Intracellular खिलाफ एक परजीवी Antileishmanial स्क्रीनिंग के लिए बचाव और परिवर्तन परख<em> लीशमैनिया डोनोवनी</em> THP1 मानव तीव्र Monocytic लेकिमिया सेल लाइन में Amastigotes
Summary
THP1 संक्रमित कोशिकाओं के साथ एक परजीवी बचाव और परिवर्तन परख<em> इन विट्रो में</em> के साथ<em> लीशमैनिया डोनोवनी</em> विरोधी leishmanial दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है. परख THP1 कोशिकाओं, साथ संक्रमण के promastigotes, परीक्षण दवाओं, संक्रमित मेक्रोफेज की नियंत्रित lysis, के बचाव के amastigotes, promastigotes और निगरानी promastigote विकास के लिए परिवर्तन और एक fluorometric परख के साथ प्रसार के साथ इलाज के भेदभाव शामिल है.
Abstract
Leishmaniasis is one of the world’s most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).
Protocol
Representative Results
Discussion
वहाँ कई विरोधी leishmanial दवा के आधार पर बृहतभक्षककोशिका – amastigote मॉडल की स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध तरीके हैं. Assays मेजबान जानवरों से अर्थात् peritoneal exudate (पीईसी) कोशिकाओं परिधीय रक्त monocyte कोशिकाओं (PBMC) एकत्र मैक्रोफेज के साथ किया जा सकता है 6 या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न (BMM) मैक्रोफेज या माउस के रूप में monocytic सेल लाइनों में (J774 और RAW264.7 7) और मानव (THP1, U937, HL-60) 8 monocytic कोशिकाओं. assays, जो मेजबान कोशिकाओं को विभाजित उपयोग सुनिश्चित करना चाहिए कि दोनों परजीवी और मेजबान कोशिकाओं संख्या पर दवा गतिविधि के confounding प्रभाव माना जाता है. विभेदित प्राथमिक चूहों और चूहों जैसे विभिन्न स्रोतों से एकत्र मैक्रोफेज गैर प्रकृति में विभाजित कर रहे हैं, लेकिन इन सेल तैयारियाँ सजातीय सेल आबादी नहीं हो सकता है. व्युत्पन्न Monocytic कोशिकाओं सेल लाइनों प्रकृति में समरूप और स्क्रीनिंग बृहतभक्षककोशिका – amastigote आधारित के लिए एक बेहतर मॉडल हैं. Diffe बाहर अलग monocytic सेल लाइनों की,rentiated THP1 कोशिकाओं (मानव तीव्र monocytic लेकिमिया सेल लाइन) एक monolayer गैर विभाजित फार्म और प्राथमिक पृथक मैक्रोफेज के लिए एक आकर्षक विकल्प की पेशकश कर सकते हैं.
स्क्रीनिंग बृहतभक्षककोशिका – amastigote आधारित कई तरीकों से किया जा सकता है. शास्त्रीय सूक्ष्म प्रत्यक्ष सेल और परजीवी 9 गिनती के आधार पर मूल्यांकन श्रम गहन है. स्वचालन की अनुपस्थिति इस परख की उपयोगिता की सीमा. कोशिकाओं की गिनती के लिए समय लगता है और परजीवी व्यवहार्यता का एक धुंधला प्रक्रिया के माध्यम से दृढ़ संकल्प के बाद से आईसी 50 मूल्यों के गलत निर्धारण दे सकता है मुश्किल है. कई फ्लोरोसेंट रंजक और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रवाह cytometric 10 assays, 11 के लिए नियोजित किया जा सकता है, लेकिन इन assays भी कम संवेदनशीलता और नशीली दवाओं के उपचार के केवल एक दिन के लिए समय अंतराल के सीमा के कारण सीमित कर रहे हैं. वहाँ कई रिपोर्टर जीन intracellular 12,13,14 amastigotes के विकास को बढ़ाता के लिए उपलब्ध assays हैं. एक आटोमैटिकएड स्क्रीनिंग संवाददाता जीनों का उपयोग संभव हो सकता है, हो सकता है, लेकिन इन assays भी कुछ कमियां हैं. सबसे पहले, इन assays के बहुमत रिपोर्टर जीन की episomal अभिव्यक्ति है, जो एक दवा स्क्रीनिंग प्रयोग के लिए आदर्श नहीं हो सकता है को बनाए रखने के लिए दवा के चयन की आवश्यकता है. जिस तरह से रिपोर्टर जीन शुरू की है भी परजीवी के शारीरिक गुणों को प्रभावित कर सकता है और स्क्रीनिंग पर एक प्रभाव है. यदि संवाददाता जीन एक episomal प्लाज्मिड के हिस्सा है, रिपोर्टर के सापेक्ष उत्पादन ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज्मिड के प्रति 14 दवा की गतिविधि पर बजाय (जो सेल से सेल को बदलता है) संख्या पर निर्भर हो सकता है. कुछ रिपोर्टर