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Immunology and Infection

Intracellular खिलाफ एक परजीवी Antileishmanial स्क्रीनिंग के लिए बचाव और परिवर्तन परख Published: December 30, 2012 doi: 10.3791/4054
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, University of Mississippi, 2Department of Pharmacology, University of Mississippi

Summary

THP1 संक्रमित कोशिकाओं के साथ एक परजीवी बचाव और परिवर्तन परख

Protocol

1. बनाए रखने और subculture THP1 सेल संस्कृति

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में RPMI 1640 मध्यम में THP1 कोशिकाओं (10% FBS और पीएच 7.4 के साथ) रखें.
  2. उपसंकृति दो बार एक सप्ताह 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक से सेल गिनती को रोकने कोशिकाओं. यह उनके परिवर्तन की क्षमता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

2. बनाए रखने और उपसंकृति लीशमैनिया डोनोवनी Promastigotes संस्कृति

  1. एल बनाए रखने के डोनोवनी RPMI 1640 में (S1, सूडान तनाव) 10% FBS के साथ (सोडियम बिकारबोनिट सोडियम पाइरूवेट के बिना) 26 डिग्री पर मध्यम सी. promastigotes
  2. उपसंकृति एल डोनोवनी एक सप्ताह में दो बार promastigotes, उच्चतम 20-25x10 6 promastigotes / ml.Caution की रेंज में कोशिकाओं एकाग्रता के साथ: सभी मीडिया और समाधान का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान में लाया जाना चाहिए.

3. और एक 9 में THP1 कोशिकाओं के भेदभाव सीडिंग6 अच्छी तरह Microplate और 16-कक्ष ग्लास संस्कृति स्लाइड.

  1. 2.5x10 5 कोशिकाओं / एक सेल चार दिन पुरानी संस्कृति से मिलीलीटर (सेल गिनती 10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए) के RPMI 1640 में 10% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ सेल गिनती के साथ एक पतला THP1 संस्कृति तैयार. संस्कृति की 20 मिलीलीटर प्रत्येक 96-अच्छी तरह से और प्रत्येक कक्ष 16 अच्छी तरह से स्लाइड के लिए संस्कृति के 4 मिलीलीटर प्लेट के लिए तैयार रहो.
  2. 12-myristate (पीएमए) 13 - एसीटेट (THP1 के भेदभाव के लिए) पतला सेल संस्कृति निलंबन (10 μl/20 DMSO में 50 ग्राम / मिलीलीटर के स्टॉक से मिली संस्कृति) (पतला कोशिकाओं संस्कृति में अंतिम PMA एकाग्रता होना चाहिए phorbol जोड़ें 25 एनजी / एमएल).
  3. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख की तुलना करने के लिए, स्पष्ट, फ्लैट नीचे, 96-अच्छी तरह से थाली और 16-कक्ष, कांच, सूक्ष्म संस्कृति स्लाइड में एक साथ assays सेट.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से या कक्ष THP1 PMA-इलाज कोशिकाओं की 200 μl बांटना.
  5. 96-अच्छी तरह से पी सेतेlates और एक 37 डिग्री सेल्सियस में 16 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं के लगभग पूर्ण भेदभाव की अनुमति रातोंरात.

नोट: THP1 कोशिकाओं है, जो आम तौर पर निलंबन में बढ़ने पक्षपाती मैक्रोफेज में भेदभाव कर रहे हैं.

4. परिवर्तित लीशमैनिया डोनोवनी Promastigotes साथ THP1 कोशिकाओं का संक्रमण

  1. विभेदित THP1 लीशमैनिया डोनोवनी promastigotes साथ सेल संस्कृति के संक्रमण के लिए, परजीवी के बहुमत संक्रामक metacyclic मंच (लंबी बेलनाकार रूपों, ~ दिन 5-6 पुरानी संस्कृति) में होना चाहिए.
  2. एक 1:10 THP1 परजीवी अनुपात सेल दोनों डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती परख और Promastigote बचाव परिवर्तन - परख में संक्रमण के लिए इष्टतम है.
  3. एल एक पतला संस्कृति तैयार से: डोनोवनी 2.5x10 6 परजीवी / एमएल के एक परजीवी गिनती (परजीवी अनुपात 1:10 = THP1 कोशिकाओं के लिए) के साथ promastigotesRPMI 1640 2% FBS के साथ मध्यम में 5 से 6 दिन पुरानी संस्कृति है.
  4. 3.5 कदम (THP1 सेल संस्कृति के रातोंरात भेदभाव के बाद) से बाहर प्लेटों और चैम्बर स्लाइड लेने, मध्यम हटाने और सेल संस्कृतियों सीरम मुक्त RPMI +१,६४० माध्यम से एक बार धो.
  5. के सावधान धोने के बाद PMA-इलाज सीरम मुक्त, गर्म RPMI 1640 (37 ~ ° सी) मध्यम, एल के पतला संस्कृति के 200 μl साथ मध्यम सीरम मुक्त की जगह के साथ THP1 कोशिकाओं डोनोवनी (2.5x10 6 परजीवी / एमएल) promastigotes 4.3 कदम से. प्रत्येक प्लेट और 16 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में THP1 कोशिकाओं के बिना परजीवी बिना THP1 कोशिकाओं और परजीवी के नियंत्रण कुओं सेट.
  6. परजीवी THP1 सेल संस्कृति के लिए जोड़ने के बाद, 37 में थाली और स्लाइड सेते हैं डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 परजीवी विभेदित THP1 कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति है.

