Summary
나중에 인큐베이션 단계 (햄버거와 해밀턴 무대 (HH) 22 세 이상)에서 닭 배아에 유전자 전달의 방법을 설명합니다. 이 방법은 단점을 극복
Abstract
닭 배아가 배아 발달 동안 유전자 기능과 규제를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 비켜 electroporation에는 강력한 오버 특급 외인성 유전자에 대한 방법이나 닭 배아 1 생체내의 내생 유전자를 다운 조절입니다. 이러한 유전자 plasmids 인코딩 유전자 2-4, 작은 간섭 RNA (siRNA) plasmids 5, 작은 합성 RNA oligos 6 및 morpholino 안티 센스 oligonucleotides 7 등 다양한 건축물에 쉽게 electroporation에 의해 닭 배아로 transfected 수 있습니다. 그러나 비켜 electroporation에의 응용은 초기 배양 단계 (단계 HH20 미만 - 함부르크와 해밀턴에 따라)에 배아로 제한됩니다 8, 나중 단계에서 배아에서의 응용을위한 몇 가지 단점은 (무대 HH22보다 오래된 없습니다 - 약 3.5 개발 일). 예를 들어, 나중 단계에 vitelline 막이 우스입니다조 막에 붙어 있으며 껍질에 창을 열지 앨리 배아의 죽음에 그 결과 혈관의 파열을 초래, 이전 배아는 그것이 배아를 액세스하고 조작하기가 어렵습니다 vitelline 및 allantoic 혈관에 의해 적용되며, 이전 배아 움직이지 셸의 상대적으로 작은 창을 통해 방향을 제어하기 어려운 강력하고 있습니다.
이 프로토콜에서는 늦은 단계 (단계 HH22보다 오래된)에서 닭 배아에 유전자 전달을위한 전직 비켜 electroporation 방법을 보여줍니다. 전 비켜 electroporation의 경우 배아가 페트리 접시 9 배양해하고 vitelline 및 allantoic 혈관이 널리 퍼져있다. 이러한 조건에서 기존의 닭 배아 쉽게 액세스하고 조작합니다. 따라서이 방법은 기존의 닭 배아에 적용 비켜 electroporation에의 단점을 극복. 이 방법을 사용 plasmids 쉽게 여러 부분으로 transfected 수오래된 닭 배아 10-12니다.
Protocol
1. 예 비켜 문화
- 신선한 수정된 달걀이 부화 60 %의 습도와 37.5에서 강제 통풍 인큐베이터 (BSS160, Ehret, 독일) ° C에서 그들의 긴 측면에 놓여있다. 이상 1 주일 동안 12 ° C에서 저장된 계란을 사용하지 않아야합니다.
- 2.5 일 (무대 HH17에 대한)에 대한 인큐베이션 후, 계란을 제거하고 해독을위한 방향을 나타내는 연필로 상단에 라벨을 달고.
- 크래킹하기 전에 깨끗한 대형 배양 접시 (; Greiner 생물 하나 게엠베하, 독일 145mm의 직경)로 약 20 ML 멸균 증류수를 부어.
- 대형 배양 접시에, 또 다른 작은 멸균 페트리 접시를 (Greiner 바이오 - 하나 게엠베하 94mm의 직경) 놓습니다.
- 날카로운 금속 모서리에 대한 바닥에 알을 약쟁이, 조심스럽게 달걀을 열고 작은 배양 접시에 각 계란의 전체 내용을 전송합니다.
- 뚜껑과 함께 큰 페트리 접시를 커버하여 다른 인큐베이터 (바인더 게엠베하, Tuttlinge, 독일)에 넣어추가로 문화의 37.5에서 ° C에서 약 60 %의 습도. 일 원하는 번호 부화 후 배아가 electroporation을 위해 사용될 수 있습니다.
2. 전 비켜 Electroporation을위한 준비
- 1.0 밀리미터 직경 (TW100F-4, 세계 정밀 계측기)의 유리 튜브를 사용하는 microelectrode의 풀러 (세계 정밀 계측기, 베를린, 독일 PUL-100 Micropipette 풀러)와 유리 모세관을 당겨와 적절한로 유리 모세관의 끝부분을하다 지름.
- electroporation에 대한 적절한 매개 변수 (즉, 배아의 독특한 조직 및 크기에 대해 다른 전압) 설정 및 electroporator (CUY21 - 편집, Nepa 진, 치바, 일본)에 전극을 연결 배아의 대상 조직 및 크기에 따라.
