Summary
Макрофаги играют центральную роль в поддержании гомеостаза и патологии во многих тканях. Протокол, представленные здесь описываются методы истощения макрофагов
Abstract
Макрофаги являются важнейшими игроками на врожденный иммунный ответ на инфекционные проблемы или травмы, начала врожденного иммунного ответа и направления приобретенного иммунного ответа. Макрофагов дисфункция может привести к невозможности установить соответствующий иммунный ответ и, таким образом, был замешан во многих болезненных процессов, в том числе воспалительных заболеваний кишечника. Макрофаги отображение поляризованных фенотипов, которые разделены на две категории. Классически активированными макрофагами, активируются стимуляции IFNγ или ЛПС, играют важную роль в ответ на бактериальные задачей в то время как альтернативы активированные макрофаги, активированные ИЛ-4 и IL-13, участвовать в мусор очистки и тканей реконструкции и были вовлечены в разрешение фазы воспаления. В ходе воспалительной реакции в живом организме, макрофаги находятся на фоне сложной смеси проникают иммунные клетки и могут принимать участие, обостряя или resolvinг воспаления. Для определения роли макрофагов в месте, в целом модель животного, необходимо изучить влияние истощения макрофаги из сложных условиях. Чтобы задавать вопросы о роли макрофагов фенотип на месте, фенотипически определенный поляризованных макрофаги могут быть выведены бывшие естественных условиях, от аспирационной костного мозга и добавил к мышам, с или без предварительного истощения макрофагов. В протоколе, представленные здесь клодронат содержащих липосомы, против PBS вводится контроль, были использованы для разрушающих толстой макрофагов в декстран сульфата натрия (DSS), индуцированного колита у мышей. Кроме того, поляризованный макрофаги были получены бывшим естественных и переданы мышей путем внутривенной инъекции. Предостережение такого подхода является то, что клодронат содержащих липосомы, разрушающих все профессиональные фагоциты, в том числе и дендритных клеток и макрофагов, с тем чтобы обеспечить наблюдаемый эффект от истощения макрофагов конкретных, о восстановлениие фенотип приемными передачи макрофаги необходимо. Системный истощение макрофагов у мышей также может быть достигнуто путем обратного скрещивания мышей на CD11b-DTR фон, который является отличным взаимодополняющий подход. Преимущество клодронат содержащих липосомы опосредованного истощение является то, что он не требует времени и средств, участвующих в беккросс мышей и он может быть использован в мыши независимо от того, на фоне мышей (C57BL / 6, BALB / с, или смешанного происхождения ).
Protocol
1. Разрушающих Макрофаги Использование клодронат содержащих липосомы
- Липосомы хранятся при температуре 4 ° C. За два часа до инъекции, удалять клодронат содержащих липосомы, содержащие PBS липосомы, или стерильной PBS (введение контроля) из холодильника, чтобы они могли привыкнуть к комнатной температуре (18 ° C).
- Переверните пробирки, содержащие липосомы, в 8-10 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение загрузки до 200 мкл в 1 мл шприц. Приложите на 26 иглы в верхней части шприца.
- Используя левую руку, загривок мыши чуть ниже ушей проведение достаточно кожи, чтобы обездвижить его головы и конечностей.
- Наклоните мыши так что его голова немного на землю, чтобы внутренние органы отойти от места инъекции, которая находится в правом нижнем квадранте живота.
- Раскатайте шприц между ладонями и инвертировать его 6 раз, чтобы распределить равномерно липосомы решение перед инъекцией. <LI> Вставьте иглу в нижней правой части живота мыши на 30-40 градусов. Вводите 200 мкл липосом решение или PBS.
- Во время индуцированного воспаления модель, как и DSS-индуцированной колит, вводят мышам за 4 дня до начала экспериментального воспаления обеспечить истощение житель макрофагов и каждые 2 дня в протокол, чтобы исчерпать новое проникновение макрофагов.
- В конце эксперимента, наряду с запланированными экспериментальные исследования, удаление тканей с сайта интерес и закрепить параформальдегид подтвердить макрофагов истощение иммуногистохимического окрашивания.
