Summary
Une méthode de transfert de gènes dans des embryons de poulet à des stades d'incubation plus tard (plus de Hamburger et Hamilton étape (HH) 22) est décrite. Cette méthode permet de surmonter les inconvénients de
Abstract
L'embryon de poulet fournit un excellent modèle pour étudier la fonction des gènes et de la réglementation au cours du développement embryonnaire. En électroporation in ovo est une méthode puissante pour surexprimer des gènes exogènes ou vers le bas-réguler les gènes endogènes in vivo dans les embryons de poulet 1. Différentes structures telles que les plasmides ADN codant pour les gènes 2-4, petits ARN interférents (siARN) plasmides 5, petite ARN synthétique oligos 6, et morpholino oligonucléotides antisens 7 peut être facilement transfecté dans des embryons de poulet par électroporation. Toutefois, l'application d 'électroporation in ovo est limitée aux embryons à des stades d'incubation au début (plus jeune que le stade HH20 - selon Hambourg et Hamilton) et 8 il ya quelques inconvénients pour son application dans les embryons à des stades ultérieurs (plus que le stade HH22 - environ 3,5 jours de développement). Par exemple, la membrane vitelline à un stade ultérieur est généraleallié collé à la membrane doit et d'ouvrir une fenêtre dans la coquille provoque la rupture des vaisseaux, entraînant la mort des embryons; âgés embryons sont couverts par vaisseaux vitellins et allantoïdien, où il est difficile d'accès et de manipuler les embryons; âgés embryons déplacer vigoureusement et il est difficile de contrôler l'orientation à travers une fenêtre relativement faible dans la coquille.
Dans ce protocole, nous démontrons une méthode d'électroporation in ovo ex de transfert de gènes dans des embryons de poulet à des stades tardifs (plus que le stade HH22). Pour l'électroporation in ovo ex, les embryons sont cultivés dans des boîtes de Pétri de 9 et de la vitelline et les vaisseaux allantoïde sont largement répandues. Dans ces conditions, les embryons de poulet âgés sont facilement accessibles et manipulables. Par conséquent, cette méthode permet de surmonter les inconvénients de l'électroporation in ovo dans appliqués aux embryons de poulet âgés. En utilisant cette méthode, des plasmides peuvent être facilement transfecté dans les différentes partiesdes embryons de poulet âgés 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Culture
- Frais œufs fécondés sont pondus sur leur côté le plus long dans un tirage forcé incubateur (BSS160, Ehret, Allemagne) à 37,5 ° C avec une humidité de 60% pour l'incubation. Les œufs stockés à 12 ° C pendant plus d'une semaine ne devrait pas être utilisé.
- Après une incubation de 2,5 jours (environ stade HH17), sortez les œufs et étiqueter le dessus avec un crayon pour indiquer la direction de la fissuration.
- Avant la fissuration, verser environ 20 ml d'eau distillée stérile dans une boîte de Petri propre de grande taille (diamètre de 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Allemagne).
- Placez une autre petite boîte de Petri stérile (diamètre de 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) dans le grand plat de Petri.
- Casser les oeufs sur le fond contre un bord en métal tranchant, ouvrir avec précaution les oeufs et le transfert de la totalité du contenu de chaque œuf dans la petite boîte de Petri.
- Couvrir le plat de Petri grande avec un couvercle et le mettre dans un autre incubateur (BINDER GmbH, Tuttlinge, Allemagne)pour la culture en outre à 37,5 ° C avec environ 60% d'humidité. Après incubation pendant le nombre souhaité de jour, les embryons peut être utilisé pour l'électroporation.
2. Préparation pour l'électroporation in ovo ex
- Extraire le verre capillaires avec un extracteur de microélectrodes (PUL-100 Extracteur Micropipette; Instruments de précision du monde, Berlin, Allemagne) en utilisant des tubes de verre de 1,0 mm de diamètre (TW100F-4; Instruments de précision du monde) et de briser la pointe de l'capillaires de verre dans un montage approprié diamètre.
- Définissez les paramètres appropriés (c.-à-tensions différentes pour les tissus distincts et la taille des embryons) pour l'électroporation et raccordez à un électroporateur (CUY21-Edit; Nepa Gene, Chiba, Japon), selon les tissus cibles et la taille des embryons.
