 60 pl SOC-medium och inkubera vid 37 ° C under 1 timme (tum skakare).
- Placera hela reaktionsblandningen på en LB / agar / IPTG / Xgal / Amp plattan och inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
- Förbered koloni-PCR mix
| 20 | iM M13 forward primer | 0,7 pl |
| 20 | iM M13 Reverse Primer | 0,7 pl |
| 5X Grön Go Taq buffert | 7,0 pl |
| 10 mM dNTP | 0,7 pl |
| Taq DNA-polymeras | 0,28 ^ il |
| H 2 O | 25,62 il |
| 35 | il Totalt |
Tillsätt 35 pl Koloni-PCR Master Mix till en PCR-rör. Plocka en vit bakteriell koloni från plattan med en pipettspets, och snurra den in i PCR-reaktionen.
- Amplifiera med denaturering under 10 minuter vid 94 ° C, följt av 30 cykler av 45 sekunder vid 94 ° C, 30 sekunder vid 57 ° C och 1 minut vid 72 ° C, och en slutlig 10 minuters förlängning vid 72 ° C. Elektrofores 4 pl på en 1,5% agarosgel. Sända ~ 30 | il av PCR-produkten för sekvensering.
Obs: För oocyter är 5 koloni PCR-produkter sekvenseras. - När sekvensering resultat erhålls kan metyleringsmönster läsas. Alla original CG som återstod som CG metylerades och alla original CG som nu är en TG var ometylerade.
6. Representativa resultat
I vårt arbete präglas vi analysen metylering i enskilda oocyter och embryon (figur 1). Efter upprepad PCR-amplifiering med användning bisulfitkonverterat primrar, är det möjligt att bekräfta en lyckad omvandling av visualisering av ett korrekta fragmentet storlek på en agarosgel (figur 2). En individuell oocytrepresenterar en föräldra-allel, och i teorin, har en tryckt metylering mönster. Som sådan kan den andra omgången PCR-produkter testas för oavsiktlig smitta. En begränsning enzym känslig för DNA-metylering (t.ex. Hinfl eller Dpnll) kan användas för att smälta den andra omgången PCR-produkten för att bedöma om den innehåller en metylerad eller ometylerade allelen (Figur 3). En metylerade C inom enzymet igenkänningssekvensen klyvs medan en icke-metylerad C som omvandlas till T inte längre känns igen av enzymet och är oskuren. Varje MII äggcell prov som innehåller både metylerade och ometylerade alleler bör kasseras, eftersom det är ett tecken på cumulus cellkontaminering (Figur 3). Efter ligering och transformation, kan framgångsrik koloni-PCR-amplifiering visualiseras på en agarosgel för att säkerställa prover med den korrekta produkten storlek sänds för sekvensering (figur 4). Slutligen, den sekvens av fem individuella clde från ett MII äggcell ska ge fem identiska metyleringsmönster och identiska nonCpG priser konvertering (Figur 5a). Några prover som innehåller mer än ett mönster måste kasseras (figur 5b). Eftersom ägglossning MII oocyter har två kromosom kopior eller ett bifogat Polar Body, finns det en möjlighet för att få två liknande sekvens mönster (Figur 5c). Vi rekommenderar kasta data från oocyter som har mycket olika metyleringsmönster sedan cumulus cellkontaminering inte kan uteslutas.
Figur 1. Schematisk den inre Oocyte bisulfit Mutagenesis analys.
Figur 2. Representativa resultat från 2: a omgången förstärkning för Snrpn från en sjungale MII oocyt på en 1,5% agarosgel. Banorna 1-4 är fyra enstaka MII oocyter och spår 5 är en negativ kontroll (ingen oocyt). Förväntade produkten storlek för Snrpn är 420 bp. L, stege.
Figur 3. Representativa resultat från 2: a omgången metylering-specifik restriktionsdigerering för Snrpn från en enda oocyt Mil på en 8% akrylamidgel. Hinfl diagnostisk restriktionsdigestion visar ometylerade DNA som härbärgerar en T som upphäver restriktionsställe (420bp, spår 1) eller metylerat DNA, som innehåller en C inom igenkänningsställe (bitar, 262, 103, och 54 bp, bana 2). Digerering visar både metylerade och ometylerade restriktionsenzymställen (cut & oklippt band, spår 3) är en indikation på cumulus cellkontaminering. L, stege.
