Summary
מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה מקרופאגים
Abstract
מקרופאגים הם שחקנים קריטיים בתגובה החיסון המולדת לאתגר פגיעה זיהומית או, שיזם את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. מקרופאג תפקוד יכול להוביל לחוסר יכולת לעלות תגובה חיסונית מתאימה, וככזה, היה מעורב בתהליכים מחלות רבות, כולל מחלות מעי דלקתיות. מקרופאגים להציג פנוטיפים מקוטב כי המחולקים באופן כללי לשני סוגים. מקרופאגים מופעל קלאסי, מופעל על ידי גירוי עם IFNγ או LPS, לשחק תפקיד חיוני בתגובה לאתגר חיידקי בעוד מקרופאגים מופעל לחילופין, מופעלים על ידי IL-4 או IL-13, להשתתף פסולת הדחה שיפוץ רקמות היו מעורבים בהחלטה השלב של דלקת. במהלך התגובה הדלקתית in vivo, מקרופאגים נמצאים בתוך תערובת מורכבת של חדירת תאים חיסוניים ועשוי להשתתף ידי העצמת או resolvinגרם לדלקת. כדי להגדיר את התפקיד של מקרופאגים באתרו במודל חיה שלמה, יש צורך לבחון את ההשפעה של ומכלה מקרופאגים מהסביבה מורכב. לשאול שאלות על תפקידו של הפנוטיפ מקרופאג באתרו, מקרופאגים מקוטב מוגדרים phenotypically ניתן לגזור vivo לשעבר, החל aspirates מח עצם והוסיף בחזרה עכברים, עם או בלי דלדול מראש של מקרופאגים. בפרוטוקול שהוצג clodronate המכיל ליפוזומים, לעומת שולטת PBS מוזרק, שימשו כדי לרוקן מקרופאגים הגס במהלך נתרן גופרתי dextran (DSS) הנגרמת קוליטיס בעכברים. בנוסף, מקרופאגים מקוטב נגזרו vivo לשעבר והועבר עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית. הערת אזהרה על גישה זו היא כי clodronate המכיל ליפוזומים לרוקן את כל phagocytes מקצועיים, כולל שני תאים דנדריטים ומקרופגים כך כדי להבטיח את האפקט שנצפה על ידי דלדול הוא מקרופאג ספציפי, הכינון מחדש Oפנוטיפ F על ידי העברת המאמצת של מקרופאגים הכרחי. דלדול מקרופאג מערכתית בעכברים יכול גם להיות מושגת על ידי עכברים backcrossing על רקע CD11b-DTR, שהיא גישה משלימה מצוינת. היתרון של clodronate המכיל דלדול liposome בתיווך הוא שהיא אינה דורשת את הזמן ואת חשבון מעורב עכברים backcrossing והוא ניתן להשתמש בעכברים ללא קשר לרקע של העכברים (C57BL / 6, BALB / c, או רקע מעורב ).
Protocol
1. המקרופאגים באוזון באמצעות Clodronate המכיל ליפוזומים
- ליפוזומים מאוחסנים 4 ° C. שעתיים לפני ההזרקה, הסר clodronate המכיל ליפוזומים, PBS המכיל ליפוזומים או סטרילית PBS (בקרת הזרקה) מהמקרר כדי לאפשר להם להסתגל לטמפרטורת החדר (18 מעלות צלזיוס).
- להפוך את צינורות המכילים ליפוזומים 8-10 פעמים כדי להבטיח חלוקה עוד לפני טעינת 200 μl לתוך מזרק 1 מ"ל. צרף מחט מד 26 לחלק העליון של המזרק.
- שימוש, בעורפו ביד שמאל את העכבר ממש מתחת לאוזניים המחזיקים העור מספיק כדי לשתק את הראש והגפיים.
- להטות את העכבר כדי ראשו מעט כלפי מטה, כך האיברים הפנימיים להתרחק הזריקה, הנמצא ברביע הימני התחתון של הבטן.
- מרדדים את המזרק בין כפות הידיים שלך להפוך את זה 6 פעמים כדי לפזר את הפתרון liposome לפני באופן שווה כדי הזריקה. <li> להכניס את המחט בצד הימני התחתון של הבטן העכבר בזווית של 30-40 מעלות. להזריק 200 μl של פתרון liposome או PBS.
- במהלך המודל דלקת הנגרמת, כמו קוליטיס DSS-Induced, עכברים להזריק 4 ימים לפני הופעת הדלקת ניסיוני על מנת להבטיח צמצום של מקרופאגים תושבים וכל 2 ימים במהלך פרוטוקול לכלות מקרופאגים שחדרו חדשים.
