Summary
感染THP1細胞と寄生虫の救助や変態アッセイ
Abstract
リーシュマニア症は、主に途上国を中心に、最貧困層に影響を与え、世界で最も顧みられない病気の一つです。 350万人以上の人々は、リーシュマニア症に罹るリスクがあるとみなされ、約2万人の新たな症例は毎年1を発生しています。 ドノバンリーシュマニアは内臓リーシュマニア症（VL）、病気の最も致命的なフォームの原因物質である。リーシュマニア症を治療するために利用可能な薬剤の選択が2に限定され、現在の治療法は限られた効果を提供し、多くは治療用量で有毒である。また、ファーストライン治療薬のほとんどはすでに増加多剤耐性3のためにそれらの有用性を失っている。抗リーシュマニア薬の現在のパイプラインもひどく消耗しています。持続的な努力は、新しい抗リーシュマニア創薬パイプラインを豊かにするために必要であり、この努力は、in vitroスクリーニングモデルにおいて適当の可用性に依存しています。
in vitroの前鞭4、無菌無鞭毛アッセイ5 においては、主しかしながら、細胞内の無鞭毛と比較して有意な細胞の、生理学的、生化学的および分子の違いに適切でないかもしれない抗リーシュマニア薬のスクリーニングのために使用されます。マクロファージ無鞭毛モデルとアッセイはリーシュマニア症の病態生理学的条件に最も近いと考えられ、したがって、in vitroスクリーニングにおいて最も適していますされています。隔離された初代マクロファージに代わる差別化、非分裂ヒト急性単球性白血病細胞（THP1）（魅力的）、および細胞内無鞭毛に対する種々の化合物の抗リーシュマニア活性を測定するために使用することができる。
ここでは、純粋な化合物とprod自然をスクリーニングするためのドノバンリーシュマニアを用いた in vitro で感染、分化THP1細胞と寄生虫の救助や形質転換試験を提示UCTS抽出物および細胞内リーシュマニア無鞭毛に対する有効性を決定する。アッセイは、次の手順が含まれます。Lとマクロファージの（1）非分裂マクロファージ、（2）へのTHP1細胞の分化は、感染ドノバン metacyclic前鞭、無鞭毛と無鞭毛前鞭へのライブ（6）変換（3）試験薬による感染細胞の治療、（4）感染マクロファージの制御された溶解、（5）リリース/レスキュー。アッセイは前鞭に変換する能力への影響を最小限に抑えながら実行可能な細胞内無鞭毛のほぼ完全な救済を実現するためにリーシュマニア感染THP1細胞の制御された溶解用洗剤処理を使用して最適化された。別のマクロファージ：前鞭比が最大の感染を達成するために試験した。感染の定量は、救出リーシュマニア無鞭毛はアラムによって前鞭、その成長の評価には、ライブの転換を介して実行されました96ウェルマイクロプレートでarBlue蛍光分析。このアッセイは、現在使用されている顕微鏡、トランスジェニックレポーター遺伝子とデジタル画像解析アッセイに匹敵するものです。このアッセイは、堅牢であり、生死無鞭毛を区別しないことがあり、レポーター遺伝子および画像解析アッセイに比べて唯一のライブ無鞭毛細胞を測定します。また、このアッセイは抗リーシュマニア薬の現在のパネルで検証されていて正常に純粋な化合物や天然物フラクション（Tekwani ら未発表）のライブラリの大規模スクリーニングに適用されています。
Protocol
1。 THP1細胞培養を維持し、サブカルチャー
- 5％CO 2インキュベーター内で37℃でRPMI-1640培地でTHP1細胞（10％FBSおよびpH7.4の）を維持する。
- 継代培養細胞を1×10 6細胞/ mlを超えるの細胞カウントを防ぐために週に二度。これは、その変換能力を維持することが重要です。
2。維持し、サブカルチャードノバンリーシュマニア前鞭文化
- Lを維持する26で10％FBSを含むRPMI-1640培地（重炭酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウムなし）℃でドノバン前鞭（S1、スーダン株）
- サブカルチャー·Lドノバンは 20-25x10 6前鞭/ ml.Cautionの範囲で最高の細胞濃度で週2回前鞭：全てのメディアおよびソリューションは、使用前に室温に戻しておいてください。
3。 9の種まきとTHP1細胞の分化6ウェルマイクロプレートと16室のガラス文化をスライドさせて取り付けます。
- 10％熱不活性化FBSを含むRPMI-1640培地で4日齢の細胞培養から2.5×10 5細胞/ ml（細胞数は、10 6細胞/ mlを超えてはならない）の細胞数と希釈THP1文化を準備します。各16ウェルチャンバースライドの各96ウェルプレートと文化の4ミリリットルの培養の20ミリリットルを用意しました。
