Summary
Temos desenvolvido um vídeo taxa de sistema de microscópio de rastreamento que pode gravar e quantificar
Abstract
Nós desenvolvemos técnicas de análise de instrumentação, processamento de imagem e os dados para quantificar o comportamento locomotor de C. elegans, uma vez que rastreia na superfície de uma placa de agar. Para o estudo da base genética, bioquímica, e neuronal de comportamento, C. elegans é um organismo ideal porque é geneticamente tratável, passível de microscopia, e mostra uma série de comportamentos complexos, incluindo táxis, aprendizagem, e 1,2 interação social. Análise comportamental, baseada em acompanhar os movimentos de vermes como eles rastejar sobre placas de agar foram particularmente úteis no estudo do comportamento sensorial 3, 4 locomoção, e fenotipagem geral mutacional 5. O nosso sistema funciona movendo o sistema de câmara de iluminação e como os vermes se arrasta em uma placa de agar estacionário, o que assegura que não haverá estímulo mecânico é transmitido para o sem-fim. O nosso sistema de rastreio é fácil de utilizar e inclui uma característica de calibração semi-automático. Um challenge de todos os sistemas de seguimento de vídeo é que gera uma quantidade enorme de dados que é intrinsecamente elevado dimensional. Nossa programas de processamento de imagem e análise de dados lidar com este desafio, reduzindo a forma vermes em um conjunto de componentes independentes, os quais de forma abrangente reconstruir o comportamento vermes como uma função de apenas 3-4 dimensões 6,7. Como um exemplo do processo mostra-se que o vírus entra e sai do seu estado de inversão de fase de uma forma específica.
Protocol
1. Descrição do Microscópio de Seguimento
- Uma placa de ágar é iluminado por uma fonte de luz de fibra e fotografada com uma câmara. Este sistema é montado em um estágio de translação X, Y.
- A fase é movida por motores de passo padrão, os quais são ligados a um controlador de motor de passo.
- O controlador e da câmara são ligados ao computador e controlados por programas personalizados escritos em LabVIEW.
- A câmara capta as imagens da superfície de uma placa de ágar e identifica objetos escuros em um fundo claro.
- A qualidade de imagem é ajustado de modo que o programa de computador pode quantificar objectos em tempo real. O ganho, o brilho, e a velocidade do obturador da câmara pode ser ajustado para proporcionar um objecto escuro sobre um fundo branco.
- A marca de referência para o processo de calibração automática é feita por picar a superfície do agar com uma picareta verme.
- A imagem, filtrada binário que é usado pelo programa de controle pode ser verificado.
- O modoftware tem um recurso de auto-calibração que calcula a matriz de calibração movendo um objeto de teste a uma distância fixa.
- Distâncias em pixels é calibrado para medidas tomadas pelo motor de passo pela matriz de calibração.
- Após a calibração, o sistema está pronto para ir e não precisa ser recalibrado, a menos que a ampliação é alterada ou se a câmera é reposicionado.
2. Preparando Placas de Rastreamento e C. elegans para Rastreamento
- Um anel de cobre é utilizado para encurralar os vermes e mantê-los de migrar para a borda do prato. O cobre proporciona uma barreira química local e não afecta o movimento do sem-fim de outro modo para a duração da experiência (<1 hora). Aqueça o primeiro anel, colocando-o sobre uma placa de aquecimento ou equivalente.
- Anel lugar sobre uma placa de agar fresca (1,7% Agar Bacto, 0,25% de Bacto-peptona, 0,3% de NaCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM de tampão de fosfato de potássio, 5 ug / mlcolesterol) e pressione um pouco para incorporá-lo na superfície do ágar.
- Escolha L4 fase ou vermes adultos jovens numa placa de ágar preenchido com algum buffer NGM (0,3% de NaCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM de tampão de fosfato de potássio), para lavá-los de resíduos de comida. Deixe os vermes nadar por alguns minutos.
- Cuidadosamente coloque um único sem-fim na placa de controle, perto do centro do anel. E em seguida, coloque a placa sobre o rastreador worm.