5. संक्रमित मेक्रोफेज की टेस्ट ड्रग्स / यौगिकों के साथ उपचार

  1. परीक्षणAmphotericin बी, Pentamidine और स्क्रीनिंग के लिए मानक विरोधी leishmanial दवाओं के रूप में Miltefosine. पानी या DMSO अभिकर्मक तालिका में उल्लेख / दवाओं के परीक्षण के यौगिकों का जायजा समाधान तैयार. टेस्ट 6 सांद्रता में प्रत्येक दवा मिश्रित.
  2. Serially (01:05) का एक ताजा 96 अच्छी तरह से या RPMI +१,६४० 2% FBS के साथ मध्यम के साथ थाली 2 मिलीलीटर ट्यूब (कक्ष स्लाइड्स के लिए) में मानक दवाओं और परीक्षण यौगिकों पतला. / इस थाली में दवाओं के परीक्षण यौगिक सांद्रता अंतिम सांद्रता के 2X हैं.
  3. संस्कृति प्लेटें और चैम्बर स्लाइड एल से संक्रमित धो डोनोवनी (4.5 कदम से) promastigotes सीरम मुक्त मध्यम RPMI 1640 के साथ कम से कम 5 बार. प्रत्येक अच्छी तरह / चेंबर में 100 μl संस्कृति मध्यम (2% FBS साथ RPMI 1640) जोड़ें. कई धोने गैर भली भाँति promastigotes का पूरी तरह हटाने को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं.
  4. Serially पतला मानक विरोधी leishmanial दवाओं या परीक्षण यौगिकों से प्रत्येक अच्छी तरह से या चैम्बर के लिए 100 μl मध्यम जोड़ें. Infec सेटटेड THP1 कोशिकाओं दवाओं के बिना एक साथ प्रत्येक स्लाइड / प्लेट चैम्बर नियंत्रण में है.
  5. 37 प्लेटें और चैम्बर स्लाइड सेते डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2.

6. चैम्बर स्लाइड धुंधला, फ्लोरोसेंट खुर्दबीन इमेजिंग और संक्रमण की मात्रा के लिए छवि विश्लेषण और औषध उपचार का प्रभाव

  1. एक 48 घंटा ऊष्मायन के बाद, चैम्बर स्लाइड सीरम मुक्त RPMI +१,६४० माध्यम से 3 बार धो लो. स्लाइड से प्लास्टिक कक्षों छीलकर और 30 सेकंड के लिए मिथेनॉल में स्लाइड डुबो कर कोशिकाओं को ठीक. Airflow तहत सुखाने के लिए जैव हुड में स्लाइड को छोड़ दें.
  2. (1:2,000) (10,000 एक्स) पानी के साथ शेयर कमजोर द्वारा एक SYBR ग्रीन धुंधला हो जाना मैं समाधान (5X) तैयार करें.
  3. अंधेरे शर्तों के तहत पतला SYBR ग्रीन मैं कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए समाधान दाग के साथ स्लाइड दाग, पानी के साथ एक बार धोने और हवा का प्रवाह के तहत सुखाने के लिए स्लाइड छोड़.
  4. Stai पर एक पूरा गिलास coverslip रखेंनेड बढ़ते मध्यम की मदद के साथ स्लाइड.
  5. कब्जा डिजिटल छवियों THP1 कोशिकाओं के संक्रमण (रिक्त) के बिना संक्रमण के साथ, (नियंत्रण), संक्रमित कोशिकाओं को अलग मानक दवाओं या अलग dilutions में परीक्षण यौगिकों (चित्रा 3, 5 और 6)) एक Nikon ग्रहण 90i फ्लोरोसेंट साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के साथ इलाज एनआईएस तत्व एआर 3.2 सॉफ्टवेयर के द्वारा.
  6. बृहतभक्षककोशिका (बड़ा) नाभिक और परजीवी नाभिक (kinetoplast के साथ छोटे) ImageJ (7 चित्रा), जो एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है, छवि जावा आधारित प्रसंस्करण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (कम विकसित कार्यक्रम है का उपयोग कर की गणना http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). डेटा एक्सप्रेस के रूप में 100 से प्रति amastigotes के संख्या THP1 कोशिकाओं बदल दिया.

7. परजीवी बचाव - परिवर्तन परख: एल की नियंत्रित lysis डोनोवनी Amastigotes संक्रमित मैक्रोफेज

  1. कदम से microplate 96-अच्छी तरह से धो 5.5 सीरम मुक्त RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम के साथ तीन बार.
  2. अलग अलग सांद्रता, 30 के लिए 0.05% एसडीएस उपचार पर परीक्षण किया डिटर्जेंट में सेकंड नियंत्रित lysis (बचाया 'परजीवी व्यवहार्यता का कम से कम नुकसान के साथ अधिकतम सेल) के लिए इष्टतम है.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से पिछले धोने के बाद सीरम मुक्त मध्यम निकालें और एक अच्छी तरह से RPMI 1640 के 20 μl जोड़ने (0.05% एसडीएस के साथ). 30 सेकंड के लिए थाली हिला और एक अच्छी तरह से 180 μl RPMI १६४० पूरा (10% FBS के साथ) जोड़ने.
  4. 26 डिग्री सेल्सियस पर promastigotes बचाया amastigotes के परिवर्तन के लिए 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.

