Summary
우리는 기록하고 계량화 할 수있는 비디오 속도 추적 현미경 시스템을 개발 한
Abstract
우리는 C.의 locomotory 동작을 수량화하기 위해 계측, 이미지 처리 및 데이터 분석 기술을 개발했습니다 elegans는 한천 플레이트의 표면에 크롤링 있습니다. 행동, C.의 유전자, 생화학, 그리고 neuronal 기초 연구에 대한 이 현미경 의무, 유전자 다루기 쉬운이며, 택시, 학습, 사회 상호 작용 1,2 등의 복잡한 행동의 수를 보여주기 때문에 elegans는 이상적인 유기체입니다. 그들은 한천 플레이트에 크롤링하는 웜의 움직임을 추적에 따라 행동 분석은 감각 동작 3, 운동 4, 및 일반 mutational phenotyping (5)의 연구에 특히 유용했습니다. 우리 시스템은 웜이 더 기계적 자극이 웜에 전송되지 않습니다 보장 고정 한천 플레이트에 크롤링으로 카메라와 조명 시스템을 이동하여 사용할 수 있습니다. 우리의 추적 시스템은 사용하기 쉬운이며, 반자동 보정 기능이 포함되어 있습니다. 차모든 동영상 추적 시스템의 llenge는 차원 본질적으로 높은 데이터의 엄청난 금액을 생성하는 것입니다. 우리 영상 처리 및 데이터 분석 프로그램은 종합적으로 만 3-4 치수 6,7의 기능으로 웜 동작을 재구성 독립적 인 구성 요소의 집합으로 웜 모양을 줄임으로써 이러한 문제를 처리합니다. 과정의 예를 들어 우리는 웜이 위상 특정 방식으로의 반전 상태를 입력하고 종료 보여준다.
Protocol
1. 추적 현미경에 대한 설명
- 한천 플레이트는 섬유 광원에 의해 조명과 카메라와 이미징 있습니다. 이 시스템은 X, Y 번역 단계에 장착된다.
- 무대는 스테퍼 모터 컨트롤러에 연결되어있는 표준 스테퍼 모터에 의해 이동된다.
- 컨트롤러와 카메라가 컴퓨터에 연결되어 LabVIEW로 작성된 사용자 정의 프로그램에 의해 제어됩니다.
- 카메라는 이미지 한천 플레이트의 표면을과 가벼운 배경에 어두운 물체를 식별 할 수 있습니다.
- 컴퓨터 프로그램이 실시간으로 객체를 수량화 할 수 있도록 이미지 화질이 조정됩니다. 게인, 밝기, 카메라의 셔터 속도는 흰색 배경에 검은 물체를 제공하기 위해 조정할 수 있습니다.
- 자동 보정 과정에 대한 보정 마크는 웜 곡괭이로 한천 표면을 농담으로 구성되어 있습니다.
- 추적 프로그램에 의해 사용되는 필터링, 바이너리 이미지를 확인하실 수 있습니다.
- 그래서ftware는 테스트 개체에게 고정 된 거리를 이동하여 보정 행렬을 계산하는 자동 보정 기능이 있습니다.
- 픽셀 거리가 보정 매트릭스하여 스테퍼 모터에 의해 촬영 단계로 조정됩니다.
- 보정 한 후, 시스템은 갈 준비하고 배율이 변경되지 않는 한 또는 카메라 위치를 변경하는 경우 recalibrated 할 필요가 없습니다.
2. 추적 접시와 C. 준비 추적에 대한 elegans
- 구리 반지가 벌레를 마차를 둥글게 둘러 친 진과 접시의 가장자리로 마이그레이션에서 그들을 유지하는 데 사용됩니다. 구리는 지역 화학 장벽을 제공하며 실험 (<1 시간)의 기간 동안 달리 웜의 움직임에 영향을주지 않습니다. 열 블록 또는 이와 동등한에 배치하여 먼저 링을 가열.
- 신선한 한천 플레이트로 장소 링 (1.7 % Bacto 한천, 0.25 % Bacto-펩톤, 0.3 % NaCl, 1 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 25 MM 인산 칼륨 버퍼, 5 μg / ML콜레스테롤)과 한천 표면에을 삽입 할 약간 아래로 누르십시오.
- 식품 잔류 물을 닦아야 일부 NGM 버퍼 (0.3 % NaCl, 1 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 25 MM의 칼륨 인산 버퍼)로 가득 한천 플레이트에 L4 단계 또는 젊은 성인 웜를 선택합니다. 웜은 몇 분 동안 수영을 보자.
- 조심스럽게 링의 중심 근처의 추적 플레이트에 하나의 웜을 배치합니다. 그리고 웜 추적기로 판을 놓습니다.
