Summary
बाद में ऊष्मायन चरणों (हैम्बर्गर और हैमिल्टन (एच एच) मंच 22 से अधिक उम्र) में चिकन भ्रूण में जीन स्थानांतरण की एक विधि का वर्णन है. इस विधि के नुकसान पर काबू
Abstract
चिकन भ्रूण भ्रूण विकास के दौरान जीन समारोह और विनियमन के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करता है ओवो electroporation से अधिक व्यक्त बहिर्जात जीनों के लिए एक शक्तिशाली विधि या चिकन एक भ्रूण में vivo में अंतर्जात जीन नीचे विनियमित है. डीएनए plasmids एन्कोडिंग 2-4 जीन, छोटे दखल शाही सेना (siRNA) 5 प्लास्मिड, छोटे कृत्रिम आरएनए 6 oligos, और morpholino antisense oligonucleotides 7 के रूप में विभिन्न संरचनाओं electroporation द्वारा आसानी से किया जा सकता है चिकन भ्रूण में ट्रांसफ़ेक्ट. हालांकि, की ओवो electroporation में आवेदन जल्दी ऊष्मायन (HH20 चरण की तुलना में छोटी - हैम्बर्ग और हैमिल्टन के अनुसार) चरणों में भ्रूण के लिए सीमित है 8 और इसके बाद के चरणों में भ्रूण में आवेदन के लिए कुछ नुकसान (HH22 मंच से अधिक उम्र के हैं - लगभग 3.5 विकास के दिन). उदाहरण के लिए, बाद के चरणों में पीतक झिल्ली अमूमन हैकरेगा झिल्ली खोल में फँस गया है और एक खिड़की खोलने सहयोगी जहाजों के संबंध विच्छेद का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण की मौत, पुराने भ्रूण पीतक और अपरापोषिक वाहिकाओं, जहां यह मुश्किल है के लिए उपयोग और भ्रूण हेरफेर के द्वारा कवर किया जाता है, पुराने भ्रूण चाल सख्ती और खोल में एक अपेक्षाकृत छोटी सी खिड़की के माध्यम से ओरिएंटेशन को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है.
इस प्रोटोकॉल में हम देर चरणों (HH22 मंच से पुराने) में चिकन भ्रूण में जीन स्थानांतरण के लिए एक पूर्व ओवो electroporation विधि प्रदर्शित करता है. पूर्व ओवो electroporation के लिए, भ्रूण पेट्री 9 व्यंजन में संवर्धित कर रहे हैं और पीतक और अपरापोषिक जहाजों को व्यापक रूप से फैले हुए हैं. इन शर्तों के तहत, पुराने चिकन भ्रूण और आसानी से पहुँचा रहे हैं चालाकी से. इसलिए, इस विधि के नुकसान पर काबू ओवो बड़े चिकन भ्रूण के लिए लागू electroporation में. इस पद्धति का उपयोग करके, प्लास्मिड आसानी से विभिन्न भागों में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता हैबड़े चिकन 10-12 भ्रूण की.
Protocol
1. पूर्व ओवो संस्कृति
- ताजा निषेचित अंडे ऊष्मायन के लिए 60% आर्द्रता के साथ उनके लंबे पक्ष पर मजबूर मसौदा 37.5 (BSS160, Ehret, जर्मनी) इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस में रखी हैं. अब से एक सप्ताह के लिए 12 ° सी में संग्रहीत अंडे का इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
- HH17 चरण के बारे में 2.5 दिन () के लिए ऊष्मायन के बाद, अंडे बाहर ले और एक पेंसिल खुर के लिए दिशा का संकेत के साथ शीर्ष लेबल.
- खुर से पहले, एक साफ बड़े पेट्री डिश (; Greiner GmbH जैव एक, जर्मनी 145 मिमी व्यास) में के बारे में 20 मिलीलीटर बाँझ आसुत पानी डालना.
- बड़े पेट्री डिश में रखें, एक और छोटा सा बाँझ पेट्री डिश (Greiner जैव - GmbH के 94 मिमी व्यास).
- एक तेज धातु बढ़त के खिलाफ तल पर अंडे दरार, ध्यान से अंडे खोलने और छोटे पेट्री डिश में प्रत्येक अंडे की संपूर्ण सामग्री के हस्तांतरण.
- एक ढक्कन के साथ कवर बड़े पेट्री डिश और यह एक और इनक्यूबेटर (बांधने की मशीन GmbH, Tuttlinge, जर्मनी) में डाल दियाआगे संस्कृति के लिए 37.5 डिग्री सेल्सियस के बारे में 60% की नमी के साथ. दिनों की इच्छित संख्या के लिए ऊष्मायन के बाद, भ्रूण electroporation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. पूर्व ओवो electroporation के लिए तैयार
- 1.0-मिमी व्यास (TW100F-4, विश्व प्रेसिजन उपकरण) ग्लास ट्यूब का उपयोग, एक microelectrode (विश्व परिशुद्धता उपकरण, बर्लिन, जर्मनी पुल-100 micropipette डांड़ी) डांड़ी के साथ कांच के capillaries खींचो और उपयुक्त में एक गिलास capillaries के टिप को तोड़ने व्यास.
- Electroporation के लिए उपयुक्त मानकों (यानी, अलग भ्रूण के ऊतकों और आकार के लिए विभिन्न voltages) सेट और एक electroporator (CUY21 - संपादित करें, नेपा जीन, चिबा, जापान) के लिए इलेक्ट्रोड के कनेक्ट लक्ष्य भ्रूण के ऊतकों और आकार के अनुसार.