8. परिवर्तित Promastigote के मात्रात्मक विश्लेषण (alamarBlue परख)

  1. एक 48 में में 26 घंटा ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस, सभी बचाया रहते हैं amastigotes promastigotes (चित्रा 1D) में तब्दील हो रहे हैं. 96-अच्छी तरह से पी के प्रत्येक कुएं में alamarBlue की 10 μl जोड़ेंlates.
  2. 26 ° रातोंरात सी प्लेटें सेते हैं.
  3. रातोंरात ऊष्मायन के बाद, 544 एनएम उत्तेजना, 590nm उत्सर्जन में एक Fluostar आकाशगंगा fluorimeter (बीएमजी लैब टेक्नोलॉजीज) पर मानक प्रतिदीप्ति के लिए प्लेट पढ़ने.
  4. (7-9 आंकड़े) ExcelFit और इन घटता से गणना 50 / आईसी 90 मूल्यों (1 टेबल) आईसी के साथ खुराक प्रतिक्रिया घटता (प्रतिशत बनाम दवा या परीक्षण परिसर के विकास एकाग्रता) तैयार.

9. THP1 प्रकोष्ठों के परजीवियों अनुपात मानकीकरण

  1. परजीवी अनुपात THP1 कोशिकाओं मानकीकरण परख की संवेदनशीलता का निर्धारण. नोट: कम / उच्च परजीवी संख्या / संक्रमण संवेदनशीलता और स्क्रीनिंग के चयनात्मकता के साथ समझौता हो सकता है.
  2. प्रोटोकॉल के बाद THP1 कोशिकाओं बोने और लीशमैनिया promastigote संक्रमण के लिए ऊपर वर्णित उपयोग diff को छोड़कर (धारा 3 और 4) द्वारा परजीवी अनुपात THP1 कोशिकाओं मानकीकरणerent अनुपात 1:1.25, 1:2.5, 1:05 और 1:10 के रूप में परजीवी THP1 कोशिकाओं की.
  3. दोनों 16-चैम्बर (छवि विश्लेषण के लिए) स्लाइड और 96-अच्छी तरह से (परजीवी बचाव परख के लिए) की थाली प्रारूपों परजीवी बचाव और छवि विश्लेषण assays की तुलना में प्रयोग सेट.

10. नियंत्रित सेल के लिए अलग डिटर्जेंट का मानकीकरण

  1. इस प्रयोग के प्राथमिक उद्देश्य THP1 / अधिकतम पूरा THP1 कोशिकाओं lysis प्राप्त कोशिकाओं के नियंत्रित lysis के लिए काफी बचाया amastigote परजीवी की व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना प्रोटोकॉल का अनुकूलन है.
  2. टेस्ट अलग सांद्रता और उपचार के विभिन्न durations (2 चित्रा) के बीच 20, 80 बीच, ट्राइटन X-100, NP-40 और एसडीएस के रूप में विभिन्न डिटर्जेंट.
  3. परजीवी अनुपात THP1 कोशिकाओं 1:10 है और अन्य शर्तों के ऊपर 1-8 वर्गों के रूप में इसी तरह के हैं.
  4. 0.05% एसडीएस उपचार अलग उपचार समय के लिए आगे टेस्टआगे नियंत्रित सेल का अनुकूलन करने के लिए.

Representative Results

मात्रात्मक विश्लेषण दोनों डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख के लिए 24, 48, 72, और 96 घंटे के बाद दवा उपचार के लिए किया गया था

प्रत्यक्ष एल की गिनती विधि संक्रमण, डोनोवनी संक्रमित मेक्रोफेज (THP1 कोशिकाओं) निम्न समीकरण द्वारा गणना की गई है:

1 समीकरण

(amastigotes नाभिक की गणना के द्वारा निर्धारित) amastigotes / 100 बदल THP1 कोशिकाओं (गिनती THP1 सेल नाभिक में गिना द्वारा निर्धारित) (7 चित्रा) संक्रमित THP1 कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना में अलग मानक या परीक्षण यौगिकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक और अधिक सटीक उपाय है , के रूप में पिछले कुछ कागजात में सूचना दी, क्योंकि इस नंबर पर सीधे यौगिकों के समग्र प्रभाव से संबंधित है, या तो एक कमी के माध्यम सेबृहतभक्षककोशिका बृहतभक्षककोशिका cells.Infection से या परजीवी की कुल हटाने कोशिकाओं में परजीवी में संक्रमित THP1 विभिन्न समय के अंतराल (10 चित्रा और तालिका 1) के लिए अलग dilutions पर विभिन्न मानक दवाओं के साथ इलाज किया कोशिकाओं के डिजिटल छवियों से गणना की गई. पढ़ने के लिए डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख के लिए बाहर amastigotes infection/100 THP1 कोशिकाओं तब्दील हो गया था, पढ़ने के लिए बाहर जबकि परजीवी बचाव परिवर्तन - परख के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति (RFU) इकाइयों, जो था के सीधे रहते हैं लीशमैनिया संक्रमित मेक्रोफेज से बचाया amastigotes की संख्या के लिए आनुपातिक और promastigotes में बदलना. नियमित alamarBlue परख लीशमैनिया promastigotes दवा विरोधी leishmanial स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है.