- 希釈された培養細胞懸濁液にホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）を（THP1の分化のための）を追加します（DMSO中50μg/ mlのストックから10μl/20mlの培養）（希薄化後の細胞培養における最終のPMA濃度は次のようになります25 ng / ml）を。
- デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイを比較するには、clear、平底96ウェルプレートと16室、ガラス、顕微鏡文化スライドで同時にアッセイを設定します。
- 各ウェルまたはチャンバへTHP1-PMAで処理した細胞を200μl分注します。
- 96 pウェルをインキュベート細胞のほぼ完全な差別化を可能にするために、5％CO 2インキュベーターで一晩37℃でlatesと16ウェルチャンバースライド、。
注：通常、懸濁液中で成長するTHP1細胞は、付着したマクロファージに分化されています。
4。 ドノバンリーシュマニア前鞭で形質転換されたTHP1細胞の感染
- ドノバンリーシュマニア前鞭との差別化されたTHP1細胞培養の感染、寄生虫の大半は感染metacyclicステージ（長い円筒形、〜5から6日齢の文化）である必要があります。
- 寄生虫比1:10〜THP1細胞は、デジタル画像解析·直接計数アッセイと前鞭毛·レスキュー変態アッセイの両方に感染するのに最適です。
- Lの希釈した培養物を準備から： ドノバンは、2.5×10 6寄生虫/ mlの寄生虫数（寄生虫比は= 1:10 THP1細胞用）と前鞭2％のFBSを含むRPMI-1640培地で5から6日間培養したもの。
- ステップ3.5（THP1細胞培養の晩分化後）から、プレートとチャンバースライドを取り出して培地を除去し、無血清RPMI-1640培地で1回細胞培養物を洗浄してください。
- 慎重に洗浄した後、PMA処理した血清を含まない、暖かい、RPMI-1640（〜37℃）培地、Lの希釈した培養液200μlに無血清培地を交換するとTHP1細胞をステップ4.3からドノバン前鞭（2.5×10 6寄生虫/ mlとなる）。各プレートと16ウェルチャンバースライドでTHP1細胞なしでTHP1寄生虫ない細胞や寄生虫のコントロールウェルを設定します。
- THP1細胞培養に寄生虫を追加した後、37℃でプレートやスライドをインキュベート℃、寄生虫は、分化THP1細胞に感染することができるように、24時間、5％CO 2を 。
5。試験薬/化合物による感染マクロファージの治療
- テストアムホテリシンB、スクリーニングのための標準的な抗リーシュマニア薬としてペンタミジンとミルテフォシン。試薬テーブルで述べたように、水またはDMSO中の薬/試験化合物のストック溶液を調製する。 6濃度の各薬物化合物をテストします。
- 直列に2％のFBSを含むRPMI-1640培地で（1:5）新鮮な96ウェルプレートまたは2 mlチューブ（チャンバースライド用）の標準的な薬剤および試験化合物を希釈します。この板における薬物/試験化合物の濃度は最終濃度の2倍です。
- L.に感染した培養プレートとチャンバースライドを洗うドノバンの前鞭（ステップ4.5から）無血清培地、RPMI-1640培地で少なくとも5回。各ウェル/チャンバーに100μlの培地（2％FBSを含むRPMI-1640）を追加します。複数回の洗浄では、非内在化前鞭の完全な除去を確実にするために必要である。
- 各ウェルまたはチャンバに直列に希釈標準的な抗リーシュマニア薬または試験化合物から100μlの培地を追加します。感染を設定各プレート/チャンバースライドで同時に薬剤を使わずにテッドTHP1細胞を制御します。
- 37でプレートとチャンバースライドをインキュベート℃、48時間、5％CO 2。
6。チャンバースライド染色、薬物治療の感染と効果の定量化のための蛍光顕微鏡イメージングと画像解析
- 48時間のインキュベーション後、無血清RPMI-1640培地でチャンバースライドを3回洗浄する。スライドからプラスチック製のチャンバーをはがして、30秒間、メタノール中のスライドを浸漬することによって細胞を固定。乾燥させるための空気の流れの下で、バイオフード内でスライドしたままにします。
- （1:2,000）株式（10,000 X）を水で希釈することにより、SYBR Green Iの染色液（5倍）を用意します。
- 私は、室温で15分間ソリューションを染色し、水で1回洗浄し、乾燥させるための空気の流れの下でスライドを残して希釈SYBR Greenで暗い条件下でスライドを染色する。
- STAIを完全にカバーガラスを置き封入剤の助けを借りて、NEDのスライド。