परजीवी बदल रहे हैं जो परजीवी चयनात्मक रिपोर्टर जीन को बनाए रखने के दबाव की जरूरत नहीं है, तथापि, वहाँ जैविक परिणाम जीनोमिक वास्तुकला में खलल न डालें या सिर्फ विदेशी रिपोर्टर 15 प्रोटीन की मौजूदगी से हो सकता है. कुछ रिपोर्टर जीन आधारित assays में, वहाँ रहे हैंसंवेदनशीलता और पृष्ठभूमि 16 गतिविधि के मुद्दों. सबसे महत्वपूर्ण बात, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति assays, GFP gene15 संवाददाता के साथ विशेष रूप से एक के कई जीवित और मृत intracellular amastigotes के बीच अंतर नहीं कर सकता है. Luciferase रिपोर्टर जीन पर आधारित assays जीवित और मृत intracellular amastigotes के बीच विचार है, लेकिन हो सकता है और इन assays के लिए सेल बफर सब्सट्रेट बड़े पैमाने पर 17 स्क्रीनिंग के लिए महंगे हैं. इन दोष और पिछले बृहतभक्षककोशिका – amastigote आधारित स्क्रीनिंग assays की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम विकसित किया है और अनुकूलित इस परजीवी बचाव और परिवर्तन परख. इस परख THP1 कोशिकाओं, जो अच्छा एकरूपता है और प्रकृति में मेजबान कोशिकाओं के रूप में, गैर विभाजित कर रहे हैं पर आधारित है.
परजीवी बचाव परिवर्तन – परख परख यहाँ वर्णित intracellular amastigotes की डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती के आधार पर परख करने के लिए तुलनीय है. प्रतिदीप्त और डीआईसी माइक्रोस्कोपी, डिजिटल imagImageJ से बृहतभक्षककोशिका नाभिक और परजीवी नाभिक की गिनती अंतर के लिए ई का विश्लेषण करती है और सूक्ष्म गिनती परख परिष्कृत किया है. फ्लोरोसेंट रोशनी फिल्टर और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) फिल्टर के तहत छवियों पर कब्जा intracellular परजीवियों का अधिक सटीक गिनती के लिए डिजिटल छवि की गुणवत्ता में सुधार हुआ है. दोनों फ्लोरोसेंट और डीआईसी छवियों स्पष्ट बृहतभक्षककोशिका सेल रूपरेखा और फ्लोरोसेंट intracellular नाभिक के साथ डिजिटल छवियों को प्राप्त करने के लिए विलय किया जा सकता है. बृहतभक्षककोशिका नाभिक और परजीवी नाभिक विभिन्न प्रकार से ImageJ साथ मान्यता प्राप्त किया जा सकता है. इसलिए, दोनों डिजिटल छवि विश्लेषण प्रत्यक्ष गिनती – परख और परजीवी बचाव परिवर्तन – परख स्वचालन और स्क्रीनिंग के लिए बड़े पैमाने पर आवेदन के लिए क्षमता है. परजीवी बचाव परिवर्तन – परख में महत्वपूर्ण कदम हैं: (क) लीशमैनिया promastigotes के लिए जोखिम के बाद THP1 सेल संस्कृतियों के बार – बार धोने, गैर प्रशिक्षु के लगभग पूरी तरह हटाने को सुनिश्चित करने के लिएalized promastigotes और (ख) एसडीएस से संक्रमित THP1 कोशिकाओं के नियंत्रित lysis. दोनों कदम भी स्वचालन के साथ नियंत्रित किया जा सकता है और परख के throughput के साथ समझौता नहीं करना चाहिए. संक्रमित लीशमैनिया THP1 कोशिकाओं के परीक्षण दवाओं / यौगिकों के लिए जोखिम के बाद, धोने के दूसरे चरण शेष गैर भली भाँति परजीवी को हटा, यदि कोई हो. परजीवी बचाव परिवर्तन – परख मौजूदा सूक्ष्म, रिपोर्टर जीन और छवि विश्लेषण assays अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. परख सरल, मजबूत, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित किया जा सकता है और इसलिए नई दवा की खोज के लिए विरोधी leishmanial बड़े यौगिकों पुस्तकालयों की जांच में महत्वपूर्ण आवेदन करना चाहिए था. इसके अलावा, परख भी नैदानिक की संक्रामकता का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, इन विट्रो में प्रयोगशाला लीशमैनिया के आइसोलेट्स.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCNPR USDA-ARS वैज्ञानिक समझौते 58-6408-2-0009 नहीं, CDMRP अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान द्वारा अनुदान पुरस्कार # W81XWH 09-2 – 0093.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
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