3. 웜 추적
- LabVIEW 프로그램을 실행하고 필요한 경우 (이미지에 대한 위치, 이미지, 측정, 카메라 설정의 종류) 옵션을 선택합니다.
- 조이스틱이 웜의 이미지까지 현미경을 이동 사용하면 시야 (컴퓨터 화면)에 있습니다. 추적 프로그램을 참여하려면 "트랙"을 누르십시오.
- 컴퓨터 프로그램은 실제로 같이 바이너리 필터링 이미지의 움직임을 측정하고 실시간으로이 이미지에 대한 측정을 할 수 있습니다
- 고물에웜의 로컬 형상 변경 사항이 상세하게 볼 수있는 동안 글로벌 궤도의 재건을 추적 어,이 스테퍼 모터의 움직임에서 만들어 질 수있다.
4. 데이터 분석
- 웜의 모양을 매개 변수화 할 수 skeletonizing 스크립트 (MATLAB)를 실행합니다. (그림 2)
- skeletonized 데이터 eigenmodes을 계산합니다. (그림 3,4)
- 그림 5를 표시합니다. 그림 범례 또는 대리인 결과를 읽어 보시기 바랍니다.
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Representative Results
예 : foraging, C. elegans 전환 앞으로의 자주 전진 상태로 돌아 가기 전에 reorientation을 (오메가 턴) 수행, 운동을 반대로합니다. 이 전환을 정량화하는 것은 운동의 foraging 패턴을 이해하고 또한 웜의 모터 제어에 중요합니다. 운동 행동의 미묘한 세부 사항을 공개 할 수있는 능력은 우리의 추적 장치를 사용하여 볼 수 있습니다.
예를 들어 우리는 반대로 ~ 30 분의 한천 플레이트에 자유롭게 크롤링 웜의 고해상도 이미지를 캡처하여 전환을 전달 반대로 앞으로 좀 봐. 실행됩니다. eigenmode 분석 (그림 3) 우리가 웜의 undulatory 운동의 위상을 측정 할 수 있습니다. 차례로 위상 측정은 우리가 웜과 전환 (그림 4) 바꿀 수있는 앞으로의 속도를 계산 할 수 있습니다. 웜의 속도와 단계의 공동 확률을하려함으로써, 우리는 그 트랜스 볼 수 있습니다순방향 및 역방향 우대 단계 (그림 5A)와 probabilistically 일 사이 ition. 우리가 반대로 전환을 전달하고 반전 이벤트를 입력하고 종료 웜의 위상의 조건부 확률 보는 역 앞으로 분리하는 경우, 우리는 사람들이 서로 다른 위상 분포를 (그림 5B, C)하신 것으로 알고 있습니다.
그림 1. 현미경을 추적. 이미징 시스템보기의 중심에 웜을 유지하기 이동 중에 한천 플레이트에 크롤링 웜의 샘플은 고정 남아 있습니다. 이미징 시스템은 스테퍼 모터 (3)에 의해 구동되는 2D 번역 무대에서 내장되어 있습니다. CCD 카메라 (Basler A601f)와 렌즈 (25mm 초점 거리) 이미지 아래에서 웜 (1)과 섬유 등 (에드먼즈 광학, 모델) (2) 위에서 켜집니다. 간단한을 사용 수제 스테퍼 모터 컨트롤러EP 컨트롤러 보드 (SimpleStep, SSXYZ)는 이미징 시스템의 움직임을 제어합니다. 동시에 필드의 중앙에 웜을 유지 모터 컨트롤러와 통신하는 동안 사용자 정의 LabVIEW 프로그램 (내쇼날 인스트루먼트, 오스틴, TX, USA)는 웜의 이미지를 획득하고 처리합니다.
그림 2. 이미지 처리. (A) 웜은 시간에서의 곡률을 변경하여 이동하고 그래서 우리는 센터 라인을 parameterizing하여 웜 이미지를 처리했습니다. 이미지는 원시 그레이 스케일 이미지 (B)를 thesholding하여 바이너리를 만든, 개인 웜은 크기 (C)에 의해 개체를 필터링하여 식별되었습니다. 웜의 질량의 중심과 이미지의 중심 사이의 거리가 다시 센터 앨리스의 적절한 거리를 계산 한 다음 단계는 이동했습니다RM. 이러한 보정 거리가 웜의 궤도를 계산하는 데 사용되었습니다. 웜 주변의 곡률은 꼬리 (최대 곡률)과 머리를 (보조 최대) 식별하는 데 사용되었다. (D) 이미지는 다음 중심선을 찾습니다 skeletonized했다. (E) 결과 곡선은 다음엔 101 세그먼트로 보정되었고 세그먼트 사이의 계산 된 각도는 곡선을 매개 변수화하는 데 사용되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. Eigenmode 계산. 웜 형태의 기본 곡선은 원리 구성 요소 분석 5 사용하여 계산되었습니다. 각 웜 곡선은 고유 벡터의 선형 합 (또는 eigenworms)로 표시되는 각 구성 요소의 진폭은 eigenmode (모드)로 알려져 있습니다. 우리는 시간이 지남에 따라 웜 모양의 처음 3 eigenmodes을 측정하여 웜의 동작을 수량화 할 수 있습니다.