- THP1細胞のデジタル画像をキャプチャ：感染（ブランク）を使用せずに、感染症（コントロール）、感染した細胞は同行ニコンエクリプス90I蛍光顕微鏡を用いて種々の希釈液で異なる標準薬または試験化合物（ 図3、図5、図6））で処理NISの要素、AR 3.2ソフトウェアによる。
- マクロファージの核（大）と寄生虫核（キネトプラストと小）、国立衛生研究所（で開発された公に入手可能な、Javaベースの画像処理プログラムであるImageJは（ 図7）を使用してカウントhttp://rsbを。 info.nih.gov / IJ / download.htmlに ）。 100当たりの無鞭毛の数がTHP1細胞を形質転換されたデータを表現する。
7。パラサイト·レスキュー変態アッセイ：Lの制御溶解ドノバニ無鞭毛に感染したマクロファージ
- 無血清RPMI-1640培地で5.5ステップ3倍から96ウェルマイクロプレートを洗浄します。
- 異なる濃度、30、0.05％SDS処理でテスト異なる界面活性剤の中で秒は制御された溶解（救出寄生虫 '生存能力の損失を最小限にして最大の細胞溶解）に最適です。
- 最後の洗浄後、各ウェルからの無血清培地を除去し、各ウェルに、RPMI-1640（0.05％SDSを含む）の20μlを添加する。 30秒間、プレートを横に振ると、各ウェルに180μlの完全RPMI-1640（10％FBSを含む）を追加します。
- 前鞭に救出無鞭毛の形質転換のための48時間26℃でプレートをインキュベートする。
8。転換前鞭毛の定量分析（alamarBlueアッセイ）
- 26℃で48時間インキュベーションした後、すべての救出ライブ無鞭毛は前鞭（ 図1D）に変換されます。 96 pウェルの各ウェルにalamarBlue10μlを追加lates。
- 26℃で一晩プレートをインキュベートする。
- 一晩インキュベートした後、544 nmの励起、590nmの発光でFluostar銀河光度（BMGラボテクノロジーズ）上の標準的な蛍光のプレートをお読みください。
- ExcelFit（ 図7-9）と計算のICこれらの曲線から50 / IC 90値（ 表1）を用いて用量反応曲線を（薬剤またはテスト化合物の％の成長対濃度）を準備します。
9。寄生虫比率へTHP1細胞の標準化
- アッセイの感度を決定するために寄生虫比にTHP1細胞を標準化しています。注：低/高寄生虫番号/感染症スクリーニングの感度と選択性を損なう可能性があります。
- プロトコルはTHP1細胞の播種および使用差分除くリーシュ前鞭毛型感染（セクション3＆4）に関して上述に従って寄生虫比にTHP1細胞を標準化1:1.25などの寄生虫にTHP1細胞のerent比、1:2.5、1:5および1:10。
- 16チャンバースライド（画像解析用）と96ウェルプレート（寄生虫レスキューアッセイ用）寄生虫救出と画像解析アッセイを比較する形式で、両方の実験を設定します。
10。制御された細胞溶解用の異なる界面活性剤の標準化
- この実験の主な目的は、大幅に救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えることなく、完全な/最大THP1細胞溶解を達成するTHP1細胞の制御された溶解するためのプロトコルを最適化することです。
- 異なる濃度と治療の異なる期間（ 図2）などのTween 20、Tween 80を、トリトンX-100、NP-40およびSDSのような異なる界面活性剤をテストします。
- 寄生虫に対する比THP1細胞は1:10であり、その他の条件は、上記のセクション1から8と同様である。
- 別の処理時間をさらに0.05％のSDS処理をテストさらに制御された細胞溶解を最適化するための。
Representative Results
定量分析は、24、48、72及び96時間後の薬物治療のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの両方に対して行われた
L.の直接計数法、感染症のドノバン感染マクロファージ（THP1細胞）は、次式により算出した：
無鞭毛（無鞭毛体の核を計数することによって決定）/ 100 THP1細胞（THP1細胞核でカウントカウントすることによって決定される）（ 図7）が感染したTHP1細胞の割合は異なる規格や試験化合物の効果を分析するためのより正確な尺度で変換は、この数値を直接化合物の全体的な効果に関連しているため、どちらの減少により、以前のいくつかの論文で報告されたようにマクロファージ細胞やマクロファージcells.Infectionから寄生虫の全摘出の寄生虫の様々な時間間隔の異なる希釈（ 図10および表1）に異なった標準薬で治療感染THP1細胞のデジタル画像から算出した。デジタル画像解析ダイレクト·カウント·アッセイのための読み出し寄生レスキュー変態アッセイのための読み出しである相対蛍光単位（RFU）であったが、無鞭毛infection/100が、THP1細胞を形質転換した直接感染マクロファージから救出ライブリーシュマニア無鞭毛の数に比例し、前鞭に変身。 alamarBlueアッセイは日常リーシュ前鞭抗リーシュマニア薬のスクリーニングのために使用されます。