- בסוף הניסוי, יחד עם ניתוחים ניסיוניים המתוכננות, להסיר רקמות מהאתר של עניין ולתקן עם paraformaldehyde לאשר דלדול מקרופאג ידי immunohistochemical מכתים.
2. הגזירה של מקרופאגים מקוטב aspirates מוח עצמות
- מח העצם מעכברים בין 8 ל 12 שבועות של גיל מספק את התשואה הגבוהה ביותר של מוח עצם שמקורם מקרופאגים. להרדים את העכבר, ולהניח אותה על הגב שלה, להצמיד את רגליו, מותח את איבריו ככל האפשר.
- עבודה סטרילית הוד, להסיר עצמות הירך ושל tibias, חיתוך משם השריר עד כמה שניתן.
- מח פלאש מהעצמות באמצעות IMDM עם FCS 10% נטען לתוך מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 26 מד.
- לדלל מח עצם aspirates ל 40 מ"ל ב IMDM עם FCS 10%, תאים במקום ב 75 2 בקבוק ס"מ רקמות תרבות, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות. צעד זה מסיר תאים mesenchymal חסיד או מאקרופאגים בוגרים מכל אבות היווצרות הדם.
- תרבות העברת supernatant המכיל שאינו חסיד אבות על צינור 50 מ"ל פלקון חרוטי ו צנטריפוגות במשך 5 דקות על סל"ד 1200.
- Resuspend תא גלולה של 5 מ"ל IMDM, FCS 10% ו לספור תאים גרעיני על ידי דילול ההשעיה תא 1 ב 20 בחומצה אצטית. הליך זה lyses כל התאים, כולל כדוריות דם אדומות וכן גרעינים הנותרים ניתן לסמוך על hemocytometer.
- תאים Resuspend בריכוז של 0.5 × 10 6 תאים / מ"ל במדיום מלאה; IMDM, FCS 10%, 150 מיקרומטר monothioglycerol (MTG), ו - 10 ננוגרם / מ"ל או MCSF, GM-CSF, או IL-3. MCSF הנגזרות מקרופאגים מופעלים קלאסי מקרופאגים בעוד מקרופאגים GM-CSF או IL-3-הנגזרות מופעלים לסירוגין.
- החלף בינוני ביום 4, מסתובב כלפי מטה לא חסיד התאים ומחזיר אותם בבקבוק, ואת יום ב 7, משליכים לא חסיד תאים.
- בנוסף, IFNγ (10 ng / ml) או IL-4 (10 ng / ml) ניתן להוסיף שהכילו MCSF הנגזרות תאים ביום 7 כדי ליצור הטיה המקרופאגים כדי להפעיל קלאסי או הפנוטיפ מופעל לחילופין, בהתאמה. דגירה התאים למשך 3 ימים נוספים.
- ביום 10, להסיר תאים התקשורת ולהרים את הבקבוק של רקמת התרבות באמצעות סלולרי דיסוציאציה חוצץ (Gibco-BRL). מקום 5 מ"ל של המאגר על תאים של 5 דקות בטמפרטורת החדר (18 מעלות) ואז לדפוק את הצד של הבקבוק עם העקב של כף היד מספר פעמים בחוזקה. ודא כי התאים לא המריא של הבקבוק על ידי בחינת הבקבוק תחתמיקרוסקופ. Pipet resuspended התאים לתוך שפופרת 15 מ"ל פלקון חרוטי ולשטוף את הבקבוק עם 10 מ"ל נוספים של IMDM, 10% FBS. בריכת ומסובב את התאים דקות ב 300 × 5 גרם.
- ספירת תאים קיימא באמצעות hemocytometer ו resuspend בריכוז של 10 -7 תאים / מ"ל PBS סטרילית pH7.4. מקרופאגים מוכנים להזרקה לעכברים.
- שמורת 1.0 × 10 6 מקרופאגים להערכת פנוטיפ מקרופגים. מקרופאגים מופעל קלאסי מגורה עם מפרישים רמות גבוהות של lipopolysaccharide תחמוצת החנקן ורמות IL-12p70 נמוך של IL-10 לעומת מקרופאגים המופעלים לסירוגין. מקרופאגים מופעל לחילופין constitutively להביע YM1 ו arginase אני (ArgI), אשר ניתן לאתרם באמצעות Western immunoblotting.