परख शुरू मानकीकृत और लीशमैनिया संक्रमित कोशिकाओं THP1 नियंत्रित lysis के लिए अनुकूलित किया गया था. उद्देश्य डिटर्जेंट tre के लिए स्थिति अनुकूलनatment, है जो बचाया amastigotes की व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव साथ THP1 कोशिकाओं के लगभग पूरा lysis उपज. चित्रा 1 पूरा परख प्रोटोकॉल का एक सूक्ष्म दृश्य दर्शाया गया है. लीशमैनिया amastigotes के साथ बरकरार THP1 संक्रमित कोशिकाओं चित्रा 1A में देखा जा सकता है चित्रा 1B डिटर्जेंट उपचार के बाद THP1 कोशिकाओं के lysis से पता चलता है. चित्रा 1C पता चलता है लीशमैनिया amastigotes, जो आंशिक रूप से किया गया है चित्रा और 1D promastigotes में तब्दील बचाया में amastigotes की लगभग पूरी तरह से परिवर्तन को दर्शाता है promastigotes और उनके बाद के प्रसार. विकास इन तब्दील promastigotes के मात्रात्मक अलावा और alamarBlue के एक microplate पाठक पर प्रतिदीप्ति की माप के साथ नजर रखी जा सकती है. (2A चित्रा) एनपी-40 और Triton एक्स 100 (चित्रा 2B) के साथ उपचार संक्रमित THP1 कोशिकाओं lysed, तथापि, यह भी व्यवहार्यता प्रभावित औरबचाया amastigotes के परिवर्तन. बीच 20 (चित्रा 2C) और 80 (चित्रा 2 डी) Tween के साथ उपचार THP1 रूप कम तब्दील promastigotes की संख्या द्वारा संकेत दिया amastigotes की एक अधूरी बचाव में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के इष्टतम lysis कारण नहीं था. 30 सेकंड के लिए 0.05% एसडीएस (चित्रा 2 ई) के साथ उपचार के लगभग पूर्ण लीशमैनिया संक्रमित कोशिकाओं THP1 lysis झुकेंगे और व्यवहार्यता और बचाया amastigotes के परिवर्तन को प्रभावित नहीं किया था. आगे अनुकूलन के लिए 20-30 सेकंड (चित्रा 2 एफ) व्यवहार्य लीशमैनिया amastigotes के उच्चतम बचाव झुकेंगे 0.05% एसडीएस साथ कोशिकाओं के इलाज से पता चला है. बाद के प्रयोगों में, 0.05% एसडीएस के साथ 30 सेकंड के लिए इलाज में इस्तेमाल किया गया था. एसडीएस उपचार के लिए प्रक्रिया एक या कई प्लेटों के लिए ही है. कई प्लेटें, एसडीएस उपचार एक multichannel विंदुक के साथ स्तंभ से स्तंभ लागू किया गया था. सीरम मुक्त मध्यम थाली के एक स्तंभ के सभी 8 कुओं और 20 म्यू से हटा दिया गया था, 0,05% एसडीएस के एल उसी स्तंभ के 8 कुओं में जोड़ा गया है और RPMI 1640 के साथ 30 सेकंड के बाद 10% FBS साथ पतला. , प्लेटें परख की प्रारंभिक मानकीकरण के दौरान गैर - भली भाँति promastigotes के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच की थी. पाँच धोने की एक न्यूनतम मानक यौगिकों और तीन एसडीएस उपचार के 7 कदम से पहले आवश्यक थे धोने के साथ संक्रमित बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं के इलाज के 5 कदम से पहले परजीवी के हटाने के लिए आवश्यक थे. इस प्रकार, कोशिकाओं 8 बार धोया गया और नहीं दिखाई गैर भली भाँति promastigotes संक्रमित THP1 कोशिकाओं के नियंत्रण lysis के सामने बने रहे.