2. Вывод поляризованный макрофаги из костного мозга всасывает
- Костный мозг мышей от 8 до 12 недель обеспечивает самую высокую доходность костномозгового происхождения макрофагов. Усыпить мышь, положите его на спину и придавить ее лапами, растяжения конечностей, насколько это возможно.
- Работа в стерильных ухг, удалить бедра и голени, срезая столько мышц, насколько возможно.
- Флеш мозг из костей с использованием IMDM 10% FCS загружается в 5 мл шприц оснащен 26 иглы.
- Развести костный мозг всасывает до 40 мл в IMDM с 10% FCS, место клеток в 75 см 2 колбы культуре ткани и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение 4 часов. Этот шаг снимает сторонник мезенхимальных клеток или зрелые макрофаги из гемопоэтических предшественников.
- Передача культуры супернатант, содержащий не соблюдают предшественники в 50 мл коническую трубку Сокол и центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл IMDM, 10% FCS и рассчитывать ядерных клеток путем разбавления клеточной суспензии 1 к 20 в уксусную кислоту. Эта процедура лизирует всех клеток, включая эритроциты и остальных ядер, можно пересчитать по гемоцитометра.
- Ресуспендирования клеток в концентрации 0,5 · 10 6 кл / мл в полной среде; IMDM, 10% FCS, 150 мкМ монотиоглицерин (MTG), и 10 нг / мл или MCSF, GM-CSF или IL-3. MCSF производные макрофаги классически активированными макрофагами, тогда как GM-CSF или IL-3-производные макрофаги альтернативы активирован.
- Замените среды на 4-й день, летел вниз, не прилипшие клетки и возвращения их в колбу, и на 7 день, отбрасывая не соблюдают клеток.
- Кроме того, IFNγ (10 нг / мл) или ИЛ-4 (10 нг / мл) могут быть добавлены в колбы, содержащие MCSF клеток, полученных в 7-й день, чтобы исказить макрофагов в классическом активировать или альтернативно активированный фенотип, соответственно. Инкубируйте клетки в течение 3 дней.
- На 10-й день, удалить СМИ и поднимать клетки от сосуда тканевой культуре использованием клеточной диссоциации буфера (Gibco-BRL). Место 5 мл буфера на клетки в течение 5 мин при комнатной температуре (18 ° C), а затем ударить по части колбы с пяткой ладони крепко несколько раз. Убедитесь, что клетки стартовал в колбе, изучив колбемикроскопом. Внесите ресуспендировали клеток в 15 мл коническую трубку Сокол и мыть колбы на 10 мл IMDM, 10% FBS. Бассейн и спином вниз клетки в течение 5 мин при 300 × г.
- Граф жизнеспособные клетки, используя гемоцитометра и ресуспендируют в концентрации 10 7 клеток / мл в стерильном PBS pH7.4. Макрофаги готовы к инъекции в мышей.
- Резервный 1,0 × 10 6 макрофагов для оценки фенотипа макрофагов. Классически активированные макрофаги стимулировали липополисахарида выделяют высокий уровень оксида азота и ИЛ-12p70 и низкий уровень IL-10 в сравнении с альтернативно активированными макрофагами. Кроме того активированными макрофагами конститутивно выразить YM1 и аргиназы I (Арги), которые могут быть обнаружены западными иммуноблоттинга.
3. Tranferring макрофаги мышей в
- Ресуспендируйте макрофагов в стерильном PBS в концентрации 10 7 клеток / мл. Это позволяет вtravenous инъекции 10 6 макрофагов в общем объеме 100 мкл, что объем, который можно безопасно и комфортно мышам в хвостовую вену.
- Теплый мышей с использованием грелки или тепла коленях в течение 5-10 мин, чтобы расширить хвостовую вену. Мониторинг мыши на все времена признаки гипертермии.
- Передача мыши сдерживающим устройство, которое обеспечивает доступ к хвосту вен.
- Поверните хвост 90 °, так что вены вверх. Вены работать с боков вниз обе стороны хвоста и как вены могут быть использованы.