Figur 4. Snrpn från en enda oocyt Mil på en 1,5% agarosgel. Förväntade produkten storlek efter ligering av Snrpn in i pGEM-T Easy-vektorn och med användning av M13 framåtriktade och omvända primrar är 656 bp. Spår 1-8, amplikoner från kloner 1-8. Klon 5 har en felaktig amplikon storlek och bör inte skickas för sekvensering.
Figur 5. Representativa sekvensering resultat Snrpn från en enda Mil oocyt. Snrpn metyleras i oocyter. Svarta cirklar visar metylerade CpG. Vita cirklar indikerar ometylerade CpG. CpG nummer och placering är representativ för en B6 stam kvinnlig mus. a) Förväntade sekvensering resultat för Snrpn från en enda MII äggcell. Endast en enkel sträng av DNA bör amplifiera i alla fem kloner. Oocyter med en enda metylering mönster och identiska icke-CpG konvertering smattran bör ingå i analyser (procent omvandling av icke-CpG anges till höger beräknades som antalet icke-CpG cytosiner omvandlas till tymin i procent av totala CpG cytosiner). b) Sequencing resultat för Snrpn från en enda MII äggcell med cumulus cellerna kontamineras. Observera olikhet mellan metylering stater och mönster konvertering visar flera sträng förstärkning. c) Sekvensering resultat för Snrpn från en enda MII äggcell med båda kromosom kopior eller polära kroppen integration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna enda äggcell analys innehåller många steg med ett nummer som är kritiska och kräver särskild omsorg. Den första är äggcellen tvätt. Det är särskilt viktigt att tvätta varje oocyt flera gånger i färskt medium sjunker efter hyaluronidas behandling för att ta bort så många cumulusceller som möjligt. Dessutom, när överföring oocyter för att sura Tyrodes lösning för zona pellucida borttagning se omgivande mediet är fri från cumulus celler. Äggcellen är mycket klibbigt efter zona bort, och alla omgivande cumulusceller kan lätt fastna i äggcellen. Det är mycket svårt att ta bort ett cumulus cell som fastnat i en zona utan äggcell. Även om detta protokoll gör det möjligt att upptäcka cumulus cellkontaminering vid senare tidpunkter, är det inte konstruktivt, eller ekonomiskt, att genomgå en fullständig protokollet om oocyter som sannolikt kommer att kasseras.
Den andra kritiska steget är äggcellen inbäddning. När du bäddar in ägget i agaros och lysär lösning, är det viktigt att notera att med låg smältpunkt (LMP) agaros härdar vid temperaturer så litet som 5 ° C under 70 ° C. Därför rekommenderar vi att blanda agaros och lys-lösning vid 70 ° C, och sedan placera den individuella oocyten på objektglas i minimalt medium. När klar, pipett agarosen / lys lösning och bädda in äggcellen in i en preparerad Eppendorf rör under mineralolja, på ett försiktigt men snabbt sätt.
Det är kritiskt att värmeinaktivering av proteinas K utföras vid 90 ° C under 2,5 minuter. Avvikelse från detta inte rekommenderas. Högre temperaturer eller längre tider kan skada DNA, medan lägre temperaturer eller kortare tider inte kan inaktivera proteinas K.
Som en påminnelse, natriumbisulfit och hydrokinon är ljuskänsliga. Bör beredas och sedan insvept i folie, gult rör och / eller placeras i en mörk låda fram till användning. När väl bisulfit-lösning har tillsatts till than rör, bör röret vara täckt med folie eller ett mörkt täckt påsen när inkubering vid 50 ° C. Vi använder tomma foliepåsar från GE Healthcare som ursprungligen innehöll hot start PCR pärlor.
Slutligen, som med de flesta PCR, rekommenderar vi att förbereda varje runda i tid. Kraftiga förseningar, särskilt efter blandning vid 70 ° C, kommer att minska framgång för förstärkning.
Vid den aktuella tiden är en begränsning av det protokoll som andelen framgångsrika bisulfitkonverterat DNA-amplifiering från enskilda oocyter varierar från 40% till 65% beroende på det förstärkta genfragmentet. Medan ytterligare felsökning kan öka denna procentsats finns en trade-off mellan bisulfit omvandlingen behandlingen är för lång eller hårt och inte har tillräckligt omräkningskurser (> 85-90%). En andra begränsning är att för närvarande bisulfit mutagenes inte kan skilja mellan undertryckande 5-metylcytosin och demetyleringen mellanprodukten 5-hydroxymethylcytosine 13.
