Summary
Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların üstesinden
Abstract
Tavuk embriyo embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonu ve regülasyonu çalışmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Ovo elektroporasyon içinde güçlü bir aşırı-express ekzojen genlerin yöntemi veya tavuk embriyo 1 in vivo olarak endojen genlerin aşağı düzenlenmesi. DNA plazmid kodlama genleri 2-4, küçük müdahale RNA (siRNA) plazmidleri 5, küçük sentetik RNA oligos 6 ve morfolino antisens oligonükleotidler 7 gibi farklı yapılar kolaylıkla elektroporasyonla tavuk embriyosu transfekte edilebilir. Ancak, ovo elektroporasyon yılında uygulanması erken kuluçka evrelerinde (evre HH20 daha genç - Hamburg ve Hamilton göre) az embriyo ile sınırlıdır 8 ve sonraki aşamalarında embriyo yılında uygulama için bazı dezavantajları (evre HH22 büyük var - yaklaşık 3.5 kalkınma gün). Örneğin, daha sonraki aşamalarda vitellin membran usu olanshall membran yapışmış ve kabuk bir pencere açarak müttefiki embriyoların ölümle sonuçlanan, damarların yırtılması neden olur; eski embriyolar bu embriyolar erişmek ve işlemek için zordur vitellin ve allantoik damarları ile kaplıdır; eski embriyo hareket kabuk nispeten küçük bir pencereden yönü şiddetle kontrol etmek zordur ve olup.
Bu protokol; geç evrede (evre HH22 daha eski) az tavuk embriyosu gen transferi için bir ex ovo elektroporasyon yöntemi göstermektedir. Ex ovo elektroporasyon için, embriyolar Petri 9 kültüre ve vitellin ve allantoik damarları yaygın olarak yayılır. Bu koşullar altında, büyük tavuk embriyo kolayca erişilebilir ve manipüle edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem, daha eski tavuk embriyo uygulanan ovo elektroporasyon in bir sakıncaları ortadan kaldırmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, plazmidler kolayca farklı bölüme transfekte edilebilirbüyük tavuk embriyo 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Kültürü
- Taze döllenmiş yumurtalar kuluçka için% 60 nem oranı ile 37.5 bir zorunlu taslak inkübatör (BSS160, Ehret, Almanya) ° C uzun yüzüne serilir. Daha uzun bir hafta boyunca 12 ° C de muhafaza yumurtalar kullanılmamalıdır.
- 2.5 gün (evre HH17 hakkında) inkübasyondan sonra, yumurtalar dışarı almak ve kırmak için yönünü belirtmek için kalem ile üst etiketleyin.
- Çatlama önce, temiz bir büyük Petri (; Greiner Bio-One GmbH, Almanya 145 mm çapında) içine yaklaşık 20 ml steril distile su dökün.
- Büyük Petri kabına; başka küçük steril Petri (Greiner Bio-One GmbH 94 mm çap) yerleştirin.
- Keskin bir metal kenarına altındaki yumurtaları kırın, dikkatli yumurta açın ve küçük Petri kabına her yumurta tüm içerik aktarmak.
- Kapaklı büyük Petri Kapak ve başka bir inkübatör (BINDER GmbH, Tuttlinge, Almanya) koydudaha da kültürü için 37.5 ° C'de yaklaşık% 60 nem. Gün arasında arzu edilen sayıda inkübasyondan sonra, embriyo elektroporasyon için de kullanılabilir.
2. Ex ovo Elektroporasyon Hazırlık
- 1.0-mm çapında (TW100F-4; Dünya Hassas Aletler) cam tüpler kullanılarak; bir mikroelektrot çektirmenin (Dünya Hassas Aletler, Berlin, Almanya PUL-100 Mikropipet Çektirme) ile cam kılcal çekin ve uygun bir cam içine kılcal damarların ucu kırmak çapı.
- Elektroporasyon için uygun parametreler (yani embriyoların farklı dokuları ve boyut için farklı voltajlar) kurulmuş ve elektroporatörün (CUY21-Düzen; Nepa Gen, Chiba, Japonya) elektrotlar bağlanmak embriyoların hedef doku ve büyüklüğüne göre.
- Ve bir işaretleyici gen, bir hedef genin kodlayan pCAGGS vektör içinde plazmidler, örneğin, cadherin7 (2.0 ug / ml bir konsantrasyona sahip pCAGGS-Cad7 Cad7) içeren bir plasmid çözeltisi hazırlayınörneğin, yeşil floresan protein (GFP; 0.25 mcg / ml 'lik bir konsantrasyon ile pCAGGS-GFP). Sonra yeşil renk ile plazmit çözeltisi etiketlemek için% 0.1 'lik bir son konsantrasyon (Sigma) ile hızlı Green ekleyebilir.