डिजिटल छवि विश्लेषण और प्रत्यक्ष गिनती

लीशमैनिया संक्रमित THP1 कोशिकाओं के डिजिटल छवियों Nikon ग्रहण 90i फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर SYBR ग्रीन मैं साथ धुंधला हो दोनों बृहतभक्षककोशिका और विशेषता kinetoplast डीएनए के साथ intracellular लीशमैनिया नाभिक नाभिक फ्लोरोसेंट फिल्टर तहत मनाया गया के बाद कब्जा कर लिया गया है (3 चित्रा). इसके अलावा, संक्रमित THP1 कोशिकाओं की छवियों को भी डीआईसी के तहत कब्जा कर लिया गया. जब दोनों छवियों विलय कर दिया गया, intracellular amastigotes साथ THP1 कोशिकाओं के रूपरेखा और अधिक स्पष्ट रूप से देखा गया था (चित्रा 4). ImageJ सॉफ्टवेयर इन छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ImageJ एक सार्वजनिक डोमेन, जावा आधारित, छवि प्रसंस्करण स्वास्थ्य (के राष्ट्रीय संस्थानों में विकसित कार्यक्रम है http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ एक खुला वास्तुकला है कि जावा plugins और रिकॉर्डयोग्य मैक्रोज़ के माध्यम तानाना प्रदान करता है के साथ बनाया गया है. कस्टम अधिग्रहण विश्लेषण, और प्रसंस्करण plugins ImageJ में निर्मित संपादक और एक जावा संकलक का उपयोग कर विकसित किया जा सकता है. अंतर THP1 कोशिकाओं और ImageJ परजीवी नाभिक नाभिक की गिनती के लिए, छवि ImageJ में खोला गया था. सेल काउंटर सॉफ्टवेयर के प्लगइन में विकल्प विश्लेषण में पाया गया था. छवि initialized है और सेल काउंटर 1 प्रकार THP1 ग के लिए चुना गया थापक्ष नाभिक और सेल काउंटर 2 प्रकार के परजीवी नाभिक (3 चित्रा) के लिए चुना गया था. विभेदकों गिनती कम से कम 200 THP1 सेल नाभिक और intracellular इन THP1 सेल नाभिक में मौजूद amastigotes के लिए किया गया था. परजीवी बचाव परख और छवि विश्लेषण पद्धति की तुलना में अलग बृहतभक्षककोशिका साथ THP1 कोशिकाओं की संक्रामकता का मूल्यांकन करने के लिए बनाया गया था: promastigote अनुपात: promastigotes अनुपात (4 चित्रा) 5 चित्रा THP1 कोशिकाओं में अलग बृहतभक्षककोशिका में अंतर संक्रामकता का प्रतिनिधित्व करता है. दोनों तरीकों तुलनीय परिणाम और बृहतभक्षककोशिका दिखाया: 1:10 के promastigote अनुपात इष्टतम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रामकता झुकेंगे.

एक बार parasite-rescue/transformation परख और डिजिटल छवि विश्लेषण के लिए शर्तों को अनुकूलित किया गया, इन assays की उपयोगिता विरोधी leishmanial दवा स्क्रीनिंग के लिए मूल्यांकन किया गया था. लीशमैनिया संक्रमित कोशिकाओं THP1 मानक एक अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गयाnti अर्थात् leishmanial दवाओं amphotericin बी, और अलग समय 24 से 96 घंटे के लिए लेकर के अंतराल के लिए Pentamidine Miltefosine. परजीवी के लिए प्रयोग बचाया / परिवर्तन परख तीन प्रतियों में किया गया था और दो ​​प्रतियों में प्रत्यक्ष विधि गिनती कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया गया था चित्रा 6 नियंत्रण असंक्रमित, इलाज और लीशमैनिया संक्रमित संक्रमित नियंत्रण, THP1 कोशिकाओं इलाज के सूक्ष्म चित्र से पता चलता है. खुराक प्रतिक्रिया घटता परजीवी - बचाव और परिवर्तन (बदल परजीवी बनाम दवा की एकाग्रता) परख और छवि विश्लेषण परख (amastigotes/100 THP1 कोशिकाओं की संख्या) (7-9 आंकड़े) से तैयार किया गया है. आईसी 50 दवाओं की गणना ExcelFit द्वारा किया गया और 1 तालिका में प्रस्तुत कर रहे हैं. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख तुलनीय परिणाम दिखाया. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती परख 24 के प्रारंभिक समय अंक और 48 घंटा दवा टी के दौरान कम इष्टतम थाreatments, जबकि परजीवी बचाव परिवर्तन - परख अधिक दवा उपचार के बाद 24-96 घंटे के दौरान हर समय अंक पर मूल्यों के साथ संगत परिणाम दिखाया. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख के साथ परिणाम में यह अंतर अलाभकारी amastigotes की उपस्थिति के कारण डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती में दवा इलाज की शुरुआती अवधि के दौरान हो सकता है - परख.

चित्रा 1
चित्रा 1 लीशमैनिया डोनोवनी के एक सूक्ष्म दृश्य बचाव और promastigotes परिवर्तन amastigotes. एक - पक्षपाती THP1 लीशमैनिया amastigotes से संक्रमित कोशिकाओं, बी - पक्षपाती नियंत्रित lysis सी के बाद संक्रमित कोशिकाओं THP1 संक्रमित THP1 बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं D से बचाया amastigotes से लीशमैनिया डोनोवनी promastigotes तब्दील ट्रॅन का विकास और प्रसारsformed लीशमैनिया डोनोवनी promastigotes.