- Очистите место инъекции спиртом и медленно вводят 100 мкл (10 6 макрофаги), используя 1 мл шприц с 26 или 28 иглы. Вставьте иглу с наклонной вверх и под небольшим углом, почти параллельно вене.
- Если игла вставлена никакого сопротивления должно ощущаться и вены должно стать ясно после инъекции. Если игла не находится ввены, хвост будет деформироваться. Если это произойдет, удалите иглу и попробуйте еще раз проксимальнее последняя попытка или в другом ключе. Новая игла должна быть использована для каждой инъекции, как хвост жесткие и иглы быстро притупляются в хвост инъекции вену.
- После инъекции, удалите иглу, применить легкое давление в месте инъекции, пока кровотечение не останавливается, и следить за мышью на дополнительные 5 минут, чтобы кровотечение остановилось.
- Повторите макрофагов инъекции каждые 4 дня, чтобы обеспечить непрерывную доставку поляризованных макрофагов при экспериментальном порядке.
- В конце эксперимента, а также экспериментальные исследования, удаление тканей с сайта интерес и закрепить параформальдегид или формалина для подтверждения эффективности оказания поляризованных макрофагов иммуногистохимического окрашивания.
4. Представитель Результаты
Количество и фенотип резидентов macrophages в той или иной ткани зависит от ткани рассматривается и будет меняться в течение инфекции или воспаления. Кроме того, способность клодронат содержащих липосомы, чтобы исчерпать макрофаги из ткани будет зависеть от способа введения и эффективной доставки в ткани-мишени. Внутрибрюшинного введения клодронат содержащих липосомы приводит к снижению в F4/80 + макрофагов у мышей толстой кишки в течение DSS-индуцированной колит очевидным иммуногистохимического окрашивания для макрофагов маркер, F4/80 (рис. 1А). Гистологическое окрашивание также может быть использован для определения количественных различий в число макрофагов и фенотип в срезах тканей. Рисунок 1B показывает, что в среднем 55% макрофагов исчерпывается клодронат содержащих липосомы, по сравнению с истощением не обнаружили у мышей двоеточия, когда мышам вводили PBS только в виде инъекций управления. Каждое значение определяется путем подсчета F4/80 и Арги пятноизд-положительных клеток в серийных срезов ткани от 6 мышей на 3 балла, на 3 секции на мышь с подсчетом выполняется на двух человек, ослепленный экспериментальных условиях. Эти результаты показывают, что внутрибрюшинного введения клодронат липосомы разрушают толстой макрофагов у мышей.
Вывод макрофаги из костного мозга в присутствии различных факторов роста урожайности макрофаги, которые классически активирован (MCSF, полученных или MCSF, полученных и обработанных IFNγ), либо активировать (GM-CSF и IL-3-производных или MCSF, полученных и относились с IL-4). Промывка костного мозга от 2 бедренные кости голени и 2 из 8-недельных мышей обычно дает 6 × 10 7 ядросодержащих клеток на мышь и дает 8 × 10 6 MCSF производные макрофаги, 10 × 10 6 GM-CSF производные макрофаги, или 12 × 10 6 IL-3-производных макрофагов. Рисунок 2А показывает, нитритов и IL-12p70/IL-10 соотношение макрофагов вирernatants относиться с ЛПС в течение 24 часов рис. 2б показана типичная Западная блоттинга 0,5 × 10 6 макрофагов MCSF + / -. IL-4 вывод условиях исследовали с антителами в качестве альтернативы активированного макрофагов маркеры, Арги, YM1, или как GAPDH загрузки контроля. Эти данные показывают, что костный мозг производные макрофаги могут быть искажены в поляризованном фенотип при выводе.
Эффективная передача бывших естественных получены поляризованные макрофагов в ткани зависит от способа введения и доступа к ткани. В DSS-индуцированной колит, макрофаги вводят внутривенно поехать в месте воспаления и наоборот активированными макрофагами уменьшить тяжесть заболевания. 3А показывает общее количество макрофагов и число Арги + (или активирована) макрофаги учитываются в гистологических срезов от мышей вводили с поляризованными костный мозг, Полученных макрофагов. Влияние переноса поляризованного макрофагов в толстой кишке в течение DSS-индуцированной колит проявляется болезнь индекс активности, добавка оценка основана на потере веса, ректальное кровотечение, и снижение консистенции стула (рис. 3В). Эти результаты показывают, что бывший естественных получены, восприимчиво переданы макрофаги могут трафика на толстой кишке и влияние индуцированного воспаления. M1 макрофаги не влияют воспаление в то время как М2 макрофаги значительно снизить индекс активности заболевания.