- Bir ağız pipet kullanılarak plazmid çözeltisi ile kılcal cam yerleştirin.
3. Ex ovo Elektroporasyon Chicken Optik Tectum içine Gen Transferi
- Ex ovo kültürden sonra, örneğin, günde inkübasyon (E) 6 tarafından, tavuk embriyo ex ovo elektroporasyon için kullanılmaktadır.
- Dikkatli bir şekilde ince forseps optik tectum üzerinde vitelline ve amniyon membran yırtılma ve tectum yüzeyinde steril% 0.9 sodyum klorür çözeltisi 3 damla ilave edin.
- Ağız pipet kullanılarak kapiler cam tarafından tectum boşluğu içine plazmid çözeltisi enjekte edilir.
- Tectum yanında bir tungsten iğne katot ve bir dikdörtgen plaka anot (CUY 661-3x7, Nepa Gen) ile elektrotlar yerleştirin vehemen tectum için elektroporatörün tarafından üretilen elektrik dalgaları (altı bakliyat, 25 V, 60 ms darbe uzunluğu, her durumda 100 ms aralıklarla) uygulanır.
- Kapaklı büyük Petri kabı kaplayın ve inkübatör içine döner. Uygun gün (ör., 2 ya da 3 gün sonra, elektroporasyon) inkübasyondan sonra, tectum immüno-(Şekil 1) ve biyolojik tespiti için toplanır ve tespit edilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Ex ovo elektroporasyon ile Cad7 ve GFP bir eksojen proteinleri başarılı bir şekilde aşırı ekspresyonu bir örnek olarak Şekil 1 'de gösterilmiştir. Plazmid GFP Cad7 plazmid birlikte E6 az tectum içine electroporated zaman, iki veya üç gün elektroporasyon sonra embriyolar toplanmış ve düzeltildi. E8 de, GFP proteini kuvvetli bütün resimler montaj (Şekil 1A-C) içinde tectum cinsinden ifade edilir. Ayrıca, E9 de tectum ilgili bölümlerin,GFP protein (Şekil 1D yeşil) ve Cad7 protein (Şekil 1E kırmızı) ex ovo elektroporasyon in vivo büyük tavuk embriyo gen transferi için başarılı bir yöntem olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1F sarı) coexpressed vardır.
Şekil 1. Yi kodlayan plasmidin GFP ve Cad7 E6 azından tavuk tectum içine cotransfected zaman, iki ya da üç gün ex ovo elektroporasyon sonra GFP protein (yeşil) kuvvetli olarak E8 azından wholemount görüntü (AC) 'de gösterildiği ifade edilir. E9 azından tectum bölümleri içinde, GFP protein (D yeşil) ve Cad7 protein (E kırmızı) (F sarı) coexpressed vardır. BF, parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu: AC için A 200 mikron; DF D 100 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol ex ovo elektroporasyonla büyük tavuk embriyo (örneğin, E6 de optik tectum içine) gen transferi için bir kılavuz sağlar. Bu yöntem, büyük tavuk embriyo elektroporasyonla kullanılması uzanır ve kolay bir sonraki aşamada, in vivo gen fonksiyonu olarak incelemek için çok laboratuar uygulanabilir. E4 en az E7 için başarılı bir şekilde Embriyolar bu yöntem tarafından electroporated edilebilir ve electroporated embriyosu E15 11 kadar sağkalım olabilir. Beynin yanı sıra, bu yöntem ayrıca tavuk uzuv sistemi 11 içinde gen aktarımı için kullanılabilir.
Özel dikkat ex ovo elektroporasyon tarafından ödenmesi gerekmektedir. Küçük bir Petri kutularına E2.5 etrafında gerçekleştirilir çatlatma steril ve yumurta olmalıdır;. Örneğin, ex ovo kültürü ile embriyo yüksek hayatta kalma elde etmek için, kullanılan yumurta taze ve 12 de daha az bir hafta depolanmış ° C olmalıdır Ex ovo elektroporasyon için,boyutu ve elektrot yerleştirme doğru sahne ve embriyoların hedeflenen parçaya göre seçilmelidir. Iki plazmit cotransfected zaman, enjekte edilen plasmidler GFP işaretlenmiş hücreleri hemen hedef geni birlikte açığa vurabilir emin olmak için, uygun bir konsantrasyon oranı (örneğin, işaretleyici genin GFP ve hedeflenen geni arasındaki 1:08) olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (; LU1455/1-1 DFG) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