3. Tranferring המקרופאגים לעכברים
- מקרופאגים Resuspend ב PBS סטרילית בריכוז של 10 7 תאים למ"ל. זה מאפשר בהזרקת travenous של 10 6 מקרופאגים בנפח כולל של 100 μl, שהוא נפח כי ניתן להזריק באופן שליו ובטוח לעכברים ידי וריד הזנב.
- עכברים חמים באמצעות כרית חימום או הברכיים חום למשך 5-10 דקות כדי להרחיב את הווריד הזנב. לפקח על העכבר בכל עת סימנים של היפרתרמיה.
- העברת העכבר על המכשיר הרחקה המאפשר גישה הוורידים הזנב.
- סובב את הזנב 90 ° כך הווריד פונה כלפי מעלה. ורידים רוחבית להפעיל את שני צידי הזנב ו או וריד ניתן להשתמש.
- לנקות את ההזרקה עם ספוגית אלכוהול לאט להזריק 100 μl (10 6 מקרופאגים) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 או 28 מד. הכנס את המחט עם הצד שיפוע כלפי מעלה בזווית קלה, כמעט במקביל הוריד.
- אם המחט מוחדרת כראוי התנגדות צריך להיות לבד ברוח צריך להיות ברור לאחר ההזרקה. אם המחט אינהוריד, הזנב יהיה הבליטה. אם זה יקרה, להוציא את המחט ולנסות שוב הפרוקסימלי לניסיון האחרון או ברוח אחרת. מחט חדשה יש להשתמש עבור כל הזרקה כמו הזנב הוא קשוח המחטים להיות משעמם במהירות במהלך ההזרקה לווריד הזנב.
- בעקבות הזריקה, להוציא את המחט, להפעיל לחץ עדין על הזריקה עד שהדימום ייפסק, ולנטר את העכבר על 5min נוסף על מנת להבטיח כי הדימום הפסיק.
- חזור על זריקות מקרופאג כל 4 ימים על מנת להבטיח אספקה רציפה של מקרופאגים מקוטב במהלך ההליך הניסויי.
- בסוף הניסוי, יחד עם ניתוחים ניסיוניים, להסיר רקמות מהאתר של עניין ולתקן עם paraformaldehyde או פורמלין כדי לאשר משלוח יעיל של מקרופאגים מקוטב על ידי immunohistochemical מכתים.
4. נציג תוצאות
מספר הפנוטיפ של macrop תושבhages ברקמות נתון תלוי הרקמה נבחנות ו ישתנה בזמן זיהום או דלקת. כמו כן, היכולת של clodronate המכיל ליפוזומים לכלות מקרופאגים מרקמות יהיה תלוי במסלול של ניהול ואספקה יעילה לרקמת המטרה. הזרקת Intraperitoneal של clodronate המכילים תוצאות ליפוזומים לירידה F4/80 + מקרופאגים במעי הגס העכבר במהלך קוליטיס DSS-Induced ניכר ידי מכתים immunohistochemical לסמן מקרופאג, F4/80 (איור 1 א). צביעה היסטולוגית יכול לשמש גם כדי לקבוע הבדלים כמותיים במספר מקרופאג ו פנוטיפ בסעיפים רקמות. איור 1 ב מראה כי בממוצע 55% של מקרופאגים תיגמר ידי clodronate המכיל ליפוזומים לעומת דלדול לא זוהה נקודתיים העכבר כאשר העכברים מוזרקים עם PBS לבד כמו בקרת זריקה. כל ערך נקבע על פי ספירת F4/80 ו ArgI כתםאד תאים חיוביים בסעיפים רקמות סדרתי של 6 עכברים ב 3 נקודות, ב 3 חלקים לכל עכבר עם ספירת המבוצעת על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב הניסוי. תוצאות אלו מראות כי זריקות intraperitoneal של ליפוזומים clodronate לרוקן מקרופאגים הגס בעכברים.
