I. Préparation des réactifs Sélection d'anticorps et de préparation Identifier les anticorps à être utilisés dans l'expérience. Quatre anticorps de capture: spécifique pour le TNF alpha humain, monoclonaux ou polyclonaux; toutes les espèces même hôte. Quatre anticorps de détection: spécifique pour le TNF alpha humain, soit non modifié, biotinylé, ou PE-conjugué. Un anticorps de confirmation: PE-conjugué et spécifique pour les espèces hôtes des anticorps de capture. Reconstituer tous les anticorps à des concentrations de travail recommandées par le fabricant. Sélectionnez quatre flacons de faible concentration MagPlex microsphère (talon) des ensembles ou des régions, par exemple, les numéros de pièce Luminex MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, et MC10015-ID. Couplage d'anticorps à MagPlex microsphères, en utilisant l'anticorps xMAP (ABC) Kit d'accouplement Réfer au manuel de l'utilisateur abc Kit (N ° de pièce 89-00002-00-319) pour la procédure de couplage complet. (Remarque: photosensible microsphères doivent être protégés de la lumière chaque fois que possible.) Amener les réactifs dans le kit ABC à la température ambiante et les tubes de réaction d'étiquettes avec les quatre numéros de région de talon sélectionnés pour la réaction de couplage. Transférer le contenu des quatre flacons de perles MagPlex (1 ml chacun, soit 2,5 x 10 6 perles) dans les tubes de réaction quatre étiquetés. Laver chacun des ensembles de billes à deux reprises dans 500 ul de tampon d'activation, tel que décrit dans le manuel de kit ABC. Activez chaque ensemble de billes avec 480 ul de tampon d'activation, 10 pi de sulfo-NHS, et 10 ul du réactif EDC, conformément à la procédure dans le manuel de kit ABC, et incuber pendant 20 minutes. (Remarque:. Réactif EDC doit être reconstitué dans 250 pi de tampon d'activation immédiatement avant cette étape) Répétez l'étape de lavage précédente avec le désormais "activé" microsphères un total de thrEE Times avec 500 pi de tampon d'activation, tel que décrit dans le manuel de kit ABC. Préparer quatre solutions distinctes, chacune contenant 7,5 ug (soit 3 mg / millions microsphères) des anticorps de capture dans un tampon d'activation. Ajouter ces solutions quatre anticorps de capture à leurs tubes de réaction respectifs, chaque tube vortex immédiatement, et incuber pendant deux heures sur un rotateur. Répétez l'étape de lavage précédente avec le désormais "couplé" microsphères un total de trois fois avec 500 ul du tampon de lavage inclus avec le kit ABC. Après l'étape finale de lavage, ajouter 500 pl du tampon de lavage à chaque tube de réaction pour fournir une concentration finale du stock de 5 millions anticorps couplés billes par millilitre. Vortex et sonication les tubes de réaction pour disperser les microsphères. REMARQUE: Partiellement submergeant le flacon microsphère fermé dans un nettoyeur à ultrasons rempli d'eau DI fournit sonication efficace pour toutes les étapes de lavage. (Voir le tableau des matériaux pour l'eplus de détails.) QUIPEMENTS Stocker les billes couplées à 2-8 ° C et protégé de la lumière jusqu'à ce que nécessaire. Dénombrement des microsphères couplées Comptez le nombre de microsphères récupéré après la réaction de couplage en utilisant un compteur de cellules ou hématimètre. Reportez-vous au manuel d'utilisation de l'instrument de comptage pour des instructions appropriées pour le faire. La reprise de la réaction de couplage est généralement plus de 90%. Confirmation du couplage Confirmer la réaction de couplage a réussi en préparant des solutions de test des stocks de billes couplées pour chaque ensemble, avec la concentration finale de 100 perles / ul dans du tampon de dosage (PBS avec 1% de BSA). Préparer des dilutions de la phycoérythrine-(PE-) étiquetés anticorps anti-espèce de confirmation IgG à 4 pg / ml dans le tampon essai. Aliquote de 50 pl de chaque solution d'essai dans quatre puits d'une à fond rond, plaque de 96 puits, pour un total de 16 puits. Puis ajouter 50 μL de tampon de dosage dans huit des puits, afin de mesurer de fond, et 50 ul d'anticorps de confirmation dilué dans les huit puits restants. Mélanger les réactions doucement par pipetage de haut en bas plusieurs fois avec une pipette multi-canaux. Couvrir la plaque et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque. Placer la plaque sur une plaque magnétique séparateur pendant 1-2 minutes à tirer les billes de la solution. Ensuite, enlever le liquide par force inversant la plaque, tandis que sur le séparateur, au cours d'une poubelle. Laver chaque puits deux fois par addition de 100 ul de tampon de dosage et élimination du surnageant de la plaque d'une manière similaire en utilisant le séparateur plaque magnétique. Remettre en suspension les billes dans 100 ul de tampon de dosage par un léger pipetage haut et en bas à cinq reprises avec une pipette multi-canaux. Analyser sur un instrument Luminex xMAP, tels que l'instrument MAGPIX. L'intensité du signal fluorescent de cette réaction est directly proportionnelle à la quantité de protéine sur la surface des perles, qui fournit une évaluation rapide de la quantité relative de protéine couplée à des billes. Couplage biotine aux anticorps non modifiés pour la détection Si en utilisant des anticorps de détection non modifiées, biotinyler ces anticorps avec le Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine Réactif (Cat. n o PI-21335) et la procédure décrite dans la notice. Une fois biotinylé, les anticorps de détection peut être ensuite marqué avec de la streptavidine phycoérythrine (PE-SA) dans le dosage (III.6 étape.) De sorte qu'ils peuvent être détectés avec l'analyseur xMAP. II. Configuration de dosage Préparer un mélange initial de tous les quatre ensembles de billes en ajoutant 10 pl de chaque à 0,96 ml de PBS avec 1% de BSA (tampon de dosage. Voir le tableau des matériaux) afin de déterminer qui est le plus efficace avec le test xMAP. Préparer les solutions d'anticorps de détection par dilbuer à chacun de 1 ug / ml dans le tampon essai. Préparer la norme R & D Systems protéine TNF-α à 2000 pg / mL dans le tampon essai. Diluer la streptavidine-rPhycoerythrin (SA-PE) (à condition @ 1 mg / ml) à 8 pg / ml dans le tampon essai. III. Dépistage des anticorps Ajouter 50 pL du mélange de microsphères d'anticorps couplé à chacun des 16 puits d'une Costar à fond rond plaque à 96 puits pour le test de criblage. Ajouter 50 ul de tampon de dosage à 8 des 16 puits, afin de mesurer arrière-plan. Ajouter 50 ul de la R & D Systems TNF-α standard (@ 2000 pg / mL) pour les 8 autres puits, pour mesurer la réponse. Incuber pendant une heure à température ambiante, protégé de la lumière, tout en agitant sur une plaque de dosage agitateur. Ajouter 50 ul de chacune des quatre anticorps de détection de quatre puits (deux arrière-plan et deux de réponse) et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, tout en agitant sur une plaque d'essai shaker. Ajouter 50 ul du réactif SA-PE à tous les puits et incuber 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, tout en agitant sur une plaque de test shaker. Placer la plaque sur un séparateur plaque magnétique pendant une minute puis retirez du liquide par force inversant la plaque. Ajouter 100 ul du tampon de dosage pour chacun des 16 puits, placer la plaque sur le séparateur plaque magnétique pendant une minute puis retirez du liquide par force tout en inversant la plaque sur le séparateur. Ajouter 100 ul de tampon de dosage pour chacun des 16 puits et lire la plaque avec l'instrument Luminex MAGPIX; se référant au manuel de l'utilisateur pour un fonctionnement correct. Sélectionnez une paire d'anticorps qui répond à vos force du signal désiré. IV. xMAP test fonctionnel Après avoir sélectionné l'anticorps de capture mieux, diluer 100 ul de ce stock d'anticorps couplé à billes (à partir de l'étape IB8) à 10 ml avec le tampon. Ajouter 50 uL deles perles dilué à 78 puits de deux Costar à fond rond plaques à 96 puits. (78 puits x 2 plaques = 156 puits) Chaque plaque sera utilisée pour évaluer la performance d'un anticorps de détection différent. Préparer une courbe de 12 points standard, en commençant à 8000 pg / mL et se terminant à 4 pg / mL, avec la R & D Systems TNF-α standard. Ajouter 50 ul six réplicats de chaque dilution de chacune des plaques, ainsi que six puits avec 50 ul de tampon de dosage de chaque, comme un arrière-plan, pour un total de 78 puits par plaque. Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante, protégé de la lumière, tout en agitant sur une plaque de dosage agitateur. Ajouter 50 ul de l'anticorps de détection premier à tous les 78 puits de la première plaque. Répéter pour l'anticorps de détection seconde sur la seconde plaque. Incuber les plaques pendant 30 minutes, à température ambiante, protégé de la lumière tout en agitant sur une plaque de dosage agitateur. Ajouter le pL 50 du réactif SA-PE dans tous les puits de chaque plaque. Incuberles deux plaques pour 15 minutes, à température ambiante à l'abri de la lumière tout en agitant sur une plaque de test shaker. Placer les plaques sur les séparateurs à plaques magnétiques pour une minute, puis retirer du liquide par force tout en inversant la plaque sur le séparateur. Ajouter 100 ul de tampon de dosage pour chacun des 78 puits sur les plaques; placer les plaques sur des séparateurs de plaques magnétiques pour une minute, puis retirer du liquide par force inversant la plaque. Ajouter 100 ul de tampon de dosage pour chacun des 78 puits sur des plaques et d'analyser sur l'instrument MAGPIX, se référant au manuel de l'utilisateur pour un fonctionnement correct. V. ELISA En suivant les instructions fournies avec le R & D Systems humaines TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA (R & D N ° de pièce DY210), mesurer la réponse générée par le standard fourni avec le kit R & D. Répétez le test ELISA trois fois de plus, en remplaçant la capture de R & D Systems et la détection de fourmiibodies avec les anticorps des autres fournisseurs. Par souci de simplicité, la paire des anticorps par le vendeur (par exemple, anticorps de capture Millipore avec un anticorps de détection Millipore, anticorps de capture Abcam avec un anticorps de détection Abcam, etc.) Évaluer chaque paire indépendamment, tel que requis par le format ELISA, avec chacune des trois étalons de protéine TNF-alpha. VI. Les résultats représentatifs Ce protocole montre comment une caractéristique ELISA peut être converti en la plate-forme tout en utilisant xMAP la capacité de multiplexage de la technologie d'optimiser le dosage rapide. Le test ELISA utilisé dans cet exemple a été le Tumor Necrosis Factor-humain alpha (TNF-α) DuoSet trousse ELISA de la R & D Systems (R & D N ° de pièce DY210). En plus de la paire d'anticorps fournis dans le kit, trois paires d'anticorps d'autres provenant de différentes sources (voir le tableau des matériaux) ont été évalués en utilisant simultanément la plate-forme xMAP. Four des anticorps ont été désignés comme anticorps de capture et ont été couplés à MagPlex faible concentration microsphères. Les quatre autres anticorps ont été désignés comme anticorps de détection, dont trois qui ont été achetés que la biotine couplé et le quatrième a été biotinylé comme décrit dans le Protocole. Les anticorps de cette étude ont été choisis en fonction de la disponibilité et le vendeur. Toutefois, en milieu de pratique, les anticorps doivent être choisis en fonction des préférences de l'utilisateur individuel et l'expérience de performance passé avec cet anticorps. Bien que, cette expérience ne teste pas l'aptitude d'un anticorps comme anticorps de capture par rapport anticorps de détection, ce protocole peut être facilement modifiée à cet effet. Les dosages Luminex xMAP sont réalisées comme un multiplex d'évaluer l'ensemble d'anticorps de capture quatre sous forme de mélange, en combinant les quatre ensembles de TNF-α anticorps couplé microsphères MagPlex. Les anticorps de capture ont été évalués avec chacun des quatreAnticorps de détection biotinylés individuellement, de telle sorte que l'interaction d'un anticorps de détection avec chacun des quatre anticorps de capture peut être déterminée simultanément. Quatre de tels essais, effectués en parallèle, a déterminé les interactions de tous les quatre anticorps de détection avec les quatre anticorps de capture. La figure 1 montre les données comparatives de ces tests de