Summary
השיטה של העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות של
Abstract
העובר עוף מספקת המערכת מודל מצוין לחקר תפקוד גנים ורגולציה במהלך ההתפתחות העוברית. ב electroporation לג'ימי היא שיטה רבת עוצמה יתר מבטאים גנים חיצוניים או למטה, להסדיר גנים אנדוגניים in vivo עוברי עוף 1. מבנים שונים כגון פלסמידים דנ"א גנים קידוד 2-4, קטן מפריע RNA (siRNA) פלסמידים 5, קטן סינתטי RNA oligos 6, morpholino אנטיסנס 7 ניתן transfected בקלות על ידי electroporation לעוברי עוף. עם זאת, היישום של ב electroporation לג'ימי מוגבל עוברים בשלבים מוקדמים דגירה (צעירים יותר בשלב HH20 - פי המבורג המילטון) 8 ויש כמה חסרונות עבור היישום שלה עוברים בשלבים מאוחרים יותר (מעל גיל הבמה HH22 - כ 3.5 ימים של פיתוח). לדוגמה, קרום vitelline בשלבים מאוחרים יותר הוא usuברית דבק הממברנה יקבע ו פתיחת חלון במעטפת גורמת לקרע של כלי הדם, והתוצאה היא מוות של העוברים, עוברים הבוגרים מכוסים על ידי כלי vitelline ו allantoic, שם קשה לגשת ולטפל בעוברים, עוברים הבוגרים לעבור במרץ קשה לשלוט בכיוון דרך חלון קטן יחסית הקליפה.
בפרוטוקול זה אנחנו מדגימים את השיטה לשעבר electroporation לג'ימי להעברת גנים לעוברי עוף בשלבים המאוחרים (מבוגר בשלב HH22). עבור electroporation לג'ימי לשעבר, עוברים מתורבתים בצלחות פטרי 9 ו vitelline וכלי allantoic מופצים באופן נרחב. בתנאים אלה, העוברים את העוף מבוגרים ניתן לגשת בקלות מניפולציה. לכן, שיטה זו מתגברת על החסרונות של ב electroporation לג'ימי להחיל את עוברי עופות גדולים יותר. באמצעות שיטה זו, פלסמידים ניתן transfected בקלות לחלקים שוניםשל עוברי תרנגולת מבוגרים 10-12.
Protocol
1. אקס לג'ימי תרבות
- ביציות מופרות טריות מוטלות על הצד הארוך שלהם כפייה טיוטת חממה (BSS160, Ehret, גרמניה) ב 37.5 מעלות צלזיוס עם לחות 60% עבור הדגירה. ביצים המאוחסנים על 12 מעלות צלזיוס במשך שבוע יותר מ 1 אין להשתמש.
- לאחר הדגירה של 2.5 ימים (על הבמה HH17), מוציאים את הביצים לתייג העליון בעיפרון כדי לציין כיוון פיצוח.
- לפני פיצוח, יוצקים על 20 מ"ל מים סטריליים מזוקקים אל תוך צלחת פטרי נקי גדול (בקוטר של 145 מ"מ; גריינר Bio-One GmbH, גרמניה).
- מניחים עוד מנה קטנה סטרילית פטרי (בקוטר של 94 מ"מ; גריינר Bio-One GmbH) לתוך צלחת פטרי גדולה.
- לשבור את הביצים בחלק התחתון על קצה מתכת חדה, לפתוח בזהירות את הביצים ולהעביר את כל התוכן של כל ביצה לתוך צלחת פטרי קטנה.
- מכסים את צלחת פטרי גדולה עם מכסה והכניס אותו עוד חממה (בינדר GmbH, Tuttlinge, גרמניה)לתרבות נוספת ב 37.5 מעלות צלזיוס עם לחות על 60%. לאחר הדגירה של המספר הרצוי של ימים, עוברים את יכולה לשמש electroporation.
2. לקראת electroporation לג'ימי לשעבר
- משוך זכוכית נימים עם חולץ microelectrode (PUL-100 micropipette פולר, מכשירים העולם דיוק, ברלין, גרמניה) באמצעות צינורות זכוכית בקוטר של 1.0 מ"מ (TW100F-4, דיוק מכשירים בעולם) ולשבור את קצה נימי זכוכית לתוך המתאים קוטר.
- הגדרת הפרמטרים המתאימים (כלומר, מתח שונים ברקמות שונות וגודל של עוברי) עבור electroporation ולהתחבר אלקטרודות electroporator (CUY21-Edit, Nepa ג'ין, צ'יבה, יפן) על פי רקמות היעד ואת גודל של העוברים.