גזירת מקרופאגים ממח העצם בנוכחות גורמי גדילה שונים מקרופאגים תשואות המופעלים קלאסי (MCSF הנגזרות או MCSF הנגזרות ומטופל עם IFNγ) או לחלופין להפעיל (GM-CSF או IL-3-derived או MCSF הנגזרות ו מטופלים עם IL-4). שטיפה מח עצם מ -2 עצמות הירך ו -2 tibias של העכבר בן 8 שבועות בדרך כלל מניבה 6 × 10 7 התאים בעלי הגרעין לכל עכבר ותשואות 8 × 10 6 MCSF הנגזרות מקרופאגים, 10 × 10 6 GM-CSF הנגזרות מקרופאגים, או 12 × 10 6 IL-3-הנגזרות מקרופאגים. איור 2 א מראה הניטריט ויחס IL-12p70/IL-10 ב מקרופאג לסעודernatants שטופלו lipopolysaccharide במשך 24 שעות 2B איור מראה אופייני ניתוח כתם המערבי של 0.5 × 10 6 מקרופאגים MCSF + / -. IL-4 תנאי הגזירה נחקר עם נוגדנים סמנים מקרופאג מופעל לחילופין, ArgI, YM1, או עם GAPDH כמו טעינה מלאה. נתונים אלה מראים כי מוח עצם שמקורם מקרופאגים יכול להיות מוטה על הפנוטיפ מקוטב במהלך הגזירה.
העברה יעילה של מקרופאגים לשעבר ב vivo מקוטב הנגזרות לרקמות תלוי במסלול של ניהול גישה רקמות. במהלך קוליטיס DSS-Induced, מקרופאגים מוזרק לווריד לנסוע לאתר של דלקת מקרופאגים מופעל לחילופין להפחית את חומרת המחלה. 3A באיור ניתן לראות את המספר הכולל של מקרופאגים ומספר מקרופאגים ArgI + (מופעל לחילופין) שנמנו בסעיפים היסטולוגית של עכברים שהוזרק עם מקוטב מח עצםהנגזרות מקרופאגים. ההשפעה של העברת מקרופאגים מקוטב אל המעי הגס במהלך קוליטיס DSS-Induced מוצג במדד פעילות המחלה, ציון תוסף על בסיס ירידה במשקל, דימום רקטלי, ועקביות שרפרף קטן (איור 3 ב). תוצאות אלו מראות כי vivo לשעבר נגזרים, מקרופאגים שהועברו adoptively תנועה המעי הגס ודלקת הפגיעה הנגרמת יכול. מקרופאגים M1 לא להשפיע על דלקת ואילו מקרופאגים מסוג M2 להפחית באופן משמעותי את פעילות המחלה ראשי.
באיור 1. Clodronate המכיל ליפוזומים ביעילות לרוקן F4/80 + ו-F480 + + ArgI התאים נקודתיים עכבר in vivo. בדור F2 של עכברים מסוג בר על C57BL מעורבת / 6 × רקע 129Sv קיבלו DSS 5% למשך 7 ימים ו-IP הזריקו PBS (בקרה) או clodronate המכיל ליפוזומים (Clodronate) 4 ימים לפני הטיפול DSSעל 0 ימים, 2, 4, ו -6 במהלך הטיפול DSS. (א) נקודתיים הוסרו קבועה, וחתכים הוכתמו על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור מקרופאגים בוגרים (F4/80) וכן את הסמן מקרופאג M2, ArgI. (ב) לכמת את F4/80 + ו + ArgI מקרופאגים. תאים מוכתמים חיובי נספרו על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב ניסיוני בהגדלה 40 × 6 שדות ב 3 חלקים / עכבר ומ 6 עכברים / קבוצה. * P <0.01.
איור 2. MCSF הנגזרות מקרופאגים להביע פנוטיפ מופעל קלאסי ו MCSF הנגזרות מקרופאגים שטופלו IL-4 להביע את הפנוטיפ מקרופאג מופעל לחילופין. (א) בהתאם פנוטיפ מופעל קלאסי, MCSF הנגזרות מקרופאגים לייצר רמות גבוהות של תחמוצת החנקן בתגובה lipopolysaccharide והוא יכול להימדד על ידי assay Griess, אשר מזהה המטבוליט במורד הזרם שלו, הניטריט. הם ALSהו לייצר יחס IL-12p70/IL-10 גבוה, אשר ניתן למדוד ELISA. * P <0.01 עבור n = 3. (ב) בהתאם פנוטיפ מופעל לחילופין, MCSF הנגזרות מקרופאגים שטופלו IL-4 constitutively אקספרס YM1 ו ArgI, אשר ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting המערבי. הנתונים מייצגים 3 ניסויים בלתי תלויים עם תוצאות דומות.
