Summary
Nous avons développé un système de vidéo-microscope taux de suivi qui permet d'enregistrer et de quantifier
Abstract
Nous avons développé des techniques d'analyse de l'instrumentation, traitement d'image, et les données pour quantifier le comportement locomoteur de C. elegans comme il rampe sur la surface d'une plaque de gélose. Pour l'étude de la génétique, biochimique base, et neuronales du comportement, C. elegans est un organisme idéal car il est génétiquement docile, prête à la microscopie, et montre un certain nombre de comportements complexes, y compris les taxis, l'apprentissage et l'interaction sociale 1,2. Analyse comportementale basée sur le suivi des mouvements des vers comme ils rampent sur des plaques de gélose ont été particulièrement utiles pour l'étude du comportement sensorielle 3, de la locomotion 4, et en général phénotypage mutationnel 5. Notre système fonctionne en déplaçant le système de caméra et d'éclairage comme les vers rampe sur une plaque de gélose à l'arrêt, ce qui garantit l'absence de sollicitation mécanique est transmise à la vis sans fin. Notre système de suivi est facile à utiliser et comprend une fonction d'étalonnage semi-automatique. A challenge de tous les systèmes de suivi vidéo est qu'elle génère une énorme quantité de données qui est intrinsèquement dimensionnelle élevée. Notre traitement de l'image et les programmes d'analyse des données relever ce défi en réduisant la forme des vers en un ensemble de composants indépendants, qui complète reconstruire le comportement des vers en fonction de seulement 6,7 Dimensions 04.03. A titre d'exemple du processus, nous montrons que le ver entre et sort de son état d'une manière inversion de phase spécifique.
Protocol
1. Description des microscopes de suivi
- Une plaque de gélose est éclairé par une source de lumière à fibres et visualisée à l'aide d'une caméra. Ce système est monté sur un X, Y étage de translation.
- L'étape est déplacé par la norme moteurs pas à pas, qui sont connectés à un contrôleur de moteur pas à pas.
- Le contrôleur de caméra et sont reliés à l'ordinateur et commandé par des programmes écrits dans la mesure LabVIEW.
- L'appareil photo des images de la surface d'une plaque de gélose et identifie les objets foncés sur un fond clair.
- La qualité d'image est réglée de sorte que le programme informatique permet de quantifier des objets en temps réel. Le gain, la luminosité et la vitesse d'obturation de la caméra peut être ajustée pour fournir un objet sombre sur un fond blanc.
- Une marque de calibrage pour le calibrage automatique se fait en poussant la surface de la gélose avec un choix sans fin.
- Le filtrée, l'image binaire qui est utilisée par le programme de suivi de piste peut être vérifiée.
- Ce que l'onftware a une fonction d'auto-calibration qui calcule la matrice de calibrage en déplaçant un objet de test à une distance fixe.
- Les distances en pixels est calibré pour les mesures prises par le moteur pas à pas par la matrice d'étalonnage.
- Après l'étalonnage, le système est prêt à fonctionner et n'a pas besoin d'être recalibré à moins que le grossissement est changé ou si l'appareil est remis en place.
2. Préparation des plaques de suivi et C. elegans pour suivi
- Un anneau en cuivre est utilisé pour réunir les vers et les empêcher de migrer vers le bord de la plaque. Le cuivre constitue une barrière chimique locale et n'affecte pas le mouvement de la vis sans fin par ailleurs pour la durée de l'expérience (<1 h). Chauffer le premier anneau en le plaçant sur un bloc de chauffage ou l'équivalent.
- Placer le cylindre sur une plaque de gélose fraîche (1,7% Bacto Agar, 0,25% de Bacto-peptone, 0,3% de NaCl, CaCl2 1 mM, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampon phosphate de potassium, 5 pg / mlcholestérol) et appuyer légèrement pour l'intégrer dans la surface de la gélose.
- Choisissez L4 scène ou vers adultes jeunes sur une plaque de gélose rempli d'une mémoire tampon NGM (0,3% de NaCl, CaCl2 1 mM, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampon phosphate de potassium) pour les laver de résidus alimentaires. Laissez-les vers nager pendant quelques minutes.