アッセイは、最初に標準化され、 リーシュマニア感染THP1細胞の制御された溶解用に最適化された。目的は、洗剤treのための条件を最適化することでした救出無鞭毛の生存率への影響を最小限に抑えながらTHP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらすatmentは、 図1は、完全なアッセイプロトコールの顕微鏡図を示す。 リーシュマニア無鞭毛に感染無傷THP1細胞を図1Aに見ることができます。 図1Bは、界面活性剤処理後のTHP1細胞の溶解を、 図1Cは、部分的に前鞭と図1Dに変換された救出リーシュマニア無鞭毛は、中に無鞭毛のほぼ完全な変換を展覧前鞭およびその後続の増殖。これらの形質転換前鞭の成長を定量的alamarBlueの添加とマイクロプレートリーダーで蛍光の測定を使用して監視できます。 NP-40（ 図2A）およびTriton X-100（ 図2B）を用いた治療は、感染したTHP1細胞を溶解しますが、それはまた、生存能力に影響を与えたと救出無鞭毛の転換。ツイーン20（ 図2C）およびTween 80（ 図2D）を用いた治療は、形質転換された前鞭の低い数字によって示されるように無鞭毛の不完全な救助に結果THP1細胞の最適な溶解を起こさなかった。 30秒（ 図2E）、0.05％SDSを用いた治療では、 リーシュマニア感染THP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらしたと救出無鞭毛の生存率および変換に影響を及ぼさなかった。さらなる最適化は、SECが実行可能なリーシュマニア無鞭毛（ 図2F）の最高救助をもたらした20から30、0.05％SDSを用いた細胞のその治療を示した。その後の実験では、30、0.05％SDSを用いた治療は秒が使用されました。 SDSの治療のための手順は、単一または複数のプレートでも同じです。複数のプレートには、SDS処理はマルチチャンネルピペットで列ごとに実装されました。無血清培地は、全8プレートの1列のウェルと20＆ムーから削除されました、0.05％SDSのlは同じ列の8ウェルで添加し、10％FBSを含むRPMI-1640で30秒後に希釈した。アッセイの初期の標準化の間に、プレートは非内在化前鞭を顕微鏡でチェックした。 5洗浄液の最小値は、標準化合物と3回の洗浄で感染マクロファージ細胞の治療のステップ5の前に寄生虫の除去のために必要であったSDSの治療のステップ7の前に必要であった。このように、細胞を8回洗浄し、目に見える非内在化前鞭は、感染したTHP1細胞の制御溶解前に残っていなかった。
デジタル画像解析と直接計数
リーシュマニア感染THP1細胞のデジタル画像は、（ 図3 SYBR Green Iを用いた染色特性キネトプラストDNAによるマクロファージの核と細胞内リーシュマニア核の両方が蛍光フィルターで観察した後にニコンエクリプス90I蛍光顕微鏡で捕獲された）。さらに、感染したTHP1細胞の画像もDIC下に捕獲された。両方のイメージがマージされたときに、細胞内の無鞭毛を持つTHP1細胞の輪郭が（ 図4）をより明確に見られた。 ImageJのソフトウェアは、これらの画像を分析するために使用された。 ImageJは国立衛生研究所（で開発パブリックドメイン、Javaベースの画像処理プログラムであるhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ）。 ImageJはJavaプラグインと記録可能マクロを介して拡張性を提供するオープン·アーキテクチャで設計されています。カスタム収集、解析および処理プラグインはImageJのビルトインエディタとJavaコンパイラを使用して開発することができます。 ImageJのでTHP1細胞核および寄生虫の核のカウント差のために、画像はImageJの年にオープンしました。セルカウンタは、ソフトウェアのプラグインで解析オプションで発見された。画像は初期化され、セルカウンタータイプ1はTHP1 cに選ばれましたエル核と細胞カウンタータイプ2は寄生虫核（ 図3）に選ばれました。差のカウントは少なくとも200 THP1細胞核及びこれらTHP1細胞核内に存在する細胞内無鞭毛のために行われました。寄生虫レスキューアッセイおよび画像解析法の比較は別のマクロファージとTHP1細胞の感染性を評価するために作られました。前鞭毛比：前鞭比（ 図4）図5は、別のマクロファージでTHP1細胞で差感染性を表します。どちらの方法でも同等の結果とマクロファージが認められた：1:10前鞭毛の比率が最適かつ再現性の感染性をもたらした。
parasite-rescue/transformationアッセイおよびデジタル画像解析のための条件が最適化された後、これらのアッセイの有用性は、抗リーシュマニア薬スクリーニングのために評価した。 リーシュマニア感染THP1細胞は、規格の異なる濃度で処理したすなわちNTI-リーシュマニア薬アムホテリシンB、24〜96時間の範囲の異なる時間間隔のペンタミジンとミルテフォシン。寄生虫の実験は、/形質転換試験は三重で行われた救出し、計数法直接細胞の実験は二重に行った。 図6は、未処理およびリーシュマニア感染感染感染していない、コントロールが、THP1細胞を処理した対照の顕微鏡画像を示す。用量反応曲線は、寄生虫の救助や形質転換試験（形質寄生虫対薬物の濃度）と画像解析アッセイ（amastigotes/100 THP1細胞の数）（図7-9）から調製した。薬剤のIC 50は ExcelFitによって計算し、 表1に示されている。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイは、同等の結果を示した。デジタル画像解析ダイレクトカウンティング-Assayは、24および48時間薬剤tの初期の時点の間が最適であったreatments、パラサイト·レスキューフォーメーションアッセイは、薬剤処理後24から96時間の間に全ての時点で報告された値とより一貫性のある結果を示した。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイによる結果の違いは、デジタル画像解析ダイレクトカウンティングにおける薬物治療の初期の期間中に非現実的な無鞭毛の存在が原因である可能性がありアッセイ。
図1： ドノバンリーシュマニアの顕微鏡ビューは前鞭への救助や変換を無鞭毛。 - リーシュマニア無鞭毛に感染付着THP1細胞、B -制御された溶解Cの後付着、感染THP1細胞-感染THP1マクロファージ細胞Dから救出無鞭毛からドノバンリーシュマニアの前鞭を一変- TRANの成長と増殖sformed ドノバンリーシュマニアの前鞭。
別の洗剤でリーシュマニア感染 THP1細胞から無鞭毛のTHP1細胞と救助の溶解の図2。前鞭にライブドノバンリーシュマニアの無鞭毛とその変換の最大救助を達成するために感染したTHP1細胞の制御された溶解の最適化分析。洗剤の2つの濃度（0.05％及び0.1％）と治療のための2つの期間（30秒、60秒）を試験した。 RFU =相対蛍光単位。各バーは、重複観測値の平均を表しています[A]は 、NP-40治療はTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた。[B]のトリトンX-100 treatmentはTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた[C]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解を引き起こした[D]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解が発生していました。【E 】SDS処理はTHP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、0.05％/ 30秒で救出無鞭毛の生存率に影響を及ぼさなかった。【F 20から30、0.05％SDSで]治療秒THP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、生寄生虫を救出前鞭に変身する無鞭毛。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3 Leishmani in vitro で感染し、分化THP1細胞の蛍光デジタル画像ドノバンの無鞭毛。特性kDNAも各寄生虫の核と見られる場合があります。マクロファージの核（MN）（1）および寄生虫の核（PN）（2）感染症の定量的評価のために、ImageJの解析ソフトウェアで差動でマークされ、差動でカウントすることができます。定量はamastigotes/100 THP1細胞数として行われました。
図4デジタル画像解析ダイレクトカウンティング·アッセイ（下のパネル）と寄生レスキュー変態アッセイ（上段）との比較。マクロファージ：1:10前鞭毛の比率が最適な感染をもたらした。どちらも、同等の結果を示した。寄生虫レスキューアッセイは、いくつかのバックグラウンド値を示した。各バーのショーでは、重複値の平均。
図5異なるTHP1によってリーシュマニアに感染前鞭THP1細胞：前鞭毛型比。 amastigotes/100 THP1細胞数などの定量的な結果を図4に示されている。
図6：異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬による治療後ドノバンリーシュマニアの無鞭毛に感染THP1細胞のデジタル画像（蛍光灯+ DIC）。 結果はamastigotes/100 THP1細胞数として定量化と未処理のコントロールと比較して％の成長率を計算し、IC 50値を決定するために使用された。
図7：抗リーシュマニア薬スクリーニング（Amophotericin B）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図8のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較NTI-リーシュマニア薬スクリーニング（ペンタミジン）。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図9抗リーシュマニア薬スクリーニング（Mitefosine）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
| 試験薬物 | 24時間 | 48時間 | 72時間 | 96時間 | ||||
| IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | |
| アムホテリシンB | 0.24±0.03 | 0.17±0.01 * | 0.12±0.04 | 0.20±0.07 | 0.06±0.01 | 0.06±0.01 | 0.11±0.03 | 0.10±0.03 |
| ペンタミジン | > 10 | 2.55±1.16 * | 2.88＆PLusmn; 0.58 | 1.43±0.91 | 1.24±0.35 | 1.52±0.16 | 0.71±0.63 | 0.98±0.33 |
| ミルテフォシン | 0.38±0.02 | 0.19±0.08 * | 0.24±0.06 | 0.30±0.08 | 0.36±0.02 | 0.16±0.06 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 |
表1デジタル画像解析ダイレクトカウンティングアッセイおよび抗リーシュマニア薬スクリーニングのための寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。値がExcelfit（ 図7-9）により用量応答曲線から計算したIC 50（μg/ ml）の時間後に薬物治療; ます b IACA =画像解析と直接計数アッセイ; C PRTA =寄生のRescue and形質転換試験。与えられた値は、μg/ mlのようにIC 50（寄生虫成長の50％阻害を引き起こす薬物の濃度）であり、少なくとも3つの実験の平均値±SDである。 * IACAとIC 50値と比較して（<0.05）は統計学的に異なる。
Discussion
マクロファージ無べん毛型モデルに基づく抗リーシュマニア薬スクリーニングのためのいくつかの方法があります。アッセイは、宿主動物からすなわち腹腔滲出細胞（PEC）は、末梢血単核球（PBMC）を回収したマクロファージで行うことができます6または骨髄由来マクロファージ（BMM）またはマウスなどの単球細胞株における（J774およびRAW264.7 ）7およびヒト（THP1、U937、HL-60）8球細胞。除した宿主細胞を使用するアッセイは、両方の寄生虫と宿主細胞数に対する薬物活性の交絡効果が考慮されることを確認する必要があります。マウスおよびラットのような様々な情報源から収集した差別化された初代マクロファージは自然の中で、非分裂ですが、これらの細胞調製物は、均一な細胞集団を持たない可能性があります。単球細胞由来の細胞株は、本質的に均質であるとマクロファージ無べん毛型ベースのスクリーニングのためのより良いモデルです。別の単球細胞株のうち、differentiated THP1細胞（ヒト急性単球性白血病細胞株）、非分裂組織化単分子膜を形成し、プライマリ、分離マクロファージへの魅力的な代替手段を提供することができます。