dépistage. Les résultats ont indiqué que la paire d'anticorps à partir du DuoSet R & D Systems mieux réalisée avec une réponse résultant à 6183 intensité de fluorescence moyenne (MFI) unités. Il a également été observé que les anticorps de détection de Millipore (86% de la réponse de R & D d'anticorps paire) et Abcam (67%) ont fourni une réponse raisonnable dans le dosage xMAP, lorsqu'il est combiné avec l'anticorps de R & D des systèmes de capture. Les anticorps de capture de Abcam, Millipore et Novus produit une réponse moins souhaitable dans le dosage xMAP. Il est important de noter, que le purpose de cette étude n'est pas nécessairement de mettre en évidence les différences entre les anticorps particuliers ou des vendeurs, mais simplement pour illustrer qu'il existe des différences observables dans leurs performances lorsqu'ils sont utilisés dans des conditions similaires, et que la plate-forme xMAP peuvent offrir un moyen efficace d'évaluation de ces différences. La R & D Systems DuoSet protocole a été utilisé pour comparer les quatre paires d'anticorps dans un format ELISA. La R & D Systems protocole a été utilisé avec toutes les paires d'anticorps, car il est le reflet de protocoles ELISA typiques largement utilisés aujourd'hui, et il est analogue à protocoles utilisés avec la technologie xMAP. Les tests ELISA ont montré que la paire d'anticorps à partir de R & D Systems a de nouveau donné les meilleurs résultats (Figure 2). La paire d'anticorps à partir Abcam produit pas de réponse et les paires d'anticorps à partir de Millipore et Novus produits réponses modestes. Afin d'évaluer toute variation de la réactivité des anticorps avec la norme, tous les quatre antibodpaires y ont été testés avec trois différents recombinants normes de protéines de TNF-alpha, à partir de trois fournisseurs différents (voir le tableau des matériaux). Les données de la figure 2 montrent que les normes de protéines recombinantes de TNF-alpha à partir des trois fournisseurs ont donné des résultats équivalents. La protéine TNF-α de R & D Systems a été utilisé pour générer des courbes standard avec la technique ELISA (tableau 1) et les dosages xMAP (tableaux 2 et 3). Alors que le test ELISA a été fait avec la paire de R & D Systems anticorps, les dosages xMAP utilisé l'anticorps R & D Systems et de capture soit l'anticorps de détection de la R & D Systems ou Millipore. La protéine TNF-α de R & D Systems a été dilué pour produire une gamme de concentrations allant de 8000 à 4 pg / mL. Seule la paire d'anticorps à partir de R & D Systems produit le résultat escompté dans le dosage xMAP, avec une réponse> 20.000 IMF, comme le montre le tableau 2 etFigure 3. Lorsque l'anticorps de détection de Millipore a été utilisé avec le test xMAP à la place de l'anticorps de R & D des systèmes de détection (tableau 3), la réponse (6.000 IMF) était d'environ 30% de la réponse obtenue avec l'anticorps de détection de la R & D Systems; comme indiqué dans Figure 3. Les données du tableau 1 représente la courbe standard du test ELISA, qui avait recommandé un fabricant de TNF-α fourchette de 16 à 1000 pg / mL. Cette gamme a été très limitée en raison de la DO à 1000 pg / mL a été légèrement supérieure à 2 unités de DO et le spectrophotomètre est incapable de mesurer plus de 3 OD. En raison de la limite avec le spectrophotomètre, il n'était pas possible d'augmenter la portée du test ELISA plus loin. En outre, les données du tableau 1 indiquent que la R & D Systems DuoSet ELISA n'est pas capable de détecter le TNF-α à des concentrations beaucoup moins de 16 pg / mL. D'autre part, le dosage est capable de xMAP de mesureING TNF-α à une concentration de moins de 7,8 pg / mL avec l'anticorps de capture de R & D Systems combinés avec l'anticorps de détection à partir soit R & D Systems ou Millipore. La gamme dynamique et la sensibilité des deux méthodes est mieux illustré lors du traçage dans une échelle logarithmique (figure 4). Une distinction claire entre la pente des réponses ELISA et les réponses des dosages xMAP peuvent être vu qui indique en outre une plus grande capacité de limiter pour la détection de TNF-α avec le test