En parasit-räddning och omvandling analys med THP1 infekterade celler<em> In vitro</em> Med<em> Leishmania donovani</em> Har optimerats för anti-leishmanial drog screening. Analysen omfattar differentiering av THP1 celler, infektion med promastigotes, behandling med testläkemedel, kontrollerad lys av infekterade makrofager, räddning av amastigotes, omvandling till promastigotes och övervakning promastigote tillväxt och spridning med fluorometrisk analys.
Leishmaniasis är en av världens mest försummade sjukdomarna, till stor del drabbar de fattigaste av de fattiga, främst i utvecklingsländer. Över 350 miljoner människor som riskerar att smittas leishmaniasis, och cirka 2 miljoner nya fall inträffar årligen 1. Leishmania donovani är den orsakande agent för visceral leishmaniasis (VL), den mest dödliga formen av sjukdomen. Valet av läkemedel som finns tillgängliga för att behandla leishmaniasis är begränsad 2, nuvarande behandlingar ger begränsad effekt och många är giftiga vid terapeutiska doser. Dessutom har de flesta av de första läkemedlen linjens behandling redan förlorat sin användbarhet på grund av ökande flera läkemedelsresistens 3. Den nuvarande ledningen av anti-leishmanial läkemedel också allvarligt utarmas. Krävs fortsatta insatser för att berika en ny anti-leishmanial rörledning läkemedelsforskning, och denna strävan är beroende av tillgången på lämpliga in vitro screening-modeller.
<p cLass = "jove_content"> In vitro promastigotes 4 och axeniska amastigotes analyser 5 används i första hand för anti-leishmanial drog screening dock inte vara lämplig på grund av betydande cellulära, fysiologiska, biokemiska och molekylära skillnader i jämförelse med intracellulära amastigotes. Analyser med makrofag-amastigotes modeller anses närmast de patofysiologiska förhållanden leishmanios, och är därför den mest lämpliga för in vitro-screening. Differentierade, icke-delande humana akuta monocytiska leukemiceller (THP1) (gör ett attraktivt) alternativ till isolerade primära makrofager och kan användas för att analysera anti-leishmanial aktiviteten av olika föreningar mot intracellulära amastigotes.Här presenterar vi en parasit-räddnings-och transformationstest med differentierade THP1 celler infekterade in vitro med Leishmania donovani för screening rena föreningar och naturliga produkterdukter extrakt och bestämma effekt mot de intracellulära Leishmania amastigotes. Analysen omfattar följande steg: (1) differentiering av THP1 celler till icke-delande makrofager, (2) infektion av makrofager med L. donovani metacyclic promastigotes, (3) behandling av infekterade celler med testläkemedel, (4) kontrollerad lys av infekterade makrofager, (5) release / räddning av amastigotes och (6) omvandling av levande amastigotes till promastigotes. Analysen optimerades med tvättmedel behandling för kontrollerad lys av Leishmania-infekterade THP1 celler för att uppnå nästan fullständig räddning av livsdugliga intracellulära amastigotes med minimal effekt på deras förmåga att omvandla till promastigotes. Olika makrofag: promastigotes förhållanden testades för att uppnå maximal infektion. Kvantifiering av infektionen utfördes genom omvandling av levande, amastigotes räddade Leishmania till promastigotes och utvärdering av deras tillväxt genom en alamarBlue fluorometrisk analys i 96-brunnars mikroplattor. Denna analys är jämförbar med den för närvarande använda-mikroskopisk, transgent reportergen och digital-image analyser analys. Denna analys är robust och mäter endast de levande intracellulära amastigotes jämfört med reportergen och bild-analyser analys, som inte får skilja mellan levande och döda amastigotes. Dessutom har analysen har validerats med en aktuell panel av anti-leishmanial läkemedel och har framgångsrikt tillämpats på storskalig screening av rena föreningar och ett bibliotek av naturliga produkter fraktioner (Tekwani et al. Opublicerat).
Det finns flera metoder för anti-leishmanial drog screening baserad på makrofag-amastigote modeller. Analyser kan göras med makrofager som samlats in från värddjur nämligen peritoneala exsudatceller (PEC), perifert blod monocyt celler (PBMC) 6 eller benmärg-härledda makrofager (BMM) eller i monocytiska cellinjer, såsom mus (J774 och RAW264.7 ) 7 och humant (THP1, U937, HL-60) 8 monocytiska celler. Analyserna, som använder dela värdceller, måste se till att störande effekter av läkemedel aktivitet på både parasiten och värdceller nummer beaktas. De differentierade primära makrofager som samlats in från olika källor, såsom möss och råttor är icke-delande i naturen, men dessa cellberedningar kanske inte har homogena cellpopulationer. Monocytiska celler-härledda cellinjer är homogena till sin natur och är en bättre modell för makrofag-amastigote-screening. Av olika monocytiska cellinjer, differentiated THP1 celler (human akut monocytisk leukemi cellinje) kan bilda en icke delande monolager och erbjuda ett attraktivt alternativ till primära isolerade makrofager.