Рисунок 1. Клодронат содержащих липосомы эффективно разрушают F4/80 + и F480 + Арги + клеток у мышей двоеточия в естественных условиях. F2 поколение мышей дикого типа на смешанной C57BL / 6 × 129Sv фоне были даны 5% DSS в течение 7 дней, а введенный IP с PBS (контроль) или клодронат содержащих липосомы (клодронат) за 4 дня до лечения DSSи на 0, 2, 4 и 6 в DSS лечения. (A) Колоны были удалены, фиксированы, и срезы окрашивали по иммуногистохимии для зрелых макрофагов (F4/80) и М2 маркер макрофагов, Арги. (B) Количественная оценка F4/80 + + и Арги макрофагов. Положительно окрашенных клеток были подсчитаны по два человека знали о экспериментальных условиях при 40-кратном увеличении в 6 полей с 3 разделов / мыши и мыши с 6 / группы. * P <0,01.
Рисунок 2. MCSF производные макрофаги выразить классическим активированный фенотип и MCSF производные макрофаги относиться с IL-4 выразить альтернативы активированного макрофагов фенотипа. (А) В соответствии с классическим активированный фенотип, MCSF производные макрофаги производят более высокий уровень окиси азота в ответ на ЛПС и может быть измерен Грисса тест, который обнаруживает ее вниз по течению метаболитов, нитритов. Они ALSО производить более IL-12p70/IL-10 отношение, которое можно измерить с помощью иммуноферментного анализа. * P <0,01 для п = 3. (B) в соответствии с альтернативно активированный фенотип, MCSF производные макрофаги относиться с IL-4 конститутивно экспресс YM1 и Арги, которые могут быть обнаружены западными иммуноблоттинга. Данные представитель 3-х независимых экспериментов с аналогичными результатами.
Рисунок 3. Внутривенный впрыском, экс-живом, полученные альтернативы активированными макрофагами трафик на толстой кишки и уменьшить воспаление кишечника. F2 поколение мышей дикого типа на смешанной C57BL / 6 × 129Sv фоне были даны 5% DSS в питьевой воде в течение шести дней. М1 и М2 макрофагов вводили IV на 0, 4 во время лечения DSS. (A) Колоны были удалены, фиксированы, и срезы окрашивали по иммуногистохимии для зрелых макрофагов (F4/80) и М2 маркер макрофагов (Арги).Количественный макрофагов для контроля PBS вводили мышам (C), мышей вводили M1 макрофагов (+ М1) и мышей вводили M2 макрофагов (+ M2) проводили путем подсчета положительно окрашенных клеток при 40-кратном увеличении на 6 полей из 3 разделов / мышь и от 6 мышей / группу. Подсчет проводился на двух человек, ослепленный экспериментальных условиях. (B), болезни деятельность контролировалась и забил ежедневно во время лечения и добавка оценка основана на потере веса, ректальное кровотечение, и снижение консистенции стула. * P <0,05 для п = 6 мышей в 2-х независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Макрофаги являются фагоциты, которые играют важную роль в иммунной системе. Они несут ответственность за развязывание врожденного иммунного ответа и направления приобретенного иммунного ответа. Как правило, классически активированные макрофаги активируются IFNγ или LPS и несут ответственность за устранение возбудителей и монтаж воспалительной реакции 1. Наоборот, в качестве альтернативы активированные макрофаги активируются ИЛ-4 и IL-13 и играть важную роль в мусор очистка и реконструкция ткани при разрешении воспаления 1. Специализированные макрофагов в кишечнике сохраняют свою бактерицидную активность, но не устанавливать про-воспалительной реакции 2. Это терпимость к полезным флоры и пищевой антиген позволяет оформления материала, нарушения эпителиального барьера, не вызывая неуместно и потенциально патологического иммунного ответа 3. Aberrant толстой функцию макрофагов может способствоватьпатологических состояний, включая воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженной толстой кишки, рак толстой кишки и 3-5. Макрофагов фенотип зависят от местных микроокружения поэтому определить их роль в здоровье или болезнь может быть сложной задачей. Протокол, описанный здесь, позволяет макрофагов истощение от комплекса в естественных условиях окружающей среды. Кроме того, для изучения роли макрофагов фенотип на месте, фенотипически определенный поляризованных макрофаги могут быть выведены бывшие естественных условиях из костного мозга и аспирационной восприимчиво переданы мышей, с или без предварительного истощения макрофагов.