- הכן פתרון פלסמיד המכיל פלסמידים ב וקטור pCAGGS קידוד הגן היעד, כגון cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 בריכוז של 2.0 מיקרוגרם / μl) ואת גן דה מרקר,למשל, ירוק ניאון חלבון (GFP, pCAGGS-GFP בריכוז של 0.25 מיקרוגרם / μl). לאחר מכן הוסף גרין מהירה בריכוז סופי של 0.1% (Sigma) כדי לתייג את הפתרון פלסמיד עם צבע ירוק.
- טען את נימי זכוכית עם פתרון פלסמיד באמצעות פיפטה בפה.
3. העברת גנים לתוך Tectum עוף אופטיים על ידי electroporation לג'ימי לשעבר
- אחרי התרבות לג'ימי לשעבר, למשל, על ידי יום הדגירה (ה) 6, עוברים את עוף משמשים electroporation לג'ימי לשעבר.
- בזהירות לקרוע את קרום vitelline ו amnion על tectum עם מלקחיים אופטיים דקים ומוסיפים 3 טיפות סטרילית פתרון 0.9% נתרן כלורי על פני השטח של tectum.
- להזריק את הפתרון הפלסמיד לתוך חלל של tectum ידי נימי זכוכית בעזרת פיפטה בפה.
- הנח את האלקטרודות עם קטודה טונגסטן המחט צלחת מלבנית האנודה (CUY 661-3x7, Nepa ג'ין) לצד tectum, ומיד ליישם פולסים חשמליים (שש פעימות, 25 V, 60 אורך MS הדופק, 100 במרווחים לטרשת נפוצה בכל אחד מהמקרים) המיוצר על ידי electroporator כדי tectum.
- מכסים את צלחת פטרי גדולה עם מכסה ולהחזיר אותה לתוך אינקובטור. לאחר הדגירה של ימים המתאימים (למשל, 2 או 3 ימים לאחר electroporation), tectum נאספים שנקבע immunostaining (איור 1) זיהוי ביולוגי.
4. נציג תוצאות
Overexpression מוצלח של חלבונים חיצוניים של Cad7 ו-GFP על ידי electroporation לג'ימי לשעבר מוצג באיור 1 כדוגמה. כאשר Cad7 יחד עם פלסמיד פלסמיד ה-GFP היה electroporated אל tectum ב E6, יומיים או שלושה לאחר electroporation עוברים את נאספו קבוע. ב E8, חלבון ה-GFP מתבטא חזק tectum ב שלמים תמונות הר (איור 1 א, ג). יתר על כן, בסעיפים של tectum ב E9,חלבון ה-GFP (ירוק 1D איור) ו Cad7 חלבון (אדום באיור 1E) הם coexpressed (צהוב באיור 1F), דבר המצביע על כך electroporation לג'ימי לשעבר היא שיטה מוצלחת עבור העברת גנים לתוך עוברי עוף מבוגרים in vivo.
באיור 1. כאשר פלסמידים קידוד ה-GFP ו Cad7 הם cotransfected אל tectum עוף ב E6, יומיים או שלושה לאחר electroporation לג'ימי לשעבר, חלבון ה-GFP (ירוק) בא לידי ביטוי חזק כפי שמוצג ב E8 בתמונות wholemount (AC). בקטעים של tectum ב E9, חלבון ה-GFP (ירוק D) Cad7 חלבון (אדום E) הם coexpressed (צהוב F). BF, התמונה בשדה בהיר. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר עבור AC: 100 מיקרומטר D עבור DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק הוראות להעברת גנים לעוברי עוף מבוגרים (למשל, אל tectum אופטיים ב E6) על ידי electroporation לג'ימי לשעבר. שיטה זו מרחיבה את השימוש electroporation כדי עוברי עוף מבוגרים ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות לחקר תפקוד הגן in vivo בשלבים מאוחרים יותר. עוברים מתוך E4 לפחות E7 ניתן electroporated בהצלחה בשיטה זו ואת עוברי electroporated יכול להיות ההישרדות עד E15 11. מלבד המוח, שיטה זו יכולה לשמש גם למערכת עוף איבר 11 להעברת הגן.
תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על ידי electroporation לג'ימי לשעבר. לדוגמה, כדי להשיג הישרדות גבוהה של העוברים על ידי התרבות לג'ימי לשעבר, הביצים המשמשים צריכים להיות טריים מאוחסנים פחות מ 1 בשבוע 12 ° C; את הכלים הקטנים פטרי צריך להיות סטרילי ביצה ופיקוק ביצע בסביבות E2.5. עבור electroporation לג'ימי לשעבר,הגודל והמיקום של אלקטרודות יש לבחור בצורה נכונה על פי הבמה חלק ממוקד של העובר. כאשר שני פלסמידים הם cotransfected, את פלסמידים הזריק צריך להיות יחס מתאים של ריכוז (למשל, בין 01:08 הגן על סמן ה-GFP וג'ין ממוקדת) כדי להיות בטוח כי תאי ה-GFP המסומנים הם כמעט coexpress הגן ממוקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם קרן המחקר הגרמנית (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