マクロファージ無べん毛型ベースのスクリーニングは、いくつかの方法で行うことができます。 9を数える直接細胞と寄生虫に基づいて古典的な顕微鏡検査は、労働集約的である。自動化の欠如は、このアッセイの有用性を制限する。細胞の計数には時間がかかりますし、染色法を通して寄生虫生存能力の判定が困難であるため、IC 50値の不正確な決定を与えるかもしれません。多くの蛍光色素およびモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーアッセイ10、11のために用いることができるが、これらのアッセイはまたのみに起因する一日に薬物治療の時間間隔の少ない感度と限界に制限されています。細胞内無鞭毛12,13,14の成長を定量化するための利用可能ないくつかのレポーター遺伝子アッセイがあります。オートマットedのスクリーニングは、レポーター遺伝子を用いた可能性がありますが、これらのアッセイはまた、いくつかの欠点を持っています。まず、これらのアッセイの大半は薬剤スクリーニング実験のための理想的でないかもしれませんレポーター遺伝子のエピソーム発現を維持するための薬剤選択が必要です。レポーター遺伝子が導入されることによって方法も寄生虫の生理学的特性に影響を与え、スクリーニングに影響を及ぼす可能性があります。レポーター遺伝子はエピソームプラスミドの一部である場合、レポーターの相対出力は、トランスフェクトされたプラスミドのコピー数（細胞から細胞へと変化する）ではなく薬14の活性に依存するかもしれません。変換されているいくつかのレポーター寄生虫は寄生虫がレポーター遺伝子を維持するために選択圧を必要としませんが、どちらかのゲノムアーキテクチャを破壊することによって、または単に外国のレポータータンパク質の存在15による生物学的影響があるかもしれません。いくつかのレポーター遺伝子ベースのアッセイでは、ある感度と背景活動16の問題。最も重要なのは、レポーター遺伝子発現アッセイは、GFPレポーターgene15特別に1、の多くが生死細胞内無鞭毛を区別しないことがあります。ルシフェラーゼレポーター遺伝子に基づくアッセイは、生者と死者の細胞内無鞭毛を見分けることができるが、これらのアッセイのための基質および細胞溶解バッファーは、大規模なスクリーニング17のために高価です。これらのデメリットとマクロファージ無べん毛型ベースの前のスクリーニングアッセイの限界を克服するために、我々は、この寄生虫救助や変態アッセイを開発し、最適化しました。このアッセイは、良好な均一性を持っており、宿主細胞として、自然の中で、非分裂アールTHP1細胞に基づいています。
ここで説明する寄生レスキュー変態アッセイアッセイは、細胞内の無鞭毛のデジタル画像解析·直接計数に基づいたアッセイに匹敵するものです。蛍光灯やDIC顕微鏡、デジタルIMAGマクロファージの核と寄生虫の核の計数差のためにはImageJによるe分析はさらに微視的計数分析を精緻化してきた。蛍光フィルターや微分干渉コントラスト（DIC）フィルタで画像をキャプチャすることは細胞内寄生体のより正確な計数のためのデジタル画像の画質を向上しています。蛍光およびDIC両方のイメージは明確なマクロファージ細胞のアウトラインおよび蛍光細胞核を有するデジタル画像を取得するためにマージすることができます。マクロファージの核と寄生虫の核は差はImageJで認識することができます。したがって、デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの両方が自動化と大規模なスクリーニングへの応用の可能性を持っています。パラサイト·レスキュー変態アッセイにおける重要なステップは次のとおりです。THP1細胞培養の（a）の繰り返し洗濯リーシュマニア前鞭への暴露後、非インターンのほぼ完全な除去を確実にするために未実現前鞭とSDSで感染THP1細胞の（b）に制御された溶解。両方の手順も自動化を制御することができる、アッセイのスループットに妥協してはいけません。もしあれば、洗浄液の第二段階は、被験薬/化合物へのリーシュマニア感染THP1細胞の曝露後に、残りの非内在化寄生虫を除去します。パラサイト·レスキューフォーメーションアッセイは、既存の顕微鏡、レポーター遺伝子および画像解析アッセイ上の重要な利点があります。アッセイは、シンプル、堅牢で再現性のある大規模なスクリーニングのために自動化することができるため、新しい抗リーシュマニア創薬のための大規模な化合物ライブラリーのスクリーニングの重要なアプリケーションを持っている必要があります。さらに、アッセイはまた、in vitroでのリーシュマニア、臨床だけでなく、実験室での分離株の感染性を評価するために適用することができます。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
NCNPR-USDA-ARSの科学協定号58-6408-2-0009; CDMRP助成賞＃W81XWH-09-2から0093米陸軍医学研究および資材コマンドによる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