- Soigneusement placer une vis sans fin unique sur la plaque de centrage à proximité du centre de l'anneau. Et puis placez la plaque sur le tracker ver.
3. Suivi Worm
- Exécutez le programme LabVIEW et sélectionnez les options si nécessaire (emplacement pour les images, les types d'images, mesures, réglages de l'appareil).
- En utilisant le levier de commande de déplacer le microscope jusqu'à ce que l'image de la vis sans fin est dans le champ de vision (écran d'ordinateur). Appuyez sur "piste" pour engager le programme de suivi.
- Le programme d'ordinateur mesure effectivement les mouvements d'une image binaire filtrée comme indiqué et peut effectuer des mesures sur cette image en temps réel
- À l'arrièreer le suivi d'une reconstruction de la trajectoire globale peut être faite à partir des mouvements moteurs pas à pas, tandis que les changements de forme locale du ver peut être vu en détail.
4. Analyse des données
- Exécuter le script squelettisation (MATLAB) pour paramétrer les formes du ver. (Figure 2)
- Calculer modes propres des données squelettés. (Figure 3,4)
- Voir Figure 5. Lire légende de la figure ou des résultats représentatifs.
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Representative Results
Exemple: Lors de la recherche de nourriture, C. transitions elegans d'avant en arrière le mouvement, souvent effectuer une réorientation (oméga tour) avant de revenir à l'état de mouvement vers l'avant. Quantifier cette transition est importante pour comprendre les habitudes d'alimentation de mouvement et aussi dans le contrôle moteur du ver. Le pouvoir de révéler des détails subtils du comportement de locomotion peut être vu en utilisant notre dispositif suiveur.
A titre d'exemple nous regardons vers l'avant pour renverser et inverser de transmettre la transition en capturant des images haute résolution de vers qui rampent librement sur la plaque de gélose pour ~ 30 min. s'exécute. L'analyse mode propre (Figure 3) permet de mesurer la phase des mouvements ondulatoires du ver. La mesure de phase à son tour nous permet de calculer la vitesse de la vis sans fin et vers l'avant pour renverser la transition (figure 4). En traçant la probabilité conjointe de la vitesse de la vis sans fin et de la phase, nous pouvons voir que le transition entre avant et arrière se produisent de façon probabiliste avec une phase préférentielle (figure 5a). Si nous séparer avant en arrière et d'inverser les transitions de transmettre et de regarder la probabilité conditionnelle de la phase de la vis sans fin quand il entre et sort un événement inversion, on voit qu'ils ont des distributions de phase distincts (figure 5b, c).
Figure 1. Suivi microscope. L'échantillon d'un ver rampant sur une plaque de gélose reste stationnaire tandis que le système de formation d'image se déplace afin de maintenir la vis sans fin dans le centre de la vue. Le système d'imagerie est construit sur un étage de translation 2D entraînés par des moteurs pas à pas (3). Une caméra CCD (Basler A601f) et l'objectif (focale 25mm) images du ver ci-dessous (1) et une lumière en fibre optique (Edmunds, modèle), il éclaire d'en haut (2). Une maison moteur pas à pas contrôleur en utilisant un simpleep carte contrôleur (SimpleStep; SSXYZ) contrôle le mouvement du système d'imagerie. Un programme personnalisé LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, USA) acquiert et traite les images des vers, tout en communiquant avec le contrôleur du moteur pour maintenir le ver dans le centre du champ.
Figure 2. Traitement de l'image. (A) Worms déplacer en changeant leur courbure dans le temps et donc nous avons traité les images à vis sans fin en paramétrant leur ligne médiane. Les images ont été faites binaire par thesholding l'image à échelle de gris brut (b), et chaque ver ont été identifiés par filtrage des objets par taille (c). La distance entre le centre de la masse de la vis sans fin et le centre de l'image a été calculée, puis la scène a été déplacée des distances appropriées à recentrer le worm. Ces distances de correction ont été utilisés pour calculer la trajectoire de la vis sans fin. La courbure de la vis sans fin périmètre a été utilisé pour identifier la queue (courbure maximale) et la tête (maximum secondaire). (D) Les images ont ensuite été squelette pour localiser la ligne médiane. (E) La courbe obtenue a ensuite été ensuite interpolée en 101 segments et l'angle calculé entre les segments a été utilisé pour paramétrer la courbe. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Calcul modes propres. Courbes fondamentaux de la forme ver ont été calculées en utilisant l'analyse en composantes principales 5. Chaque courbe de vis sans fin est représentée par une somme linéaire des vecteurs propres (ou eigenworms), où l' amplitude de chacun des composants est connu comme le mode propre (mode). On peut quantifier le comportement de la vis sans fin par la mesure des 3 modes propres de la première forme sans fin au cours du temps.