그림 4. 위상 및 속도. 제한주기위한 첫 두 모드 (A) 공동 분포. (b) 본 제한 사이클의 단계 나 위치는 웜의 undulatory 위치의 위상과 연결합니다. (C) 웜 앞으로 위상 속도를 사용 및 역방향 움직임이 정량화 될 수 있습니다. (D)이 제한주기를 따라 속도와 방향은 웜의 속도를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 5. 단계 따라 속도 스위칭. 순방향 및 역방향 상태 사이의 전환은 왕복주기를 따라 무작위로 발생하지 않습니다. 그들은 (하지만 여전히 stochastically) 특정 단계에서 발생합니다. (가) 위상 속도와 속도의 공동 배포 분명 웜은 특정 단계에서 우선적으로 앞으로 상태를두고 입력을 나타냅니다. (b)는 반전 이벤트의 입구에 에어컨이 단계의 음모를 보여줍니다. (C) 반전 이벤트의 출구에 에어컨이 단계를 보여줍니다. 검은 선은 출구 또는 입구에 에어컨이없는 위상 각도의 배포입니다.
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Discussion
운동과 자연 행동의 연구는 데이터 감소 기술과 파트너의 비 침습적 추적 기술이 필요합니다. 여기 C.에 대한 자세한 이미지를 기록 추적 시스템을 사용하기 쉬운을 증명 한 는 한천 플레이트의 표면에 크롤링으로 elegans 행동. 이러한 이미지에 포함 된 정보의 양이 광대 높은 차원이며, 그래서 우리는 네 개의 근본적인 조치로 데이터의 차원을 줄이기 위해 방법을 개발했습니다. 이러한 조치는 포괄적이며 웜의 행동에 대해 해석하기 쉽습니다. 이 작품의 경우는 순방향 및 역방향의 undulatory주기의 서로 다른 점을 눈으로 할 어려운 조치에 우선적으로 국가 사이의 그 웜 전환을 보여줍니다. 이 작품은 측정 할 수 있습니다 또는 neuronal acti을 조절 시스템도 낮은 배율 8,9,10에서 웜의 동작을 측정하기 위해 개발 된 시스템을 추적에 보완하며,유전자 인코딩 시약에게 11,12을 사용하여 vity.
하나의 유기체 추적 행동을 정량화하기위한 강력한 방법이지만 기술에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫 번째는 시스템이 한 번에 하나의 생물을 추적 있다는 사실입니다. 여러 생물 9,10을 추적 할 수 있습니다 고정 카메라 추적에 비해 우리 추적기의 처리량이 낮습니다. 그러나, 우리는 기아, 계란 부설하고, foraging 등 시간이 오래 규모 동작을 수량화하는 것이 중요합니다 멀티 웜 추적,보다 시간이 훨씬 더 오래 기간 동안 하나의 유기체의 행동을 측정 할 수 있습니다. 또한 추적은 명확 배경에서 웜을 식별 이미지가 필요합니다. 이 웜을 필터링 할 수있는 영상 처리 시스템의 시각 복잡하거나 너무 복잡 환경에서 웜의 움직임을 공부에서 우리를 precludes.
이 시스템은 유연하고 behavi 다른 종류의 사용할 수 있습니다구두 추적. 대신 동질적인 환경의 다른 추적 시스템과 유사한 공간과 측두엽 감각 정보를 제출 반면, 웜은 추적 할 수 있습니다. 예를 들어, 열 자극은 레이저 자극 7,14를 통해 적용 할 수있는, 또는 화학 정보는 한천 3 일까지 공간 그라디언트를 통해 적용 할 수 있습니다. 전체 시스템은 설계에 유연하고 Drosophila의 애벌레 같은 다른 크롤링 시스템에서 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Basler | A601f | |
| Lens | Edmund Optics | MMS series | |
| Fiber Illumination | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Translation stage | Deltron | LS3-4 | |
| Stepper Motor | US digital | MS23C | |
| Stepper motor drive | Gecko | G201 | |
| Stepper motor control | SimpleStep | SSXYZ | |
| All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author. | |||
References
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