Summary
الضامة تلعب دورا محوريا في التوازن وعلم الأمراض في العديد من الأنسجة. بروتوكول المقدمة هنا يصف أساليب لاستنزاف الضامة
Abstract
الضامة لاعبين حاسما في استجابة المناعة الفطرية إلى التحدي المعدية أو الإصابة، الشروع في استجابة جهاز المناعة الفطرية وتوجيه استجابة المناعة المكتسب. ويمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي بلعم عدم القدرة على القيام باستجابة مناسبة المناعة، وعلى هذا النحو، قد تورطت في عمليات أمراض كثيرة، من بينها امراض التهابات الامعاء. عرض الظواهر الضامة الاستقطاب التي تنقسم الى فئتين. الضامة تفعيلها كلاسيكي، تفعيلها من خلال التحفيز مع IFNγ أو LPS، تلعب دورا أساسيا في الاستجابة للتحدي البكتيرية في حين الضامة تفعيلها بدلا من ذلك، يمكنهم من IL-4 أو IL-13، والمشاركة في حطام مسح وإعادة عرض الأنسجة وقد تورطت في القرار مرحلة من التهاب. خلال استجابة التهابية في الجسم الحي، وجدت الضامة وسط خليط معقد من التسلل الى الخلايا المناعية وربما المشاركة من قبل مما أدى إلى تفاقم أو resolvinز التهاب. لتحديد دور الضامة في الموقع في نموذج حيواني كامل، من الضروري دراسة تأثير استنزاف الضامة من البيئة المعقدة. لطرح الأسئلة حول دور النمط الظاهري البلاعم في الموقع، ويمكن أن تستمد الضامة الاستقطاب تعريف ظاهريا المجراة سابقا، من aspirates نخاع العظم، وأضاف إلى الفئران، مع أو من دون استنفاد قبل الضامة. في بروتوكول المقدمة هنا clodronate المحتوية على الليبوزومات، مقابل الضوابط PBS حقن، واستخدمت في استنزاف الضامة القولون خلال كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) الناجم عن التهاب القولون في الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، وقد استمدت الضامة الاستقطاب المجراة سابقا وتحويلها إلى الفئران عن طريق الحقن في الوريد. والتحذير من هذا النهج هو أن الليبوزومات clodronate المحتوية على استنزاف جميع البالعات المهنية، بما في ذلك كل الخلايا الجذعية والضامة ذلك لضمان تأثير لوحظ من قبل نضوب هو بلعم محددة، وإعادة تشكيل سالنمط الظاهري و عن طريق التحويل بالتبني الضامة هو ضروري. ويمكن أيضا النظامية نضوب البلاعم في الفئران يمكن تحقيقه من قبل الفئران backcrossing على خلفية CD11b-DTR، وهي طريقة ممتازة متكاملة. ميزة clodronate المحتوية على نضوب الحويصلية بوساطة هو أنه لا يتطلب من الوقت والنفقات المشتركة في الفئران backcrossing ويمكن استخدامه في الفئران بغض النظر عن خلفية من الفئران (C57BL / 6، BALB / ج، أو خلفية مختلطة ).
Protocol
1. أوزون الضامة باستخدام Clodronate المحتوية على الليبوزومات
- يتم تخزين الليبوزومات في درجة مئوية 4 قبل ساعتين من الحقن، وإزالة clodronate المحتوية على الليبوزومات، الليبوزومات PBS المحتوية على، أو برنامج تلفزيوني العقيمة (حقن السيطرة) من الثلاجة للسماح لهم حتى يتأقلم على درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية).
- عكس الأنابيب التي تحتوي على الليبوزومات 8-10 مرات لضمان التوزيع حتى قبل تحميل 200 ميكروليتر إلى حقنة 1 مل. إرفاق إبرة قياس 26 إلى الجزء العلوي من الحقنة.
- استخدام اليد اليسرى، القفا الماوس أسفل الأذنين عقد الجلد بما فيه الكفاية لشل رأسه وأطرافه.
- إمالة الماوس حتى رأسها قليلا نحو الأرض حتى الأعضاء الداخلية الابتعاد عن موقع الحقن، والذي يقع في الربع السفلي الأيمن من البطن.
- لفة الحقنة بين النخيل الخاص وعكس ذلك 6 مرات لتوزيع حل الحويصلية قبل بالتساوي على حقن. <لى> أدخل الإبرة في الجانب الأيمن السفلي من البطن الماوس في زاوية درجة 30-40. تضخ 200 ميكرولتر من حل الحويصلية أو برنامج تلفزيوني.
- خلال نموذج يسببها التهاب، مثل مفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون، وحقن الفئران 4 أيام قبل ظهور التهاب التجريبية لضمان نضوب الضامة المقيمين وكل يوم 2 خلال بروتوكول جديد في استنزاف الضامة التسلل.
- في نهاية التجربة، جنبا إلى جنب مع تحليل التجارب المخطط لها، وإزالة أنسجة من موقع الاهتمام وإصلاح مع امتصاص العرق لتأكيد نضوب بلعم بواسطة تلطيخ المناعى.
2. الاشتقاق الضامة المستقطبة من Aspirates نخاع العظم
- نخاع العظم من فئران بين 8 و 12 أسابيع من العمر يوفر أعلى عائد من الضامة نخاع المستمدة من العظام. الموت ببطء الماوس، وضع على ظهرها، ويعلقون عليها الكفوف، وتمتد أطرافه إلى أقصى حد ممكن.
- العمل في معقم هوود، وإزالة عظام الفخذ وtibias، وقطع بعيدا كما عضلة أكبر قدر ممكن.
- نخاع العظام باستخدام دافق من IMDM مع FCS 10٪ التي تم تحميلها في حقنة 5 مل مزودة إبرة قياس 26.
- تمييع نخاع العظم aspirates إلى 40 مل في IMDM مع FCS 10٪، وخلايا مكان في 75 سم 2 الأنسجة قارورة والثقافة، واحتضان عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعات. هذه الخطوة يزيل خلايا اللحمة المتوسطة ملتصقة أو الضامة ناضجة من الأسلاف المكونة للدم.
- نقل طاف ثقافة تحتوي على غير ملتصقة الأسلاف إلى أنبوب 50 مل الصقر مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة.
- Resuspend خلية بيليه في IMDM 5 مل، FCS 10٪ وتعتمد الخلايا الأنوية عن طريق تمييع تعليق خلية 1 الى 20 في حامض الخليك. هذا الإجراء lyses جميع الخلايا بما في ذلك خلايا الدم الحمراء ويمكن عدها نواة المتبقية على عدادة الكريات.
- Resuspend الخلايا بتركيز قدره 0.5 × 10 6 خلية / مل في المتوسط كاملة؛ IMDM، FCS 10٪، 150 monothioglycerol ميكرومتر (MTG)، و 10 نانوغرام / مل إما MCSF، جنرال موتورز CSF، أو IL-3. يتم تنشيط كلاسيكي MCSF المشتقة من البلاعم الضامة في حين يتم تفعيلها بدلا من ذلك الضامة GM-CSF، أو IL-3-مشتقة.
- استبدال المتوسطة في يوم 4، الغزل بانخفاض غير ملتصقة الخلايا وإعادتها إلى القارورة، وفي يوم 7، وخلايا التخلص غير ملتصقة.
- وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة IFNγ (10 نانوغرام / مل) أو IL-4 (10 نانوغرام / مل) إلى القوارير التي تحتوي على MCSF الخلايا المشتقة في يوم 7 إلى الضامة الانحراف ل. تنشيط كلاسيكي أو النمط الظاهري تفعيلها بدلا من ذلك، على التوالي احتضان خلايا لمدة 3 ايام اخرى.
- في يوم 10، وإزالة وسائل الإعلام ورفع الخلايا الخروج من نسيج الثقافة قارورة باستخدام خلية التفكك العازلة (Gibco-BRL). مكان 5 مل من عازلة على الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية) وبعد ذلك الدوي جانب قارورة مع كعب من راحة يدك عدة مرات بشدة. تأكد من أن الخلايا قد انطلق من القارورة من خلال دراسة قارورة تحتمجهر. معلق الخلايا الماصة في أنبوب 15 مل الصقر مخروطي الشكل وغسل القارورة مع 10 مل إضافية من FBS IMDM 10٪،. تجمع وتدور باستمرار على الخلايا لمدة 5 دقائق في ز × 300.
- عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات وresuspend عند تركيز من الخلايا 7 10 / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة pH7.4. الضامة جاهزة للحقن في الفئران.
- الاحتياطي 1.0 × 10 6 الضامة لتقييم النمط الظاهري البلاعم. الضامة تفعيلها كلاسيكي حفزت لديهم مستويات عالية من سرية lipopolysaccharide أكسيد النيتريك ومستويات IL-12p70 ومنخفضة من IL-10 مقارنة مع الضامة تفعيلها بدلا من ذلك. الضامة تفعيلها بدلا من التعبير عن constitutively YM1 وأرجيناز الأول (ArgI)، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting الغربية.
3. Tranferring الضامة في الفئران
- Resuspend الضامة في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 10 7 خلية / مل. وهذا يسمح لفيtravenous حقن من 10 6 الضامة في وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكروليتر، والذي هو وحدة تخزين التي يمكن بشكل آمن ومريح حقنها في الفئران عن طريق الوريد الذيل.
- الفئران دافئ باستخدام وسادة التدفئة أو اللفة الحرارة ل5-10 دقيقة لتمدد الأوردة الذيل. رصد الماوس في جميع الأوقات لعلامات ارتفاع الحرارة.
- نقل الماوس إلى جهاز الزجرية التي تسمح بالوصول إلى أوردة الذيل.
- تدوير 90 الذيل بحيث الوريد تواجه التصاعدي درجة. الأوردة تشغيل أفقيا أسفل جانبي الذيل، ويمكن استخدامها إما الوريد.
- تنظيف موقع الحقن مع مسحة الكحول وحقن ببطء 100 ميكروليتر (10 6 الضامة) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26 أو 28. أدخل الإبرة مع الجانب شطبة مواجهة وبزاوية ضئيلة، مواز تقريبا إلى الوريد.
- وإذا تم إدراج إبرة صحيح أن يشعر أي مقاومة وعلى المنوال ينبغي أن تصبح واضحة بعد الحقن. إذا كانت الإبرة ليست فيوريد، سوف الذيل انتفاخ. إذا حدث هذا، إزالة إبرة وحاول مرة أخرى الأقرب إلى المحاولة الأخيرة أو في الوريد الأخرى. يجب استخدام إبرة جديدة لكل حقن مثل ذيل صعبة والإبر تصبح مملة بسرعة خلال حقن الوريد الذيل.
- بعد الحقن، وإزالة الإبرة، وتطبيق ضغط لطيف في موقع الحقن حتى يتوقف النزيف، ورصد الماوس ل5min إضافية للتأكد من أن النزيف قد توقف.
- تكرار الحقن بلعم كل 4 أيام لضمان ولادة مستمرة من الاستقطاب الضامة أثناء إجراء التجارب.
- في نهاية التجربة، جنبا إلى جنب مع تحليل تجريبي، وإزالة أنسجة من موقع الاهتمام وإصلاح مع امتصاص العرق أو الفورمالين للتأكد من التنفيذ الفعال لالضامة الاستقطاب من قبل تلطيخ المناعى.
4. ممثل النتائج
عدد والنمط الظاهري من macrop المقيمينhages في أي نسيج معين يعتمد على الأنسجة يجري بحثها، وسوف تتغير خلال عدوى أو التهاب. وبالمثل، فإن قدرة clodronate المحتوية على الليبوزومات في استنزاف الضامة من الأنسجة تعتمد على مسار الادارة والتنفيذ الفعال للنسيج المستهدف. حقن داخل الصفاق من النتائج الليبوزومات clodronate المحتوية في انخفاض في F4/80 + الضامة في القولون الماوس خلال مفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون واضح من قبل تلطيخ المناعى للعلامة بلعم، F4/80 (الشكل 1A). ويمكن أيضا تلطيخ النسيجية يمكن استخدامها لتحديد كمية الاختلافات في عدد بلعم والنمط الظاهري في المقاطع النسيجية. 1B الشكل يدل على أن يتم استنفاد ما معدله 55٪ من الضامة بواسطة clodronate المحتوية على الليبوزومات مقارنة مع عدم الكشف عن نضوب في نقطتين الماوس عند حقن الفئران مع برنامج تلفزيوني وحدها كعنصر تحكم الحقن. يتم تحديد قيمة كل من عد F4/80 وصمة عار ArgIخلايا إد إيجابي في المقاطع النسيجية المسلسل في الفترة من 6 الفئران في 3 نقاط، في 3 أقسام لكل فأر يجري تنفيذها مع العد من قبل اثنين من أفراد أعمى إلى حالة تجريبية. هذه النتائج تبين أن حقن داخل الصفاق من الليبوزومات clodronate نضوب الضامة القولون في الفئران.
اشتقاق الضامة من نخاع العظم في وجود الضامة نمو مختلف المحاصيل العوامل التي يتم تفعيلها كلاسيكي (MCSF المشتقة أو مشتقة MCSF وتعامل مع IFNγ) أو يمكنهم بدلا من ذلك (GM-CSF أو IL-3 المشتق أو MCSF المستمدة من و تعامل مع IL-4). فلاشينغ نخاع العظم في الفترة من 2 عظام الفخذ وtibias 2 من الماوس قديمة 8 أسابيع وعادة ما ينتج 6 × 10 7 خلايا الأنوية في الماوس وغلة 8 × 10 6 MCSF المشتقة الضامة، 10 × 10 6 GM-CSF المشتقة الضامة، أو 12 × 10 6 IL-3-المشتقة الضامة. 2A يوضح الشكل النتريت ونسبة IL-12p70/IL-10 في بلعم سوبernatants تعامل مع lipopolysaccharide لمدة 24 ساعة 2B ويبين الشكل نموذجي تحليل لطخة غربية من 0.5 × 10 6 الضامة من MCSF + / -. IL-4 شروط الاشتقاق وبحث مع الأجسام المضادة لعلامات بلعم تفعيلها بدلا من ذلك، ArgI، YM1، أو مع GAPDH باعتباره تحميل السيطرة. وتبين هذه البيانات التي يمكن أن تنحرف نخاع العظام المستمدة الضامة إلى النمط الظاهري المستقطب خلال الاشتقاق.
النقل الفعال للالسابقين الضامة فيفو الاستقطاب المستمدة من الأنسجة تعتمد على طريقة التعاطي والوصول إلى الأنسجة. خلال مفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون، الضامة حقن في الوريد السفر إلى موقع الالتهاب والضامة تفعيلها بدلا من الحد من شدة المرض. 3A الشكل يبين العدد الإجمالي للالضامة وعدد الضامة ArgI + (تفعيلها بدلا من ذلك) تحسب في المقاطع النسيجية من حقن الفئران مع الاستقطاب نخاع العظامالمشتقة من البلاعم. ويظهر أثر نقل الضامة الاستقطاب إلى القولون خلال مفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون بواسطة مؤشر نشاط المرض، وعلى درجة المضافة استنادا إلى فقدان الوزن، ونزف مستقيمي، وانخفاض كثافة البراز (الشكل 3B). هذه النتائج تثبت أن المجراة سابقا مستمد، الضامة نقل adoptively يمكن أن حركة المرور إلى التهاب القولون والتأثير الناجم. الضامة M1 لا يؤثر التهاب في حين الضامة M2 تقلل إلى حد كبير مرض مؤشر النشاط.
الشكل 1. Clodronate المحتوية على الليبوزومات تستنزف على نحو فعال F4/80 + و + F480 ArgI + الخلايا في نقطتين الماوس في الجسم الحي. منحت جيل F2 نوع من الفئران البرية على C57BL مختلط / 6 × خلفية 129Sv مفاجآت صيف دبي بنسبة 5٪ لمدة 7 أيام والملكية الفكرية المحقونة مع برنامج تلفزيوني (مراقبة) أو clodronate المحتوية على الليبوزومات (Clodronate) 4 أيام قبل العلاج مفاجآت صيف دبيوعلى أيام 0، 2، 4، و 6 مفاجآت صيف دبي خلال فترة العلاج. (أ) أزيلت الكولونات، ثابتة، وكانت ملطخة المقاطع من قبل المناعية للالضامة ناضجة (F4/80) وعلامة بالعات M2، ArgI. (ب) تحديد الكميات من F4/80 + و + ArgI الضامة. احصي الخلايا الملون بإيجابية من قبل اثنين من أفراد أعمى إلى حالة تجريبية في تكبير × 40 في 6 مجالات من 3 أقسام / الفأر والفئران في الفترة من 6 / مجموعة. * P <0.01.
الشكل 2. MCSF المشتقة من البلاعم تعبر عن النمط الظاهري تنشيط كلاسيكي وMCSF المشتقة الضامة تعامل مع IL-4 التعبير عن النمط الظاهري بلعم تفعيلها بدلا من ذلك. (A) وتمشيا مع النمط الظاهري تنشيط كلاسيكي، MCSF المشتقة من البلاعم إنتاج مستويات أعلى من أكسيد النيتريك ردا على lipopolysaccharide ويمكن قياسها من خلال فحص Griess، الذي يكتشف مستقلبه المصب، والنتريت. هم المرضس تنتج أعلى نسبة IL-12p70/IL-10، والتي يمكن قياسها بواسطة ELISA. * P <0.01 ل n = 3. (ب) وتمشيا مع النمط الظاهري تفعيلها بدلا من ذلك، MCSF المشتقة الضامة تعامل مع IL-4 YM1 صريحة constitutively وArgI، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting الغربية. البيانات هي ممثل من 3 تجارب مستقلة مع نتائج مماثلة.
الشكل 3. حقن في الوريد، خارج الحي المستمدة من تفعيل الضامة وبدلا من المرور الى القولون والحد من التهاب في الامعاء. منحت جيل F2 نوع من الفئران البرية على C57BL مختلط / 6 × 129Sv خلفية مفاجآت صيف دبي 5٪ في مياه الشرب لمدة ستة أيام. تم حقن الضامة M1 و M2 الرابع في أيام 0 و 4 خلال فترة العلاج مفاجآت صيف دبي. (أ) أزيلت الكولونات، ثابتة، وكانت ملطخة المقاطع من قبل المناعية للالضامة ناضجة (F4/80)، وعلامة بالعات M2 (ArgI).تحديد الكميات من الضامة للفئران PBS مراقبة حقن (C)، وأجريت حقن الفئران مع الضامة M1 (+ M1) وحقن الفئران مع الضامة M2 (+ M2) عن طريق عد الخلايا الملون بشكل إيجابي على التكبير × 40 في 6 مجالات من 3 أقسام / الماوس والفئران في الفترة من 6 / مجموعة. تم إجراء عملية فرز من قبل اثنين من أفراد أعمى إلى حالة تجريبية. (ب) تم رصد نشاط المرض وسجل يوميا خلال فترة العلاج، وهو على درجة المضافة استنادا إلى فقدان الوزن، ونزف مستقيمي، وانخفاض كثافة البراز. * P <0.05 ل n = 6 الفئران في 2 تجارب مستقلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الضامة هي الخلايا البلعمية أن تلعب دورا هاما في الجهاز المناعي. فهي مسؤولة عن الشروع في استجابة جهاز المناعة الفطرية وتوجيه استجابة المناعة المكتسب. عادة، يتم تنشيط الضامة تفعيلها كلاسيكي بواسطة IFNγ أو LPS، وهي المسؤولة عن القضاء على مسببات الأمراض وتصاعد استجابة التهابية 1. وفي المقابل، يتم تنشيط الضامة تفعيلها بدلا من ذلك بواسطة IL-4 أو IL 13 وتلعب دورا في الحطام مسح وإعادة تشكيل النسيج خلال قرار من التهاب 1. الضامة المتخصصة في القناة الهضمية الاحتفاظ نشاطهم للجراثيم ولكن لا لشن 2 استجابة الموالية للالتهابات. هذا التسامح إلى النباتات المفيدة والمستضد الغذاء يسمح لإزالة المواد التي تنتهك حاجز الظهارية دون الشروع في استجابة غير مناسبة ومرضية محتملة المناعي 3. يمكن الشاذة وظيفة بالعات القولون المساهمةإلى الحالات المرضية بما فيها امراض التهابات الامعاء، أعراض القولون العصبي، وسرطان القولون والمستقيم 3-5. النمط الظاهري بلعم يعتمد على المكروية المحلية حتى تحديد دورها في الصحة أو المرض يمكن أن يكون تحديا. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للنضوب بلعم من المجمع في بيئة الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، إلى دراسة دور النمط الظاهري البلاعم في الموقع، ويمكن أن تستمد الضامة الاستقطاب تعريف ظاهريا المجراة سابقا من aspirates نخاع العظم ونقل adoptively على الفئران، مع أو من دون استنفاد قبل الضامة.
Clodronate المحتوية على الليبوزومات تعزيز بلعم "الانتحاريين" واستخدمت في استنزاف الضامة في مجموعة متنوعة من الأنسجة 6. الضامة يبلعم clodronate المحتوية على الليبوزومات، والتي هي المتدهورة في وقت لاحق من قبل phospholipases الليزوزومية الافراج عن clodronate في الخلايا والخلايا المحفزة 12 12 شهرا. يجب الليبوزومات موزعة بالتساوي في حل قبل التحميل في المحاقن وقبل الحقن في الفأر، بغض النظر عن طريقة التعاطي أو النسيج المستهدف. PBS الحقن والحقن التي تحتوي على برنامج تلفزيوني الليبوزومات مطلوبة عندما تسيطر أوزون الضامة في الجسم الحي مع clodronate المحتوية على الليبوزومات 7. وPBS المحتوية على الليبوزومات يبدو أن هناك رقابة أفضل من الحقن في برنامج تلفزيوني وحدها. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أنه في حين أن بعض التقارير التي استخدمت بنجاح في برنامج تلفزيوني المحتوية على الليبوزومات كعنصر تحكم، ونحن، وغيرها، وذكرت أن برنامج تلفزيوني المحتوية على الليبوزومات يمكن أن تستنفد الضامة في بعض الظروف التجريبية 8 و 9. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن الليبوزومات وحدها لمنع البلعمة مؤقتا 10. قد نضوب البلاعم التي تحتوي على برنامج تلفزيوني الليبوزومات تعتمد على عالقدرة hagocytic و قد تختلف وفقا لسلالة الفأر، الخلفية الوراثية، والنسيج، و / أو حالة تجريبية. استخدام برنامج تلفزيوني المحتوية على الليبوزومات كعنصر تحكم وأثرها على استنزاف البلاعم في تطبيق معين يحتاج إلى تحديد تجريبيا. ولذلك، فإننا نوصي بأن تستخدم على حد سواء في برنامج تلفزيوني في برنامج تلفزيوني والتي تحتوي على عناصر تحكم حقن الليبوزومات خلال التجارب الأولية.
وهناك اعتبار حاسم في تصميم التجارب نضوب بلعم هو الطريق لإقامة clodronate المحتوية على الليبوزومات. واستهدفت نجحنا الضامة القولون في الفئران باستخدام الحقن داخل الصفاق 8. لقد استخدمت إدارة intrarectal الآخرين أو الحقن في الوريد 9 و 11. وعلى حد سواء تم داخل الصفاق إدارة Intrarectal وذكرت أن تستنزف ما يقرب من 50٪ من الضامة القولون في حين تم الإبلاغ عن الحقن في الوريد إلى استنزاف ما يصل الى 90٪ من الضامة من الصفيحةالمخصوصة 8، 9، 11. اخترنا لتنفيذ عمليات الحقن داخل الصفاق لتقديم clodronate المحتوية على الليبوزومات بسبب بساطة هذه التقنية، ولأن دراسات مماثلة لبلدنا قد استخدمت بنجاح هذه طريقة التعاطي 7. ومع ذلك، إذا كانت مطلوبة مستويات أعلى من نضوب في القولون للتجربة، قد الحقن في الوريد تحسين نضوب.
طريقة التعاطي اعتبار مهم للنضوب البلاعم في الأنسجة المختلفة. وقد استخدمت الحقن داخل الصفاق في استنزاف البريتوني، الثرب، parathymic العقدة الليمفاوية والكبد والطحال والضامة 12. وقد استخدمت الحقن في الوريد إلى نضوب الضامة في الكبد والطحال، ونخاع العظام 12. وقد استخدمت إدارة داخل البطينات من الليبوزومات-clodronate تحتوي على استنزاف الضامة حول الأوعية وسحائي من المخيخ، المخ، والحبل الشوكي 12. داخل الرغامىواستخدمت ادارة الأنف من clodronate المحتوية على الليبوزومات في استنزاف الضامة السنخية. أخيرا، تم الإدارة المحلية استخدمت بنجاح في استنزاف الضامة الخصية والزجاجية 12 و 13. يجب تحديد مدى فعالية نضوب البلاعم في النسيج المستهدف تجريبيا والتصديق عليها من قبل تلطيخ الأنسجة المناعية (الشكل 1A) أو عن طريق التدفق الخلوي. في بعض الحالات قد يكون من الضروري زيادة معدل نضوب البلاعم. المتغيرات التي يمكن أن يكون الأمثل لزيادة استنزاف تشمل تغيير مسار clodronate المحتوية على إدارة الحويصلية، ومقدار clodronate المحتوية على الليبوزومات في حقن، و / أو تكرار الحقن.
وهو عامل مهم في تفسير البيانات عندما تستنفد الضامة مع clodronate المحتوية على الليبوزومات هو أن يتم استنفاد جميع البالعات المهنية، بما في ذلك الخلايا الجذعية. لضمان أنوالبلاعم التي تعتمد على التأثير البيولوجي، والتجارب إعادة التكميلية المطلوبة. اشتقاق الضامة من aspirates نخاع العظم هو أداة مفيدة لتجارب إعادة فضلا عن وظيفة البحث بلعم التحقيق. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لفي الدراسات المختبرية استكشاف دور الممر PI3K يشير في تفعيل البديل الضامة 14. هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في عملية الاشتقاق. أولا، التمسك نضوب خطوة حاسمة لازالة الخلايا الملتصقة من aspirates نخاع العظم، وتلويث إما خلايا اللحمة المتوسطة أو الخلايا المكونة للدم ناضجة. ثانيا، ينبغي تأكيد النمط الظاهري بلعم قبل استخدامها في إجراءات تجريبية. وهناك تعديل على هذا البروتوكول هو أنه يمكن استخدام نماذج جينية مختلفة عن اشتقاق بلعم وإعادة تشكيل، والسماح بالتحقيق في دور للجينات محددة في النمط الظاهري بلعم وظيفة في المختبر 1د في الجسم الحي. لتجارب إعادة تشكيل، الحقن في الوريد هو الوضع الأكثر شيوعا لتسليم بلعم لكن يمكن تحسين كل من كمية الخلايا وتواتر الحقن لإجراء دراسة محددة. ويمكن استخدام الرجعية المدارية حقن لإعادة تشكيل وينبغي أن تقدم نتائج مماثلة. من المذكرة، يتم تجنيد الضامة إلى مواضع الالتهابات ويمكن تغيير النمط الظاهري في الاستجابة لإشارات من المكروية بهم. وأخيرا، قد نقل بالتبني تكون كافية لتقديم الضامة إلى النسيج المستهدف ولكن نضوب قبل الأنسجة الضامة المقيمين قد تكون ضرورية للسماح بإنشاء الضامة نقل adoptively.
بروتوكول المقدمة هنا لديها عدد من المزايا على الطرق الحالية. طريقة بديلة لاستنزاف الضامة غير مشروط باستخدام الماوس المعدلة وراثيا الاجتثاث، CD11b DTR-15. في هذه الماوس، ويعبر عن ذيفان الخناق الإنسان (DT) مستقبلات تحت المراقبة سو المروج CD11b بلعم محددة. هذا يضفي حساسية وحقن توكسين DT يسبب نضوب بلعم 15. على الرغم من أن نضوب بلعم نسبة أكبر في هذا النموذج، clodronate المحتوية على الليبوزومات عروض اثنين من المزايا الهامة. ويمكن استخدام Clodronate التي تحتوي على حقن الحويصلية في استنزاف الضامة في أي سلالة الماوس. ويمكن المنضب الضامة من الفئران المعدلة وراثيا دون الوقت والتكلفة اللازمة لbackcrossing ما هو مطلوب لاستخدام أسلوب الماوس CD11b-DTR. لنفس السبب، لا يمكن أن تنضب الضامة من الفئران على أي خلفية، وهو اعتبار مهم اذا كان النموذج يجري التحقيق يتطلب خلفية فريدة من نوعها أو مختلطة. وبالمثل، فإن التجارب السابقة باستخدام نقل بالتبني الضامة فيفو المستمدة من خط الماوس تتجنب أي مشاكل مع alloreactivity.
ويمكن تطبيق البروتوكولات وصفها هنا لمجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية. وقد استخدمنا التقنيات جنوب شرقي لدراسة دور الضامة في التهاب في القولون. ويمكن استخدام Clodronate المحتوية على الحويصلية بوساطة نضوب بلعم ونقل بالتبني من الضامة لاستهداف عدد كبير من الأنسجة. ويمكن استخدام نقل بلعم بالتبني إلى الضامة إعادة المنضب أو الضامة مباشرة إلى المواقع من التهاب في النماذج الوراثية أو محرض للالتهاب. هذا البروتوكول ايضا منبرا لدراسة بلعم العلاجات المستهدفة في نماذج الأمراض والتي ترتبط الضامة أو الاستقطاب مع علم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل 'غرانت في المعونة للبحوث' من كرون والتهاب القولون مؤسسة من كندا إلى LMS، الذي تدعمه الجمعية الكندية لأمراض الجهاز الهضمي / الجمعية الكندية لأبحاث الصحة / كرون والتهاب القولون مؤسسة جائزة كندا محقق جديد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