3. Rastreamento Worm
- Execute o programa LabVIEW e selecionar as opções, se necessário (localização de imagens, tipos de imagens, medições, as configurações da câmera).
- Usando o joystick mover o microscópio até que uma imagem do verme está no campo de visão (ecrã de computador). Pressione "faixa" para envolver o programa de rastreamento.
- O programa de computador, na verdade, mede o movimento de uma imagens binárias filtradas conforme mostrado e pode fazer medições nesta imagem em tempo real
- À réer rastrear uma reconstrução da trajectória global pode ser feito a partir dos movimentos de motores de passo, enquanto a forma muda locais do sem-fim pode ser vista em detalhe.
4. Análise de Dados
- Executar script skeletonizing (MATLAB) para parametrizar formas do verme. (Figura 2)
- Calcule autovetores dos dados esqueletizadas. (Figura 3.4)
- Figura 5 mostram. Leia legenda da figura ou resultados representativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exemplo: Quando forrageamento, C. transições elegans de frente para reverter o movimento, muitas vezes realizando uma reorientação (ômega vez) antes de retornar ao estado de movimento para a frente. Quantificar essa transição é importante para entender os padrões de forrageamento de movimento e também no controle do worm motor. O poder de revelar detalhes sutis de comportamento locomoção pode ser visto através do nosso dispositivo rastreador.
Como exemplo, vamos olhar para a frente para reverter e inverter de transmitir a transição através da captura de imagens de alta resolução de vermes rastejantes livremente sobre a placa de ágar para ~ 30 min. é executado. A análise Eigenmodos (Figura 3) que nos permite medir a fase de movimentos ondulatórios do verme. A medida de fase, por sua vez, permite-nos calcular a velocidade do sem-fim e para a frente para inverter transição (Figura 4). Traçando a probabilidade conjunta de velocidade do sem-fim e fase, podemos ver que a transition entre a frente e reverso probabilisticamente acontecer com uma fase preferencial (Figura 5a). Se separar a frente para reverter e inverter de transmitir transições e olhar para a probabilidade condicional de a fase do worm quando entra e sai de um evento de reversão, vemos que eles têm distribuições de fase distintas (Figura 5b, c).
Figura 1. Seguimento microscópio. A amostra de um verme rastejante em uma placa de agar permanece estacionária, enquanto o sistema de imagem move-se para manter o sem-fim, no centro de visão. O sistema de imagem é construída em um estágio de tradução 2D impulsionado por motores de passo (3). Uma câmera CCD (Basler A601f) e lente (25mm de distância focal) imagens do verme abaixo (1) e uma luz de fibra óptica (Edmunds, modelo) acende-lo de cima (2). Um caseiro de passo controlador do motor utilizando uma simplesep controlador placa (SimpleStep; SSXYZ) controla o movimento do sistema de imagem. Um programa personalizado LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EUA), adquire e processa as imagens dos vermes, ao mesmo tempo, a comunicação com o controlador do motor para manter o sem-fim, no centro do campo.
Figura 2. Processamento de imagens. (A) Worms movimentar, alterando a sua curvatura no tempo e no modo que as imagens processadas por vermes parametrização sua linha central. As imagens foram feitas pelo binário thesholding a imagem em escala de cinzento cru (b), e vermes individuais foram identificadas por filtragem objetos por tamanho (c). A distância entre o centro da massa do sem-fim e o centro da imagem e, em seguida, foi calculada a fase foi movido as distâncias adequadas para re-centralizar o worm. Estas distâncias de correção foram utilizados para calcular a trajetória do worm. A curvatura do perímetro verme foi utilizada para identificar a cauda (encurvada) e cabeça (máximo secundário). (D) As imagens foram então esqueletizada para localizar a linha central. (E) A curva resultante foi então então interpolados em 101 segmentos e o ângulo calculado entre os segmentos foi usado para parametrizar a curva. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Eigenmodos cálculo. Curvas fundamentais da forma verme foram calculadas usando a Análise de Componente Princípio 5. Cada curva de sem-fim está representada por uma soma linear dos autovetores (ou eigenworms), onde o amplitude de cada componente é conhecido como o Eigenmodos (modo). Podemos quantificar o comportamento do verme medindo os primeiros 3 autovetores da forma sem-fim ao longo do tempo.