- Préparer une solution contenant le plasmide dans des plasmides vecteur pCAGGS codant un gène cible, par exemple cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 avec une concentration de 2,0 ug / pi) et un gène marqueur,par exemple, protéine fluorescente verte (GFP; pCAGGS-GFP avec une concentration de 0,25 mg / pi). Puis ajouter vert rapide avec une concentration finale de 0,1% (Sigma) pour étiqueter la solution avec le plasmide de la couleur verte.
- Chargez le capillaire de verre avec la solution de plasmide à l'aide d'une pipette bouche.
3. Transfert de gène dans Tectum poulet optique par électroporation in ovo ex
- Après la culture in ovo ex, par exemple, le jour d'incubation (E) 6, les embryons de poulet sont utilisés pour l'électroporation in ovo ex.
- Détachez avec soin les membranes vitellines et de l'amnios au cours de la tectum optique avec des pinces fines et ajoutez 3 gouttes de solution stérile de chlorure de sodium à 0,9% sur la surface du tectum.
- Injecter la solution de plasmide dans la cavité du capillaire en verre par tectum aide de la pipette bouche.
- Placer les électrodes avec une cathode aiguille de tungstène et une anode plaque rectangle (CUY 661-3x7, Nepa Gene) à côté de la tectum, etappliquer immédiatement des impulsions électriques (six impulsions, 25 V, 60 ms d'impulsion de longueur, 100 ms d'intervalle, dans chaque cas) produites par le électroporateur au tectum.
- Couvrir le plat de Petri grande avec le couvercle et le retourner dans l'incubateur. Après incubation pendant des jours appropriés (par exemple, 2 ou 3 jours après l'électroporation), le tectum sont prélevés et fixés pour immunomarquage (Figure 1) et détection biologique.
4. Les résultats représentatifs
Surexpression réussie des protéines exogènes de Cad7 et la GFP par électroporation in ovo ex est illustré à la figure 1 comme exemple. Lorsque Cad7 ensemble plasmide avec la GFP plasmide a été soumis à une électroporation dans le tectum à E6, deux ou trois jours après l'électroporation des embryons ont été collectés et fixés. A E8, la protéine GFP est fortement exprimé dans le tectum dans les images de montage entières (figure 1A-C). En outre, dans les sections de la tectum à E9,Protéine GFP (en vert dans la figure 1D) et Cad7 protéines (rouge dans la figure 1E) sont co-exprimés (en jaune dans la figure 1F), ce qui suggère que l'électroporation in ovo est ex une méthode efficace de transfert de gènes dans les embryons de poulet âgés in vivo.
Figure 1. Lorsque le codage plasmides GFP et Cad7 sont co-transfectés dans le tectum de poulet à E6, deux ou trois jours après l'électroporation in ovo ex, la protéine GFP (green) est fortement exprimé comme indiqué dans les images wholemount (AC) à E8. Dans les sections de l'tectum à E9, la protéine GFP (green en D) et Cad7 protéines (rouge dans E) sont co-exprimés (en jaune dans F). BF, l'image en champ clair. La barre d'échelle: 200 um en A pour AC; 100 um en D pour DF.
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Discussion
Ce protocole fournit un guide pour le transfert de gènes dans des embryons de poulet âgés (par exemple, dans le toit optique à E6) par électroporation in ovo ex. Cette méthode étend l'utilisation de l'électroporation à des embryons de poulet âgés et peut être facilement appliquée à de nombreux laboratoires pour étudier la fonction des gènes in vivo à des stades ultérieurs. Les embryons de E4 à au moins E7 peut être avec succès par électroporation par ce procédé et les embryons peuvent être électroporées survie jusqu'à E15 11. Outre le cerveau, cette méthode peut être également utilisé pour le transfert de gènes dans le système de poulet branche 11.
Une attention particulière devrait être accordée à par électroporation in ovo ex. Par exemple, afin d'obtenir de survie élevé des embryons par la culture in ovo ex, les oeufs utilisés doivent être frais et conservé au moins une semaine à 12 ° C; les petits plats de Pétri doivent être stériles et des œufs effectué à la fissuration autour de 2,5. Pour l'électroporation in ovo ex, lela taille et le placement des électrodes doit être correctement choisis en fonction de la scène et une partie ciblée des embryons. Lorsque deux plasmides sont co-transfectées, les plasmides injectés doivent être dans un rapport approprié de la concentration (par exemple, 1:8 entre le gène de la GFP marqueur et gène ciblé) afin d'être sûr que les cellules GFP marqués sont presque coexpress le gène ciblé.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la recherche allemande (DFG; LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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