ELISA, à deux concentrations supérieures et inférieures. Les limites de détection (LOD) pour les deux dosages fonctionnels xMAP de TNF-alpha ont été approchée par l'identification la plus faible de TNF-α la concentration avec un niveau de réponse observé (IMF) supérieure à fond, en plus de trois fois son écart-type (SD). Pour atteindre une signification statistique, six répétitions ont été utilisés pour déterminer la SD pour les méthodes à la fois le xMAP et ELISA. Thestimations de e LOD sont optimistes et destiné à fournir un «meilleur des cas" scénario, étant entendu que dans des conditions normales de fonctionnement, seuls deux ou trois répétitions sera utilisée. Dans le tableau 2, il peut être observé que, lors de l'utilisation de la paire de R & D Systems, le plus bas du TNF-α concentration à 3,91 pg / ml produit une réponse de 66 IMF, qui est supérieure à la réponse de l'arrière-plan + 3SD, respect de ces critères . Lorsque l'anticorps de détection Millipore a été utilisé avec l'anticorps de R & D des systèmes de capture (tableau 3), la limite de détection était de moins de 7,81 pg / mL. Dans ce cas, le plus bas de TNF-α deuxième concentration produit une réponse acceptable de 17 IMF; plus de la réponse de la plus faible de TNF-α concentration plus trois fois son écart-type. (10 IMF + 3 (2,4) = 16,29 IMF) De même, la limite de détection pour l'ELISA R & D Systems DuoSet a été estimée à entre 63 pg / ml et 31 pg / mL (Tableau 1). <p class = "jove_content"> Figure 1. L'intensité médiane de fluorescence (MFI) de la norme R & D Systems (@ 2000 pg / mL) pour chaque combinaison possible des anticorps de capture quatre (couplé à quatre régions de microsphères différents) et les anticorps de détection quatre. Cliquez ici pour agrandir comprendre . Figure 2. La densité optique (DO) de trois différentes normes recombinantes (@ 1000 pg / ml) pour quatre combinaisons de capture et de détection des anticorps paire. Capture et anticorps de détection ont été arbitrairement jumelé par le vendeur, par souci de simplicité. Cliquez ici pour agrandir la figure . <tdcolspan = "4"> R & D Systems DuoSet pg / mL OD Ecart 3 SD 1000 2,084 0,035 2,187 500 1,328 0,038 1,441 250 0,787 0,025 0,863 125 0,476 0,026 0,554 63 0,304 0,023 0,374 31,3 0,212 0,025 0,287 15,6 0,167 <td> 0,026 0,244 0 0,118 0,021 0,182 Tableau 1 La densité optique (DO) de la série de dilution de 2 fois spécifié par l'insert de R & D Systems paquet DuoSet, pour une utilisation comme une courbe standard;., Y compris l'écart-type (SD) et la limite estimée de détection (LOD), entre 31,3 pg / mL et 63 pg / mL. R & D des systèmes de capture et de détection Anticorps pg / mL IMF Ecart 3 SD 8000 20320 463 </td> 21707 4000 15594 223 16263 2000 11098 79 11336 1000 6985 160 7465 500 4149 80 4390 250 2233 30,0 2323 125 1199 43,8 1330 63 636 14,0 678 31,3 340 12,9 379 <strong> 15.6 183 5.9 201 7.8 103 2.2 109 3.9 66 2.4 73 0 11 0.8 13,8 Tableau 2 L'intensité médiane de fluorescence (MFI) d'une série standard de dilution mesuré par la technologie xMAP, en utilisant la paire d'anticorps inclus avec le DuoSet R & D Systems;., Y compris l'écart-type (SD) et la limite estimée de détection (LOD), moins de 3,91 pg / mL. R & D des systèmes de capture Ab avec Millipore détection Ab pg / mL IMF <strong> Std Dev 3 SD 8000 5800 143 6229 4000 3881 120 4242 2000 2176 73 2396 1000 1138 32,1 1234 500 578 31,3 671 250 289 6.2 307 125 142 3.1 151 63 75 5.3 91 31,3 44 3.3 54 15,6 28 2.6 35,5 7.8 17 1.5 21,2 3.9 10 2.0 16,3 0 7 1.4 11,4 Tableau 3 L'intensité médiane de fluorescence (MFI) d'une série standard de dilution mesuré par la technologie xMAP, en utilisant l'anticorps R & D des systèmes de capture et l'anticorps EMD de détection Millipore;., Y compris l'écart-type (SD) et la limite estimée de détection (LOD), moins que 7,81 pg / mL. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> Figure 3. Les courbes standards des deux dosages xMAP et la R & D Systems DuoSet ELISA. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 4. Une comparaison des courbes xMAP standard et la courbe étalon ELISA dans une échelle log-log. Cliquez ici pour agrandir la figure .