- 그리고 마커 유전자; 대상 유전자를 인코딩 pCAGGS 벡터의 plasmids, 예를 들어, cadherin7 (2.0 μg / μl의 농도로 pCAGGS-Cad7 Cad7)를 포함하는 플라스미드 솔루션을 준비예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP, 0.25 μg / μl의 농도로 pCAGGS-GFP). 그렇다면 녹색 색상 플라스미드 솔루션을 라벨에 0.1 %의 최종 농도 (시그마)와 빠른 그린을 추가합니다.
- 입 피펫을 사용하여 플라스미드 솔루션 모세관 유리를로드합니다.
3. 전 비켜 Electroporation에 의한 치킨 광학 Tectum로 진 전송
- 전 비켜 문화 후 예는 인큐베이션 일 (E) 6으로, 닭 배아는 전 비켜 electroporation을 위해 사용됩니다.
- 조심스럽게 미세 집게로 광학 tectum 위에 vitelline 및 양막 세포막을 찢어하고 tectum의 표면에 멸균 0.9 %의 나트륨 염화물 용액 3 방울을 추가합니다.
- 입 피펫을 사용하여 모세관 유리하여 tectum의 캐비티에 플라스미드 솔루션을 주사.
- tectum 옆에 텅스텐 바늘 음극과 직사각형 플레이트 양극 (CUY 661-3X7, Nepa 유전자)와 전극을 배치하고,즉시 tectum에 electroporator에 의해 생산된 전기 펄스를 (6 펄스, 25 V, 60 MS 펄스 길이, 각각의 경우 100 MS 간격)이 적용됩니다.
- 뚜껑이있는 큰 페트리 접시를 덮어 인큐베이터로 반환합니다. 적절한 일 (예, 2 또는 삼일 electroporation 이후)을위한 인큐베이션 후, tectum는 immunostaining (그림 1)과 생물 학적 검출을 위해 수집하고 해결됩니다.
4. 대표 결과
전 비켜 electroporation에 의해 Cad7와 GFP의 외인성 단백질의 성공 overexpression은 예를 들어 그림 1에 표시됩니다. 플라스미드 GFP와 Cad7 플라스미드 함께이 E6에서 tectum에 electroporated되었을 때, 2-3 일 electroporation 후 배아를 모으고 수정되었습니다. E8에서 GFP 단백질은 강력 전체 마운트 이미지 (그림 1A-C)에 tectum에 표시됩니다. 또한, E9의 tectum의 섹션에서GFP 단백질 (그림 1D 녹색) 및 Cad7 단백질 (그림 1E에서 빨간색) 전 비켜 electroporation은 생체내에 오래된 닭 배아에 유전자 전달을위한 성공적인 방법이라고 제안하고, (그림 1 층에서 노란색) coexpressed 있습니다.
그림 1. plasmids 인코딩 GFP와 Cad7은 E6에서 치킨 tectum로 cotransfected되면 2-3 일 전 비켜 electroporation 후, GFP 단백질은 (녹색) 강하게 같은 E8에 wholemount 이미지 (AC)과 같이 표시됩니다. E9의 tectum의 섹션에서 GFP 단백질 (D 녹색) 및 Cad7 단백질 (E에서 적색) (F에서 노란색) coexpressed 있습니다. BF, 명시야 이미지입니다. 스케일 바 : AC 용 200 μm의, DF위한 D 100 μm의.
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Discussion
이 프로토콜은 전 비켜 electroporation에 의해 기존의 닭 배아 (예 : E6의 광학 tectum로)로 유전자 전달을위한 가이드를 제공합니다. 이 방법은 기존의 닭 배아에 electroporation의 사용을 확장하고 쉽게 나중 단계에서 생체내의 유전자 기능을 연구를 위해 많은 실험실에 적용할 수 있습니다. E4에서 최소한 E7에 태아도 성공적으로이 방법에 의해 electroporated 수 있으며 electroporated 배아는 E15 11까지 생존이 될 수 있습니다. 뇌 이외에도이 방법은 또한 닭 사지 시스템을 11로 유전자 전달에 사용될 수 있습니다.
특별한주의는 전 비켜 electroporation에 의해 지불되어야합니다. 작은 배양 접시가 E2.5 주위에서 연주 균열 살균 계란 있어야;. 예를 들어, 전직 비켜 문화 배아 높은 생존을 얻기 위해 사용되는 달걀은 신선하고 12 일주일도 저장 ° C이어야합니다 전 비켜 electroporation의 경우,크기 및 전극의 배치가 제대로 무대와 배아의 타겟 부분에 따라 선택되어야합니다. 이 plasmids이 cotransfected 때 주입 plasmids은 GFP 표시된 세포가 거의 타겟 유전자를 coexpress하고 있는지 확인하기 위해 농도의 적절한 비율 (예 : 마커 GFP 유전자와 타겟 유전자 사이 1시 8분)에 있어야합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 학술 진흥 재단 (; LU1455/1-1 DFG)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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