चित्रा 2
चित्रा 2. लीशमैनिया संक्रमित कोशिकाओं से अलग डिटर्जेंट के साथ THP1 THP1 कोशिकाओं और बचाव amastigotes lysis के संक्रमित THP1 कोशिकाओं की नियंत्रित lysis का अनुकूलन के के लिए promastigotes रहते हैं लीशमैनिया डोनोवनी amastigotes और उनके परिवर्तन की अधिकतम बचाव हासिल है. विश्लेषण. डिटर्जेंट के दो (0.05% और 0.1%) सांद्रता और उपचार के लिए दो समय अवधि (30 सेकंड और 60 सेकंड) का परीक्षण किया गया. RFU = रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों. प्रत्येक बार डुप्लीकेट टिप्पणियों के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है. [एक] NP-40 उपचार THP1 कोशिकाओं की lysis का कारण और भी बचाया amastigote परजीवी की व्यवहार्यता प्रभावित. [बी] ट्राइटन X-100 treatmeNT THP1 कोशिकाओं की lysis के कारण होता है और भी बचाया amastigote परजीवी की व्यवहार्यता प्रभावित [सी] 80 Tween THP1 कोशिकाओं के आंशिक lysis कारण amastigotes बचाव. [डी] 80 Tween THP1 कोशिकाओं के आंशिक lysis कारण amastigotes बचाव. [ई ] एसडीएस उपचार THP1 कोशिकाओं के लगभग पूरा lysis के कारण होता है और 30 / 0.05% पर प्रभावित किया नहीं बचाया amastigotes की व्यवहार्यता सेकंड [एफ] 20-30 के लिए 0.05% एसडीएस साथ उपचार सेकंड THP1 कोशिकाओं के लगभग पूरा lysis के कारण होता है और व्यवहार्य परजीवी बचाया लिए promastigotes में बदलना amastigotes बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 एक विभेदित THP1 सेल Leishmani साथ इन विट्रो में संक्रमित प्रतिदीप्त डिजिटल छवि.एक डोनोवनी amastigotes. विशेषता kDNA भी प्रत्येक परजीवी नाभिक के साथ देखा जा सकता है. बृहतभक्षककोशिका नाभिक (MN) (1) और परजीवी नाभिक (पीएन) (2) differentially और चिह्नित किया जा सकता ImageJ संक्रमण के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा differentially गिना. मात्रा का ठहराव amastigotes/100 THP1 कोशिकाओं की संख्या के रूप में किया गया था.

चित्रा 4
चित्रा 4 (कम पैनल) डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख (ऊपरी पैनल) के बीच तुलना. बृहतभक्षककोशिका: 1:10 के promastigote अनुपात इष्टतम संक्रमण झुकेंगे. दोनों तुलनीय परिणाम दिखाया. परख परजीवी बचाव कुछ पृष्ठभूमि मूल्यों दिखाया. प्रत्येक बार शो डुप्लिकेट मानों का मतलब.

चित्रा 5 चित्रा 5 THP1 अलग THP1 से लीशमैनिया promastigotes के साथ संक्रमित कोशिकाओं: promastigote अनुपात. कोशिकाओं की संख्या THP1 amastigotes/100 के रूप में मात्रात्मक परिणाम चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6 लीशमैनिया डोनोवनी से संक्रमित THP1 कोशिकाओं के डिजिटल छवियों (फ्लोरोसेंट + डीआईसी). अलग अलग समय अवधि के लिए मानक विरोधी leishmanial दवाओं के साथ इलाज के बाद amastigotes. परिणाम amastigotes/100 THP1 कोशिकाओं की संख्या के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया है और अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में प्रतिशत वृद्धि की गणना और आईसी 50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

7 चित्रा 7 चित्रा की तुलना. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी विरोधी leishmanial दवा स्क्रीनिंग (Amophotericin बी) के लिए बचाव परिवर्तन परख. संक्रमित मेक्रोफेज विभिन्न अवधियों के लिए मानक विरोधी leishmanial दवा के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. आईसी 50 (छ / मिलीलीटर) मान खुराक प्रतिक्रिया वक्र से Excelfit द्वारा गणना थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 8
8 चित्रा डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख के लिए एक तुलना.nti leishmanial दवा स्क्रीनिंग (Pentamidine). संक्रमित मेक्रोफेज विभिन्न अवधियों के लिए मानक विरोधी leishmanial दवा के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. खुराक प्रतिक्रिया घटता से आईसी 50 (छ / मिलीलीटर) मूल्यों की गणना Excelfit द्वारा किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

9 चित्रा
9 चित्रा की तुलना डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी विरोधी leishmanial दवा स्क्रीनिंग (Mitefosine) के लिए बचाव परिवर्तन परख. संक्रमित मेक्रोफेज अलग अलग समय अवधि के लिए मानक विरोधी leishmanial दवा के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. आईसी 50 मूल्यों (छ / मिलीलीटर) खुराक प्रतिक्रिया घटता से Excelfit द्वारा गणना थे.बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

टेस्ट औषध 24 घंटे एक 48 घंटा एक 72 घंटा एक 96 घंटा एक
IACA ख PRTA ग IACA ख PRTA ग IACA ख PRTA ग IACA ख PRTA ग
Amphotericin बी 0.24 ± 0.03 0.17 ± * 0.01 0.12 ± 0.04 0.20 ± 0.07 0.06 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.11 ± 0.03 0.10 ± 0.03
Pentamidine > 10 2.55 ± * 1.16 2.88 और plusmn, 0.58 1.43 ± 0.91 1.24 ± 0.35 1.52 ± 0.16 0.71 ± 0.63 0.98 ± 0.33
Miltefosine 0.38 ± 0.02 0.19 ± * 0.08 0.24 ± 0.06 0.30 ± 0.08 0.36 ± 0.02 0.16 ± 0.06 0.21 ± 0.15 0.17 ± 0.10

तालिका 1. डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी - विरोधी leishmanial दवा स्क्रीनिंग के लिए बचाव परिवर्तन - परख की तुलना. संक्रमित मेक्रोफेज विभिन्न अवधियों के लिए मानक विरोधी leishmanial दवा के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. आईसी 50 मूल्यों (छ / मिलीलीटर) खुराक प्रतिक्रिया घटता से Excelfit (7-9 आंकड़े) द्वारा गणना किए गए एक घंटे के बाद नशीली दवाओं के उपचार, ख IACA = छवि विश्लेषण और प्रत्यक्ष गिनती.परख, ग PRTA = परजीवी बचाव और परिवर्तन परख. छ / मिलीलीटर के रूप में दिए गए मानों 50 आईसी (परजीवी विकास में 50% निषेध के कारण दवा की एकाग्रता) कर रहे हैं और मतलब ± कम से कम तीन प्रयोगों के एसडी हैं. * सांख्यिकीय विभिन्न (0.05 <) आईसी IACA साथ 50 मूल्यों की तुलना में.