Figure 4. Phase et la vitesse. (A) La distribution conjointe des deux premiers modes pour un cycle limite. (B) La phase ou de la position sur le cycle limite est en corrélation avec la position de phase des ondulations du ver. (C) En utilisant la vitesse de phase les vers l'avant et vers l'arrière les mouvements peuvent être quantifiés. (D) La vitesse et la direction le long de ces cycles limites indique la vitesse du ver. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 5. Commutation de vitesse de phase dépend. Les transitions entre les états avant et arrière ne se produisent pas au hasard le long du cycle d'oscillation. Ils (mais toujours stochastique) se produisent à des phases spécifiques. (A) La distribution conjointe de la vitesse de phase et la vitesse indique clairement que les vers sortir et entrer dans l'état de l'avant de manière préférentielle à des phases spécifiques. (B) montre un tracé de la phase conditionnée à l'entrée d'un événement inversion. (C) représente la phase conditionnée par la sortie d'un événement inversion. La ligne noire est la distribution des angles de phase sans conditionné sur une sortie ou d'entrée.
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Discussion
L'étude de la locomotion et du comportement naturel nécessite des techniques non invasives de suivi dans des partenariats avec des techniques de réduction des données. Ici, nous avons fait preuve d'un système facile à utiliser de suivi qui enregistre des images détaillées de C. elegans comportement tel qu'il traîne sur la surface d'une plaque de gélose. La quantité d'informations contenues dans ces images est vaste et de grande dimension, et nous avons également développé des méthodes pour réduire la dimensionnalité des données en seulement quatre mesures fondamentales. Ces mesures sont complets et sont faciles à interpréter par rapport au comportement des vers. Pour ce travail, nous montrons que la transition vers l'avant et entre les Etats arrière préférentiellement à différents points de son cycle ondulatoire, une mesure qui est difficile à faire à l'œil nu. Ce travail est complémentaire aux systèmes de suivi qui ont été développés pour mesurer le comportement des vers à faible grossissement 8,9,10, et aussi pour les systèmes qui sont capables de mesurer ou de moduler neuronale activité en utilisant des réactifs codés génétiquement 11,12.
Alors que le suivi organisme unique est une puissante méthode pour la quantification du comportement, il ya des limites à la technique. Le premier est le fait que le système suit que des organismes simples à la fois. En comparaison avec les trackers caméras fixes qui sont en mesure de suivre de multiples organismes 9,10, le débit de notre tracker est faible. Cependant, nous sommes capables de mesurer le comportement de l'organisme unique pour des périodes beaucoup plus longues que les trackers multi-ver, ce qui est important pour quantifier les comportements de longues échelles de temps, comme la faim, la ponte et la recherche de nourriture. De plus, le suivi nécessite des images qui identifient clairement le ver de l'arrière-plan. Cela nous empêche d'étudier les mouvements ver dans des environnements qui sont visuellement encombré ou trop complexe pour le système de traitement d'images pour filtrer le ver.
Ce système est flexible et peut être utilisé pour d'autres types de behavisuivi par voie orale. Au lieu d'un environnement homogène, le ver peut être suivi pendant soumis à l'information sensorielle spatiale et temporelle, similaire à d'autres systèmes de suivi. Par exemple, un stimulus thermique peut être appliqué par laser stimulus 7,14, ou l'information chimique peut être appliqué par les gradients spatiaux à travers l'agar 3. Le système dans son ensemble est flexible dans la conception et peut être utilisé avec les systèmes d'autres rampants tels que les larves de Drosophila.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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