- और एक मार्कर जीन, एक प्लाज्मिड plasmids pCAGGS वेक्टर में एक लक्ष्य जीन कूटबन्धन, उदाहरण के लिए, cadherin7 (2.0 μg / μl के एक एकाग्रता के साथ pCAGGS Cad7 Cad7) युक्त समाधान तैयारउदाहरण के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, 0.25 μg / μl के एक एकाग्रता के साथ pCAGGS GFP). तो 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता (सिग्मा) हरे रंग के साथ प्लाज्मिड समाधान लेबल के साथ फास्ट ग्रीन जोड़ें.
- लोड प्लाज्मिड समाधान का उपयोग कर एक मुंह विंदुक के साथ केशिका गिलास.
3. जीन को चिकन ऑप्टिक Tectum में पूर्व ओवो electroporation द्वारा स्थानांतरण
- पूर्व ओवो संस्कृति के बाद, जैसे, ऊष्मायन (ई) दिन 6 द्वारा, चिकन भ्रूण पूर्व ओवो electroporation के लिए उपयोग किया जाता है.
- ध्यान से ठीक संदंश साथ ऑप्टिक tectum पर पीतक और भ्रूणावरण झिल्ली और आंसू tectum की सतह पर बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के 3 बूँदें जोड़ें.
- Tectum की गुहा में कांच द्वारा प्लाज्मिड समाधान मुंह विंदुक का उपयोग केशिका इंजेक्षन.
- टंगस्टन सुई और tectum बगल में एक आयत प्लेट anode (CUY 661-3x7, नेपा जीन) कैथोड के साथ इलेक्ट्रोड जगह है, औरतुरंत बिजली (छह दाल, 25 वी, 60 एमएस नाड़ी लंबाई, 100 प्रत्येक मामले में एमएस अंतराल) दालों tectum के लिए electroporator द्वारा निर्मित लागू होते हैं.
- बड़ा पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर और यह इनक्यूबेटर में लौटने. उपयुक्त दिन (जैसे, electroporation के बाद 2 या 3 दिन) के लिए ऊष्मायन के बाद, tectum एकत्र कर रहे हैं (चित्रा 1) Immunostaining और जैविक पता लगाने के लिए तय.
4. प्रतिनिधि परिणाम
Cad7 और पूर्व ओवो electroporation द्वारा GFP के बहिर्जात प्रोटीन की सफल overexpression एक उदाहरण के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है. जब प्लाज्मिड GFP के साथ Cad7 प्लाज्मिड साथ tectum में E6 में electroporated किया गया है, electroporation के बाद दो या तीन दिन के भ्रूण एकत्र किया गया और तय. E8 में, GFP प्रोटीन के जोरदार पूरे माउंट छवियों (चित्र 1 ए सी) में tectum में व्यक्त किया है. इसके अलावा, E9 पर tectum के वर्गों में,GFP (चित्रा 1D में हरा) प्रोटीन और Cad7 प्रोटीन (चित्र 1E में लाल) coexpressed (चित्र 1F में पीला), सुझाव है कि पूर्व ओवो electroporation vivo में बड़े चिकन भ्रूण में जीन स्थानांतरण के लिए एक सफल तरीका है.
चित्रा 1 जब प्लास्मिड एन्कोडिंग GFP और Cad7 के को चिकन tectum में में E6 पर cotransfected हैं, दो या तीन दिन पूर्व ओवो electroporation के बाद, GFP प्रोटीन (हरा) दृढ़ता से व्यक्त किया है E8 पर wholemount छवियों (एसी) में दिखाया गया है. E9 में tectum के वर्गों में, GFP (डी में हरा) प्रोटीन और coexpressed Cad7 प्रोटीन (ई में लाल) (एफ में पीला). BF, उज्ज्वल मैदान छवि. पैमाने पर पट्टी: एक में एसी के लिए 200 माइक्रोन, लोमो के लिए डी में 100 माइक्रोन.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल बड़े चिकन भ्रूण पूर्व ओवो electroporation द्वारा (जैसे, E6 में पर ऑप्टिक tectum के में) में जीन स्थानांतरण के लिए एक मार्गदर्शन प्रदान करता है. इस विधि electroporation की बड़े चिकन भ्रूण के लिए उपयोग प्रदान करता है और आसानी से बाद के चरणों में vivo में जीन समारोह के अध्ययन के लिए किया जा सकता है कई प्रयोगशालाओं को लागू. E4 से कम से कम E7 भ्रूण सफलतापूर्वक इस विधि द्वारा electroporated किया जा सकता है और electroporated भ्रूण अस्तित्व के 11 E15 जब तक हो सकता है. मस्तिष्क के अलावा, इस विधि का भी 11 चिकन अंग प्रणाली में किया जा सकता जीन स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल किया.
पूर्व ओवो electroporation द्वारा विशेष ध्यान करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. छोटे पेट्री डिश बाँझ और अंडे खुर E2.5 के आसपास में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, क्रम में पूर्व ओवो संस्कृति द्वारा भ्रूण के उच्च अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए, प्रयोग किया जाता अंडे ताजा और 12 में कम से कम एक सप्ताह संग्रहीत डिग्री सेल्सियस होना चाहिए पूर्व ओवो electroporation के लिए,इलेक्ट्रोड के स्थान और आकार सही ढंग से चरण भ्रूण लक्षित हिस्सा अनुसार चुना जाना चाहिए. जब दो प्लास्मिड cotransfected कर रहे हैं, इंजेक्शन प्लास्मिड एकाग्रता के एक उचित अनुपात (उदाहरण के लिए, मार्कर GFP जीन और लक्षित जीन के बीच 1:8) में होना करने में यकीन है कि GFP चिह्नित कोशिकाओं लगभग लक्षित जीन coexpress के होने चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (; DFG LU1455/1-1) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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