Discussion

वहाँ कई विरोधी leishmanial दवा के आधार पर बृहतभक्षककोशिका - amastigote मॉडल की स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध तरीके हैं. Assays मेजबान जानवरों से अर्थात् peritoneal exudate (पीईसी) कोशिकाओं परिधीय रक्त monocyte कोशिकाओं (PBMC) एकत्र मैक्रोफेज के साथ किया जा सकता है 6 या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न (BMM) मैक्रोफेज या माउस के रूप में monocytic सेल लाइनों में (J774 और RAW264.7 7) और मानव (THP1, U937, HL-60) 8 monocytic कोशिकाओं. assays, जो मेजबान कोशिकाओं को विभाजित उपयोग सुनिश्चित करना चाहिए कि दोनों परजीवी और मेजबान कोशिकाओं संख्या पर दवा गतिविधि के confounding प्रभाव माना जाता है. विभेदित प्राथमिक चूहों और चूहों जैसे विभिन्न स्रोतों से एकत्र मैक्रोफेज गैर प्रकृति में विभाजित कर रहे हैं, लेकिन इन सेल तैयारियाँ सजातीय सेल आबादी नहीं हो सकता है. व्युत्पन्न Monocytic कोशिकाओं सेल लाइनों प्रकृति में समरूप और स्क्रीनिंग बृहतभक्षककोशिका - amastigote आधारित के लिए एक बेहतर मॉडल हैं. Diffe बाहर अलग monocytic सेल लाइनों की,rentiated THP1 कोशिकाओं (मानव तीव्र monocytic लेकिमिया सेल लाइन) एक monolayer गैर विभाजित फार्म और प्राथमिक पृथक मैक्रोफेज के लिए एक आकर्षक विकल्प की पेशकश कर सकते हैं.

स्क्रीनिंग बृहतभक्षककोशिका - amastigote आधारित कई तरीकों से किया जा सकता है. शास्त्रीय सूक्ष्म प्रत्यक्ष सेल और परजीवी 9 गिनती के आधार पर मूल्यांकन श्रम गहन है. स्वचालन की अनुपस्थिति इस परख की उपयोगिता की सीमा. कोशिकाओं की गिनती के लिए समय लगता है और परजीवी व्यवहार्यता का एक धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से दृढ़ संकल्प के बाद से आईसी 50 मूल्यों के गलत निर्धारण दे सकता है मुश्किल है. कई फ्लोरोसेंट रंजक और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रवाह cytometric 10 assays, 11 के लिए नियोजित किया जा सकता है, लेकिन इन assays भी कम संवेदनशीलता और नशीली दवाओं के उपचार के केवल एक दिन के लिए समय अंतराल के सीमा के कारण सीमित कर रहे हैं. वहाँ कई रिपोर्टर जीन intracellular 12,13,14 amastigotes के विकास को बढ़ाता के लिए उपलब्ध assays हैं. एक आटोमैटिकएड स्क्रीनिंग संवाददाता जीनों का उपयोग संभव हो सकता है, हो सकता है, लेकिन इन assays भी कुछ कमियां हैं. सबसे पहले, इन assays के बहुमत रिपोर्टर जीन की episomal अभिव्यक्ति है, जो एक दवा स्क्रीनिंग प्रयोग के लिए आदर्श नहीं हो सकता है को बनाए रखने के लिए दवा के चयन की आवश्यकता है. जिस तरह से रिपोर्टर जीन शुरू की है भी परजीवी के शारीरिक गुणों को प्रभावित कर सकता है और स्क्रीनिंग पर एक प्रभाव है. यदि संवाददाता जीन एक episomal प्लाज्मिड के हिस्सा है, रिपोर्टर के सापेक्ष उत्पादन ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज्मिड के प्रति 14 दवा की गतिविधि पर बजाय (जो सेल से सेल को बदलता है) संख्या पर निर्भर हो सकता है. कुछ रिपोर्टर परजीवी बदल रहे हैं जो परजीवी चयनात्मक रिपोर्टर जीन को बनाए रखने के दबाव की जरूरत नहीं है, तथापि, वहाँ जैविक परिणाम जीनोमिक वास्तुकला में खलल न डालें या सिर्फ विदेशी रिपोर्टर 15 प्रोटीन की मौजूदगी से हो सकता है. कुछ रिपोर्टर जीन आधारित assays में, वहाँ रहे हैंसंवेदनशीलता और पृष्ठभूमि 16 गतिविधि के मुद्दों. सबसे महत्वपूर्ण बात, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति assays, GFP gene15 संवाददाता के साथ विशेष रूप से एक के कई जीवित और मृत intracellular amastigotes के बीच अंतर नहीं कर सकता है. Luciferase रिपोर्टर जीन पर आधारित assays जीवित और मृत intracellular amastigotes के बीच विचार है, लेकिन हो सकता है और इन assays के लिए सेल बफर सब्सट्रेट बड़े पैमाने पर 17 स्क्रीनिंग के लिए महंगे हैं. इन दोष और पिछले बृहतभक्षककोशिका - amastigote आधारित स्क्रीनिंग assays की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम विकसित किया है और अनुकूलित इस परजीवी बचाव और परिवर्तन परख. इस परख THP1 कोशिकाओं, जो अच्छा एकरूपता है और प्रकृति में मेजबान कोशिकाओं के रूप में, गैर विभाजित कर रहे हैं पर आधारित है.

परजीवी बचाव परिवर्तन - परख परख यहाँ वर्णित intracellular amastigotes की डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती के आधार पर परख करने के लिए तुलनीय है. प्रतिदीप्त और डीआईसी माइक्रोस्कोपी, डिजिटल imagImageJ से बृहतभक्षककोशिका नाभिक और परजीवी नाभिक की गिनती अंतर के लिए ई का विश्लेषण करती है और सूक्ष्म गिनती परख परिष्कृत किया है. फ्लोरोसेंट रोशनी फिल्टर और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) फिल्टर के तहत छवियों पर कब्जा intracellular परजीवियों का अधिक सटीक गिनती के लिए डिजिटल छवि की गुणवत्ता में सुधार हुआ है. दोनों फ्लोरोसेंट और डीआईसी छवियों स्पष्ट बृहतभक्षककोशिका सेल रूपरेखा और फ्लोरोसेंट intracellular नाभिक के साथ डिजिटल छवियों को प्राप्त करने के लिए विलय किया जा सकता है. बृहतभक्षककोशिका नाभिक और परजीवी नाभिक विभिन्न प्रकार से ImageJ साथ मान्यता प्राप्त किया जा सकता है. इसलिए, दोनों डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती - परख और परजीवी बचाव परिवर्तन - परख स्वचालन और स्क्रीनिंग के लिए बड़े पैमाने पर आवेदन के लिए क्षमता है. परजीवी बचाव परिवर्तन - परख में महत्वपूर्ण कदम हैं: (क) लीशमैनिया promastigotes के लिए जोखिम के बाद THP1 सेल संस्कृतियों के बार - बार धोने, गैर प्रशिक्षु के लगभग पूरी तरह हटाने को सुनिश्चित करने के लिएalized promastigotes और (ख) एसडीएस से संक्रमित THP1 कोशिकाओं के नियंत्रित lysis. दोनों कदम भी स्वचालन के साथ नियंत्रित किया जा सकता है और परख के throughput के साथ समझौता नहीं करना चाहिए. संक्रमित लीशमैनिया THP1 कोशिकाओं के परीक्षण दवाओं / यौगिकों के लिए जोखिम के बाद, धोने के दूसरे चरण शेष गैर भली भाँति परजीवी को हटा, यदि कोई हो. परजीवी बचाव परिवर्तन - परख मौजूदा सूक्ष्म, रिपोर्टर जीन और छवि विश्लेषण assays अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. परख सरल, मजबूत, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित किया जा सकता है और इसलिए नई दवा की खोज के लिए विरोधी leishmanial बड़े यौगिकों पुस्तकालयों की जांच में महत्वपूर्ण आवेदन करना चाहिए था. इसके अलावा, परख भी नैदानिक ​​की संक्रामकता का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, इन विट्रो में प्रयोगशाला लीशमैनिया के आइसोलेट्स.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

NCNPR USDA-ARS वैज्ञानिक समझौते 58-6408-2-0009 नहीं, CDMRP अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान द्वारा अनुदान पुरस्कार # W81XWH 09-2 - 0093.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Sigma-Aldrich USA P1585 Required for differentiation of THP1 cells.
RPMI-1640 Medium Invitrogen 23400021
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) Thermo Scientific Nunc 178599
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates BD Falcon 353075 Plates to perform 96-well plate assay
Amphotericin B Sigma-Aldrich USA A4888 Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml)
Pentamidine Isothionate Salt Sigma-Aldrich USA P 0547 Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml)
Miltefosine EMD Biosciences USA 475841 Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml)
Sodium Stibogluconate EMD Biosciences USA 567565 Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml)
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich USA L 5750
Fluorescence Microscope NIKON ECLIPSE 90i
Fluorescence Microplate Reader BMG Polar Star Galaxy
Mounting Medium Sigma-Aldrich USA M 1289
alamarBlue AbD Serotec BUF012 B
SYBR Green I Sigma-Aldrich USA S 9430
Sodium Bicarbonate Fisher Sci. 523500
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich USA P2256
2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich USA M6250
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11050H
Tween 20 Sigma-Aldrich USA P9416
Tween 80 Sigma-Aldrich USA P6474
Triton X-100 Sigma-Aldrich USA T8787
NP-40 Calbiochem 492016

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References

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Intracellular खिलाफ एक परजीवी Antileishmanial स्क्रीनिंग के लिए बचाव और परिवर्तन परख<em&gt; लीशमैनिया डोनोवनी</em&gt; THP1 मानव तीव्र Monocytic लेकिमिया सेल लाइन में Amastigotes
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Jain, S. K., Sahu, R., Walker, L.… More

Jain, S. K., Sahu, R., Walker, L. A., Tekwani, B. L. A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line. J. Vis. Exp. (70), e4054, doi:10.3791/4054 (2012).

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