Клодронат содержащих липосомы способствовать макрофагов «самоубийство» и были использованы для разрушающих макрофагов в различных тканях 6. Макрофаги фагоцитируют клодронат содержащих липосомы, которые затем разлагаются лизосомальных фосфолипаз освобождения клодронат внутрь клетки и вызывающие апоптоз 12 12 месяцев. Липосомы должны быть равномерно распределены в растворе перед загрузкой в шприц и до введения в мыши, независимо от пути введения или ткани-мишени. PBS инъекций и введения PBS содержащих липосомы требуется контролирует, когда истощение макрофагов в естественных условиях с клодронат содержащих липосомы 7. PBS-содержащих липосомы, казалось бы, лучшего контроля, чем PBS инъекции самостоятельно. Тем не менее, важно отметить, что в то время как некоторые сообщения успешно использовали PBS-содержащих липосом в качестве контроля, и мы, и другие, сообщили, что PBS содержащих липосомы могут привести к истощению макрофагов в некоторых экспериментальных условиях 8, 9. Кроме того, липосомы один, как сообщалось, подавлять фагоцитоз временно 10. Макрофагов истощение PBS содержащих липосомы может зависеть от рhagocytic способность и могут различаться в зависимости от штамма мышь, генетический фон, ткани, и / или экспериментальных условиях. Использование ПБС-содержащих липосом в качестве контроля и их влияние на истощение макрофагов в конкретном приложении должны быть определены экспериментально. Поэтому, мы рекомендуем как PBS и PBS содержащих липосомы быть использованы в качестве инъекции контроля во время первых экспериментов.
Критическое рассмотрение в разработке экспериментов макрофагов истощение является способ введения клодронат содержащих липосомы. Мы успешно целевой толстой макрофагов у мышей использование внутрибрюшинного введения 8. Другие использовали внутрибрюшного введения или внутривенных инъекций 9, 11. Интраректальное и внутрибрюшинного введения оба, как сообщается, разрушающих около 50% толстой макрофагов в то время как внутривенные инъекции, как сообщается, разрушают до 90% макрофагов из пластинки8 ргорпа, 9, 11. Мы выбрали для выполнения внутрибрюшинного введения доставить клодронат содержащих липосомы благодаря простоте технологии и исследования, потому что похож на нашего успешно использовали этот путь введения 7. Однако, если более высокий уровень истощения в толстой кишке, необходимых для эксперимента, внутривенного введения может улучшить истощения.
Способ применения является важным фактором для макрофагов истощение в различных тканях. Внутрибрюшинной инъекции были использованы для перитонеального истощать, сальник, parathymic лимфатических узлов, печени, селезенки и макрофагов 12. Внутривенные инъекции были использованы для разрушающих макрофагов в печени, селезенке и костном мозге 12. Внутрижелудочковая администрации клодронат содержащих липосомы были использованы, чтобы исчерпать периваскулярные макрофаги и менингеальные из мозжечка, головного мозга и спинного мозга 12. Внутритрахеальныйи интраназального введения клодронат содержащих липосомы были использованы, чтобы исчерпать альвеолярных макрофагов. Наконец, местная администрация была успешно использована для разрушающих яичек и витреальной макрофагов 12, 13. Эффективность макрофагов истощения в ткани-мишени должны быть определены экспериментально и подтверждены окрашивания тканей иммуногистохимии (рис. 1а) или с помощью проточной цитометрии. В некоторых случаях это может быть необходимо увеличить макрофагов скорость истощения. Переменных, которые могут быть оптимизированы, чтобы увеличить истощения включают изменение маршрута клодронат содержащих липосомы администрации, количество клодронат содержащих липосомы в инъекции, и / или частоты инъекций.
Важным фактором при интерпретации данных, когда истощение макрофагов с клодронат содержащих липосомы, что все профессиональные фагоциты истощаются, в том числе дендритные клетки. Для того, чтобыбиологический эффект макрофагов зависит, дополнительные эксперименты по реконструкции не требуется. Получение макрофагов из костного мозга аспирационной является полезным инструментом для восстановления экспериментов, а также исследование исследование функции макрофагов. Мы успешно использовали этот протокол для лабораторного исследования изучение роли сигнального пути PI3K в альтернативной активации макрофагов 14. Есть два важных шагов в процессе вывода. Первый шаг соблюдение истощение важно, чтобы удалить прилипшие клетки от аспирационной костного мозга, либо загрязнение мезенхимальных клеток и зрелых гемопоэтических клеток. Во-вторых, макрофагов фенотип должны быть подтверждены до их использования в экспериментальных процедур. Модификация этого протокола является то, что различные генетические модели могут быть использованы для вывода макрофагов и восстановления, позволяя исследование роли определенных генов в макрофагов фенотипа и функции в пробиркег в естественных условиях. Для восстановления экспериментов, внутривенная инъекция является самым распространенным способом доставки макрофагов, но и количество клеток и частоты инъекций могут быть оптимизированы для конкретных исследований. Ретро-орбитальный инъекций может быть использован для восстановления и предоставлять аналогичные результаты. Следует отметить, что макрофаги привлекаются к местам воспаления и их фенотип может быть изменен в ответ на сигналы от их микроокружения. Наконец, усыновителей передачи может быть достаточно, чтобы доставить макрофагов в ткани цели, но до истощения житель макрофагов тканей могут быть необходимы, чтобы разрешить создание восприимчиво переданы макрофагов.
Протокол, представленные здесь имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими методами. Альтернативный метод разрушает макрофагов с помощью условных абляции трансгенные мыши, CD11b-DTR 15. В этой мыши, человека токсина дифтерии (DT) рецептор экспрессируется под контролем ое макрофагов конкретных CD11b промоутер. Это дает токсин чувствительность и DT инъекция вызывает истощение макрофагов 15. Несмотря на истощение процент макрофагов больше в этой модели, клодронат содержащих липосомы имеет два важных преимущества. Клодронат содержащих липосомы инъекций может быть использован для разрушающих макрофагами мыши в любом напряжении. Макрофаги могут быть исчерпаны из генетически модифицированных мышей без затраты времени и средств, необходимых для обратного скрещивания, что необходимо использовать CD11b-DTR мыши методом. По той же причине, макрофаги могут быть исчерпаны от мышей на любом фоне, который является важным фактором, если модель исследуемого требует уникального или смешанного происхождения. Кроме того, приемные экспериментов передачи с использованием бывших естественных полученных макрофагов мышей линии позволяет избежать проблем с alloreactivity.
Протоколов, описанных здесь, может быть применена к различным исследованиям вопросов. Мы использовали йесе методы изучения роли макрофагов в воспаление в толстой кишке. Клодронат содержащих липосомы опосредованного разрушения макрофагов и приемных передачи макрофаги могут использоваться для нацеливания на большое количество ткани. Макрофагов приемных передачи могут быть использованы для восстановления обедненного макрофагов или прямой макрофагов к местам воспаления в генетической или индуцибельной моделей воспаления. Этот протокол также предоставляет платформу для изучения макрофагов целевой терапии при болезни моделей, макрофаги и их поляризация связаны с патологией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана "Грант в помощь исследованиям" от Крона и колит Фонд Канады LMS, которые поддерживают Канадская ассоциация гастроэнтерологов / Канадская ассоциация здравоохранения с Исследования / Крона и колит Фонд Канады премии следователь новый.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S.
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