Flera modifikationer kan krävas på grundval av gen eller region av intresse. Den bisulfit omvandlingstid kan kräva optimering för den högsta omvandlingen andelen med den lägsta DNA-skador. Vi föreslår ett område av 2,5 till 4 timmar (Halvtimmessteg) för behandling med bisulfit. Ytterligare optimering kan innebära PCR primer design för konverterade sekvenser av intresse (t.ex. http://www.urogene.org/methprimer/ ), samt optimering av PCR-program som bygger på fragment length och CG innehåll (se Patterson et al. för ytterligare bisulfite mutagenes optimeringsalternativ 7). En sista ändring är att gel utvinning av 2: a omgången PCR-produkten kan krävas om det finns rikligt primer-dimerer eller icke-specifika amplikoner som kommer att integreras i vektorn vid klonas.
Vi har tidigare visat att dennaprotokoll är effektiv för enskilda MII oocyter 12. Vi har också testat effektiviteten på växande oocyter med en rad olika äggcell diametrar, med samma andelen framgångsrika förstärkning av konverterade DNA. Viktigt i jämförelse med andra förfaranden bisulfite mutagenes, som inte är effektiva för metylering studier på en enskild cell gör detta protokoll analysen av DNA-metylering av enskilda oocyter och tidiga embryon. Detta är viktigt för reproduktion och utvecklingsbiologi studier, särskilt när det hänför sig till manipulationer könsceller och tidiga embryon. Framtida tillämpningar kan innefatta analys av mönster DNA metylering i enstaka celler av alla ursprung, inklusive in vivo-härledda och odlade celler. Dessutom har vi utvecklat en individ blastocysten analys som återvinner DNA och RNA från samma embryo, vilket möjliggör både uttryck och data metylering skall erhållas. En framtida ansökan kommer att innebära att ändra single äggcell analys att återhämta RNA för uttryck analyser samt DNA för metylering analyser. En annan optimering skulle vara att utföra duplex analyser för samma äggcellen, liknande El Hajj et al 14, vilket skulle möjliggöra metylering detektering vid ett somatiskt metylerad, äggcellen-embryo unmethyated gen, vilket möjliggör detektion av cumulus cellerna kontamineras.
DNA-metylering analys kan variera från Genomvid till locus-specifik. Genome-omfattande metoder såsom metylerat DNA immunfällning (MeDIP) i samband med microarrays eller sekvensering kräver normalt rikliga mängder av material. Locus-specifika metoder som inkluderar kombinerad analys bisulfit begränsningar (COBRA) med metylering-specifika restriktionsenzymer, eller MethylDetector kit (Active Motif), är mindre än optimal för enskilda blastocyst analyser, vilket resulterar i otillräcklig återhämtning av DNA, PCR fördomar och brist på reproducerbarhet. Ett alternativt tillvägagångssätt för enda oocyt och eArly embryo metylering analys utnyttjade EZ-DNA-metylering kit (Zymo Research) med en begränsad utspädning bisulfit pyrosekvensering teknik 14, även om de rapporterade andelen framgångsrika bisulfitkonverterat DNA-amplifiering var lägre än den metod som beskrivs här.
Bisulfit mutagenes är den gyllene standarden för att analysera DNA-metylering, och det är uppenbart att analysen av enskilda celler är ett viktigt steg framåt. Agaros bädda tillåter mindre urvalsstorlek som skall analyseras med bisulfit behandling, eftersom agaros skyddar mot DNA nedbrytning och förhindrar DNA-förlust under många protokoll steg. Emellertid, jämfört med blastocysten, har en enda oocyt ungefär 3-6 pg genomiskt DNA. Vår modifierat protokoll, som bäddar in enstaka oocyter i agaros innehåller lyseringsbuffert förhindrar börjar DNA-förlust i den inledande lys steg och moderata den hårda bisulfit behandling. Sammanfattningsvis är fördelen av en enda äggcell analys som det gördetektion av oavsiktlig cumulus cellkontaminering samt avslöja sällsynta händelser och eliminera eventuella PCR-bias i poolade prover. Sammantaget ger denna modifierade protokoll kvalitetsdata på metylering tillstånd enskilda oocyter och tidiga embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av University of Western Ontario, Institutionen för obstetrik och gynekologi, och ett bidrag ER06-02-188 från den Ministryof forskning och innovation, Early forskare Award. MMD fick stöd av en CIHR utbildning i Reproduktion, tidig utveckling och påverkan på hälsan (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