Den makrofag-amastigote-screening kan göras på flera sätt. Klassisk mikroskopisk utvärdering baserad på direkta cell och parasit räkna 9 är arbetsintensiv. Frånvaron av automatisering begränsar användbarheten av denna analys. Räkning av celler är tidsödande och kan ge felaktiga bestämning av IC50-värden eftersom bestämning av parasit livskraft genom ett färgningsprocedur är svårt. Många fluorescerande färgämnen och monoklonala antikroppar kan användas för flödescytometriska analyser 10, 11, men dessa analyser är också begränsade på grund av mindre känslighet och begränsning av tidsintervallet av läkemedel-behandling endast en dag. Det finns flera reporter gen analyser tillgängliga för att kvantifiera tillväxten av intracellulära amastigotes 12,13,14. En automated screening kan vara möjligt med användning av reportergener, men dessa analyser har också vissa nackdelar. Först, majoriteten av dessa analyser kräver läkemedelsselektion för att upprätthålla episomalt uttryck av reportergenerna, vilket inte kan vara perfekt för en drog screening experiment. Det sätt på vilket reportergenen införes kan också påverka de fysiologiska egenskaperna hos parasiten och påverkar screeningen. Om reportergenen är den del av en episomal plasmid, kan den relativa produktionen av reporter beror på kopietalet av transfekterad plasmid (som varierar från cell till cell) snarare än på aktiviteten hos läkemedlet 14. Vissa reporter parasiter som är transformerade parasiter inte behöver selektivt tryck för att bibehålla reportergenen, men kan det vara biologiska följder antingen genom att störa den genomiska arkitekturen eller bara genom närvaron av de främmande proteinerna reporter 15. I vissa baserade reporter gen analyser, finnsfrågor om känslighet och bakgrundsaktiviteten 16. Viktigast kan många av de uttryck reporter genen analyser, speciellt en med GFP reporter gene15, skiljer inte mellan de levande och döda intracellulära amastigotes. Analyser baserade på luciferas reportergen kan urskilja mellan levande och döda intracellulära amastigotes, men substrat och cell-lyseringsbuffert för dessa analyser är dyra för storskalig screening 17. För att övervinna dessa nackdelar och begränsningar av tidigare makrofag-amastigote-baserade screeningsanalyser, har vi utvecklat och optimerat denna parasit-räddning och omvandling analys. Denna analys är baserad på THP1 celler, som har god homogenitet och är icke-delande i naturen, som värdceller.
Parasiten-rescue-Transformation-analys analys som beskrivs här är jämförbar med analys baserad på digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning av de intracellulära amastigotes. Lysrör och DIC mikroskopi, digitala image analyser från ImageJ för differentiell räkning av makrofager kärnor och parasiten kärnorna har ytterligare förfinat mikroskopräkning analysen. Fånga bilder i lysrörsbelysning filter och differential interferens kontrast (DIC) filter har förbättrat kvaliteten på den digitala bilden för mer exakt räkning av de intracellulära parasiter. Både lysrör och DIC bilder kan slås samman för att erhålla digitala bilder med tydliga konturer makrofagcellinjer och fluorescerande intracellulär kärnor. Den makrofag kärnor och parasiten kärnorna kan differentiellt igen med ImageJ. Därför är både digital-bildanalys-Direkttelefon Räkning-analys och parasit-Rescue-Transformation-analys har potential för automatisering och tillämpning på storskalig screening. De kritiska stegen i Parasite-Rescue-Transformation-analys är: (a) upprepade tvättningar av THP1 cellkulturer efter exponering för Leishmania promastigotes att säkerställa nästan fullständig borttagning av icke-praktikantOrealiserade promastigotes och (b) styrd lys av de infekterade THP1 cellerna med SDS. Båda stegen kan också styras med automatisering och bör inte kompromissa med genomströmning av analysen. Det andra steget av tvättar, efter exponering av infekterade Leishmania THP1 celler testläkemedlen / föreningar avlägsnar de återstående icke-internaliserade parasiter, om något. Parasiten-rescue-Transformation-analys erbjuder betydande fördelar jämfört med befintliga mikroskopiska, reportergen och bild-analyser analys. Analysen är enkel, robust, och reproducerbar, kan automatiseras för storskalig screening och bör därför ha viktig tillämpning vid screening av stora bibliotek föreningar för nya anti-leishmanial läkemedelsforskning. Vidare kan analysen också användas för att utvärdera smittsamhet av kliniska, liksom, laboratorieisolat av Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Den NCNPR-USDA-ARS vetenskaplig enighet nr 58-6408-2-0009, CDMRP beviljande av bidrag # W81XWH-09-2-0093 från US Army Medicinsk forskning och Materielverk.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |