Summary
Abbiamo sviluppato un sistema di tassi di video-microscopio di monitoraggio in grado di registrare e quantificare
Abstract
Abbiamo sviluppato tecniche di analisi della strumentazione, elaborazione delle immagini, e dati per quantificare il comportamento motorio di C. elegans come striscia sulla superficie di una piastra di agar. Per lo studio della genetica, basi biochimiche, e neuronali del comportamento, C. elegans è un organismo ideale perché è geneticamente trattabile, suscettibili di microscopia, e mostra un certo numero di comportamenti complessi, compresi i taxi, di apprendimento, e 1,2 interazione sociale. Analisi comportamentale basata sul monitoraggio dei movimenti di vermi che strisciano sulle piastre di agar sono stati particolarmente utili nello studio del comportamento sensoriale 3, locomozione 4, e la fenotipizzazione generale mutazionale 5. Il nostro sistema funziona spostando il sistema di telecamere e illuminazione come i vermi striscia su una piastra di agar stazionaria, che garantisce l'assenza di stimolo meccanico viene trasmessa alla vite senza fine. Sistema di tracciamento è facile da usare e comprende un semi-automatico funzione di calibrazione. Un challenge di video di tutti i sistemi di inseguimento è che genera una quantità enorme di dati che è intrinsecamente dimensionale. Nostra elaborazione delle immagini e programmi di analisi dei dati affrontare questo problema riducendo la forma vermi in un insieme di componenti indipendenti, che globalmente ricostruire il comportamento vermi come funzione di solo dimensioni 3-4 6,7. Come esempio del processo si dimostra che il verme entra ed esce allo stato inversione in maniera specifica fase.
Protocol
1. Descrizione del Microscopio monitoraggio
- Una piastra di agar è illuminato da una sorgente di luce in fibre e ripreso con una telecamera. Questo sistema è montato un, traduzione Y X stadio.
- Lo stadio è mosso da motori passo-passo standard, che sono collegati ad un controllore motore passo-passo.
- Il controllore e fotocamera sono collegati al computer e controllati da programmi personalizzati scritti in LabVIEW.
- La telecamera le immagini della superficie di una piastra di agar e identifica gli oggetti scuri su sfondo chiaro.
- La qualità dell'immagine viene regolata in modo che il programma di computer può quantificare oggetti in tempo reale. Il guadagno, la luminosità e la velocità dell'otturatore della fotocamera può essere regolato per fornire un oggetto scuro su uno sfondo bianco.
- Un segno di calibrazione per la calibrazione automatica è fatta colpendo la superficie dell'agar con un pick verme.
- Il filtrato, immagine binaria che viene utilizzato dal programma di monitoraggio può essere controllato.
- Il modoftware dispone di una funzione di auto-calibrazione che calcola la matrice di calibrazione con lo spostamento di un oggetto di prova una distanza fissa.
- Distanze in pixel è calibrato per azioni intraprese dal motore passo-passo per la matrice di calibrazione.
- Dopo la calibrazione, il sistema è pronto per andare e non necessita di essere ricalibrata meno che l'ingrandimento viene modificato oppure se la telecamera viene riposizionata.
2. Preparazione di piatti di monitoraggio e C. elegans per il monitoraggio
- Un anello di rame è usato per all'angolo i vermi e mantenere la loro migrazione verso il bordo della lastra. Il rame fornisce una barriera chimica locale e non influenza il movimento del verme altrimenti per la durata dell'esperimento (<1 ora). Riscaldare il primo anello appoggiandolo su un blocco di calore o equivalente.
- Anello posto su una piastra di agar fresco (1,7% Agar Bacto, 0,25% Bacto-peptone, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampone fosfato di potassio, 5 pg / mlcolesterolo) e premere leggermente verso il basso per incorporare nella superficie dell'agar.
- Molto L4 stadio o vermi adulti giovani su una piastra di agar riempito con qualche tampone NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampone fosfato di potassio) per lavarli di residui di cibo. Lasciate che i vermi nuotare per qualche minuto.
- Posizionare con cura un verme solo sulla piastra di inseguimento nei pressi del centro del ring. E poi la piastra sul tracker worm.
3. Worm monitoraggio
- Eseguire il programma LabVIEW e selezionare le opzioni, se necessario (percorso per immagini, tipi di immagini, misure, impostazioni della fotocamera).
- Utilizzando il joystick spostare il microscopio fino un'immagine del verme è nel campo di visualizzazione (monitor). Premere "traccia" per attivare il programma di monitoraggio.
- Il programma di computer misura effettivamente i movimenti di un immagini binarie filtrati come illustrato e possono effettuare misurazioni su questa immagine in tempo reale
- A poppaer inseguimento una ricostruzione della traiettoria globale può essere fatto dai movimenti del motore passo-passo, mentre le variazioni di forma locali della vite senza fine può essere visto in dettaglio.
4. Analisi dei dati
- Esegui script skeletonizing (MATLAB) per parametrizzare le forme del worm. (Figura 2)
- Calcolare modi di vibrare dei dati scheletrato. (Figure 3,4)
- Mostra Figura 5. Leggi leggenda figura o risultati rappresentativi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esempio: Quando foraggiamento, C. transizioni elegans da avanti a indietro movimento, spesso l'esecuzione di un nuovo orientamento (omega giro) prima di tornare allo stato di avanzamento. Quantificare questo passaggio è importante per la comprensione dei modelli di foraggiamento di movimento e anche nel controllo motorio del worm. Il potere di rivelare i dettagli sottili di comportamento locomozione può essere visualizzato utilizzando il nostro dispositivo tracker.
A titolo di esempio si guarda in avanti e indietro per invertire di trasmettere la transizione da catturare immagini ad alta risoluzione di vermi che strisciano liberamente sulla piastra di agar per ~ 30 min. viene eseguito. L'analisi eigenmode (Figura 3) consente di misurare la fase dei movimenti ondulatori del verme. La misura di fase, a sua volta permette di calcolare la velocità della vite senza fine e la transizione alla retromarcia (Figura 4). Tracciando la probabilità congiunta di velocità della vite senza fine e la fase, possiamo vedere che la transition tra avanti e indietro accadere probabilisticamente con una fase preferenziale (figura 5a). Se separiamo avanti a indietro e indietro di trasmettere le transizioni e guardare la probabilità condizionata della fase del worm quando entra ed esce un evento di inversione, si vede che hanno distribuzioni di fase distinti (figura 5b, c).
Figura 1. Carrellata microscopio. Il campione di un verme strisciare su una piastra di agar rimane fermo mentre il sistema di imaging si sposta per mantenere il verme nel centro di vista. Il sistema di imaging è costruito su una piattaforma di traslazione 2D comandati da motori passo-passo (3). Una telecamera CCD (Basler A601f) e la lente (25mm lunghezza focale) le immagini del worm dal basso (1) e una luce in fibra ottica (Edmunds, modello) lo illumina dall'alto (2). Un motore passo-passo fatto in casa utilizzando un semplice comandoep controller board (SimpleStep; SSXYZ) controlla il movimento del sistema di imaging. Un programma personalizzato LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, USA) acquisisce ed elabora le immagini dei vermi, e contemporaneamente la comunicazione con il controller del motore per mantenere la vite senza fine al centro del campo.
Figura 2. Elaborazione di immagini. (A) Worms spostare cambiando la loro curvatura nel tempo e quindi abbiamo elaborato le immagini a vite senza fine con la parametrizzazione loro linea centrale. Le immagini sono state fatte binario thesholding l'immagine raw scala di grigi (b), e vermi individuali sono state identificate da filtraggio degli oggetti in base alle dimensioni (c). La distanza fra il centro di massa del verme e il centro dell'immagine è stata calcolata e quindi la fase è stato spostato le opportune distanze per ricentrare il worm. Queste distanze di correzione sono stati usati per calcolare la traiettoria della vite senza fine. La curvatura del perimetro verme è stato utilizzato per identificare la coda (curvatura massima) e la testa (massimo secondario). (D) Le immagini sono state poi scheletrato per individuare la linea centrale. (E) La curva risultante è stato poi successivamente interpolati in 101 segmenti e l'angolo calcolato tra i segmenti è stato utilizzato per la parametrizzazione della curva. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Calcolo eigenmode. Curve fondamentali della forma di vite senza fine sono stati calcolati utilizzando Analisi dei componenti Principio 5. Ciascuna curva senza fine è rappresentato da una somma lineare degli autovettori (o eigenworms), dove la ampiezza di ciascun componente è noto come eigenmode (mode). Possiamo quantificare il comportamento del verme misurando i primi 3 modi di vibrare del verme forma nel tempo.
Figura 4. Fase e velocità. (A) La distribuzione congiunta dei primi due modi per un ciclo limite. (B) La fase o la posizione su questo ciclo limite correla con la fase della posizione ondulatorio del verme. (C) Usando la velocità di fase i vermi movimenti avanti e indietro può essere quantificato. (D) La velocità e la direzione lungo questa cicli limite indica la velocità del worm. Clicca qui per ingrandire la figura .
4094fig5.jpg "alt =" Figura 5 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Figura 5. Commutazione velocità di fase dipendente. Le transizioni tra gli stati avanti e indietro non accadono per caso lungo il ciclo oscillatorio. Essi (ma ancora stocasticamente) accadere in fasi specifiche. (A) La distribuzione congiunta della velocità di fase e la velocità indica chiaramente che i vermi uscire e entrare nello stato in avanti preferenzialmente a fasi specifiche. (B) mostra un grafico della fase condizionato all'ingresso di un evento di ribaltamento. (C) mostra la condizione di fase all'uscita di un evento di ribaltamento. La linea nera è la distribuzione di angoli di fase senza condizionamento su un ingresso o uscita.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lo studio della locomozione e il comportamento naturale richiede tecniche di rilevamento non invasive nei paesi partner e con le tecniche di riduzione dei dati. Qui abbiamo dimostrato un facile da usare sistema di tracciamento che registra le immagini dettagliate di C. elegans comportamento come striscia sulla superficie di una piastra di agar. La quantità di informazioni contenute in queste immagini è vasto e alto-dimensionali, e così abbiamo anche sviluppato metodi per ridurre la dimensionalità dei dati in soli quattro misure fondamentali. Queste misure sono complete e sono facili da interpretare rispetto al comportamento worm. Per questo lavoro abbiamo dimostrato che i vermi transizione tra avanti e indietro afferma preferibilmente in punti diversi del suo ciclo ondulatorio, una misura che è difficile da fare a occhio. Questo lavoro è complementare a sistemi di tracciamento che sono stati sviluppati per misurare il comportamento di vermi in basso ingrandimento 8,9,10, e anche per sistemi in grado di misurare o modulare neuronale Actività utilizzando reagenti geneticamente codificati 11,12.
Durante l'inseguimento singolo organismo è un potente metodo per la quantificazione del comportamento ci sono alcune limitazioni alla tecnica. Il primo è il fatto che il sistema traccia solo singoli organismi alla volta. In confronto ad inseguitori a telecamera fissa, che sono in grado di monitorare gli organismi più 9,10, la velocità del nostro tracker è bassa. Tuttavia, siamo in grado di misurare il comportamento del singolo organismo per periodi molto più lunghi rispetto ai multi-trackers vite senza fine, che è importante per quantificare i comportamenti lungo tempo scala come la fame, la deposizione delle uova, e il foraggiamento. Anche il tracker necessita di immagini che identificano chiaramente il worm dallo sfondo. Questo ci impedisce di studiare i movimenti a vite senza fine in ambienti che sono visivamente ingombra o comunque troppo complesso per il sistema di elaborazione delle immagini per filtrare il worm.
Questo sistema è flessibile e può essere utilizzato per altri tipi di behavimonitoraggio orale. Invece di un ambiente omogeneo, il worm può essere monitorato durante presentata spaziale e temporale le informazioni sensoriali, simile ad altri sistemi di tracciamento. Per esempio, stimolo termico può essere applicato tramite laser stimolo 7,14, o informazioni chimiche può essere applicata a gradienti spaziali attraverso l'agar 3. Il sistema nel suo complesso è flessibile nel design e può essere utilizzato con altri sistemi striscianti quali larve Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