Figura 4. Fase e velocidade. (A) A distribuição conjunta dos dois primeiros modos de ciclo limite. (B) A fase de posição sobre este ou ciclo limite correlaciona-se com a fase da posição do verme ondulatória. (C) Utilizando a velocidade de fase dos vermes para a frente e para trás, os movimentos podem ser quantificados. (D) A velocidade e direção ao longo desta ciclos limite indica a velocidade do worm. Clique aqui para ver maior figura .
4094fig5.jpg "alt =" Figura 5 "fo: conteúdo largura =" 4in "fo: src =" files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg / "/>
Figura 5. Fase de comutação dependente da velocidade. As transições entre os estados para a frente e reversa não ocorrem aleatoriamente ao longo do ciclo oscilatório. Eles (mas ainda estocasticamente) acontecem em fases específicas. (A) A distribuição conjunta da velocidade de fase e da velocidade indica claramente que os vermes sair e entrar no estado para a frente preferencialmente em fases específicas. (B) mostra um gráfico da fase condicionada à entrada para um evento de reversão. (C) mostra a fase condicionada à saída de um evento de reversão. A linha preta é a distribuição de ângulos de fase sem condicionamento em uma saída ou entrada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O estudo da locomoção e comportamento natural requer técnicas não-invasivas de rastreamento em parceria com técnicas de redução de dados. Aqui demonstramos um fácil de usar sistema de rastreamento que registra imagens detalhadas de C. elegans comportamento, uma vez que se arrasta na superfície de uma placa de agar. A quantidade de informação contida nestas imagens é vasto e de alta-dimensional, e por isso também têm desenvolvido métodos para reduzir a dimensionalidade dos dados em apenas quatro medidas fundamentais. Estas medidas são abrangentes e são fáceis de interpretar em relação ao comportamento worm. Para este trabalho nós mostramos que a transição entre os vermes para a frente e para trás, afirma preferencialmente em diferentes pontos do seu ciclo de ondulatória, uma medida que é difícil de fazer por olho. Este trabalho é complementar de sistemas de seguimento que foram desenvolvidos para medir o comportamento de vermes em baixa ampliação 8,9,10, e também para os sistemas que são capazes de medir ou modular a acti neuronalvity utilizando reagentes codificados geneticamente 11,12.
Enquanto rastreamento único organismo é um poderoso método para quantificação de comportamento há algumas limitações da técnica. O primeiro é o facto de que o sistema controla apenas os organismos individuais de cada vez. Em comparação com rastreadores de câmera fixa, que são capazes de rastrear vários organismos 9,10, o rendimento do nosso tracker é baixo. No entanto, somos capazes de medir o comportamento do único organismo por períodos muito mais longos de tempo do que os trackers multi-sem-fim, que é importante para quantificar comportamentos muito tempo escala, tais como a fome, a postura de ovos, e alimentação. Além disso, o rastreador requer imagens que identifiquem claramente o verme do fundo. Isso nos impede de estudar movimentos sem-fim em ambientes que são visualmente desordenado ou muito complexo para o sistema de processamento de imagem para filtrar o worm.
Este sistema é flexível e pode ser utilizado para outros tipos de behavirastreamento oral. Em vez de um ambiente homogêneo, o worm pode ser rastreado enquanto submetidos a espacial e temporal informação sensorial, semelhante a outros sistemas de rastreamento. Por exemplo, estímulo térmico pode ser aplicado através de laser de estímulo 7,14, ou informações químicas podem ser aplicados por meio de gradientes espaciais através do ágar 3. O sistema como um todo é flexível na concepção e pode ser usado com sistemas de rastreamento, tais como larvas de Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028 (2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914 (2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