איור 3. מוזרק תוך ורידי, לשעבר vivo הנגזרות מופעל לחילופין התנועה מקרופאגים המעי הגס ולהפחית דלקות מעיים. בדור F2 של עכברים מסוג בר על C57BL מעורבת / 6 × 129Sv רקע קיבלו 5% DSS במי השתייה שלהם במשך שישה ימים. מקרופאגים M1 ו-M2 הוזרקו IV על 0 ימים ו -4 במהלך הטיפול DSS. (א) נקודתיים הוסרו קבועה, וחתכים הוכתמו על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור מקרופאגים בוגרים (F4/80) ו סמן מקרופאג M2 (ArgI).Quantitation של מקרופאגים של עכברים שליטה הזריק PBS (C), עכברים שהוזרק עם מקרופאגים M1 (M1 +) ועכברים הזריקו מקרופאגים M2 (+ M2) בוצעו על ידי ספירת התאים מוכתמים חיובי בהגדלה 40 × ב 6 שדות מ -3 חלקים / עכבר מ 6 עכברים / קבוצה. הספירה נערך על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב ניסיוני. (ב) פעילות המחלה היה פיקוח והבקיע מדי יום במהלך הטיפול היא ציון תוסף על בסיס ירידה במשקל, דימום רקטלי, ועקביות שרפרף קטן. * P <0.05 עבור n = 6 עכברים ב -2 ניסויים בלתי תלויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מקרופאגים הם תאים phagocytic כי לשחק תפקיד חשוב במערכת החיסונית. הם אחראים ליזום את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. בדרך כלל, מקרופאגים מופעל קלאסי מופעלים על ידי IFNγ או LPS ואחראים על סילוק פתוגנים גובר תגובה דלקתית 1. לעומת זאת, מקרופאגים מופעל לחילופין מופעלים על ידי IL-4 או IL-13 ו לשחק תפקיד פסולת הדחה שיפוץ רקמות במהלך ברזולוציה של דלקת 1. מקרופאגים מיוחדים במעי לשמור על פעילות bactericidal שלהם, אבל לא לעלות 2 Pro דלקת התגובה. זו סובלנות פלורה מועילות ו אנטיגן המזון מאפשר שחרור של חומר מפר מחסום האפיתל ללא ליזום תגובה חיסונית בלתי הולמת פתולוגית פוטנציאלית 3. מקרופאג סוטה תפקוד המעי הגס יכול לתרוםבתנאים פתולוגיים כולל מחלות מעי דלקתיות, תסמונת המעי הרגיז, וסרטן המעי הגס 3-5. פנוטיפ מקרופאג תלוי microenvironment המקומית כדי הגדרת תפקידם בריאות או מחלה יכול להיות מאתגר. פרוטוקול המתואר כאן מאפשר דלדול מקרופאג מתסביך בסביבה vivo. בנוסף, כדי לבחון את התפקיד של הפנוטיפ מקרופאג באתרו, מקרופאגים מקוטב מוגדרים phenotypically ניתן לגזור vivo לשעבר מ aspirates מח עצם והועברו adoptively לעכברים, עם או בלי דלדול מראש של מקרופאגים.
Clodronate המכיל ליפוזומים לקדם מקרופאג "התאבדות" וגם שימשו לרוקן מקרופאגים במגוון של רקמות 6. מקרופאגים phagocytose clodronate המכיל ליפוזומים, שהם מושפל לאחר מכן על ידי phospholipases lysosomal שחרור clodronate לתוך התא וגורם לאפופטוזיס 12 12 חודש. ליפוזומים חייב להיות מופץ באופן שווה בתמיסה לפני טעינת לתוך המזרק לפני ההזרקה לעכבר, ללא קשר לתוואי של הממשל או רקמות היעד. PBS זריקות זריקה של PBS המכיל ליפוזומים נדרשים שולט כאשר ומכלה מקרופאגים in vivo עם clodronate המכיל ליפוזומים 7. PBS ליפוזומים המכילים לכאורה שליטה טובה יותר מ PBS זריקות בלבד. עם זאת, חשוב לציין כי בעוד כמה דיווחים השתמשו בהצלחה PBS המכיל ליפוזומים כביקורת, אנחנו, ואחרים, דיווחו כי PBS המכיל ליפוזומים יכול לרוקן מקרופאגים בכמה תנאי הניסוי 8, 9. בנוסף, ליפוזומים בלבד דווחו לעכב phagocytosis באופן זמני 10. דלדול מקרופאג ידי PBS המכיל ליפוזומים עשוי להיות תלוי עמ 'היכולת hagocytic והם עשויים להיות שונים על פי זן עכבר, רקע גנטי רקמות, ו / או תנאי הניסוי. השימוש PBS המכיל ליפוזומים כביקורת והשפעתם על דלדול מקרופאג ביישום מסוים צריך להיקבע באופן ניסיוני. לכן, אנו ממליצים ליפוזומים הן PBS ו PBS המכיל לשמש שולטת הזרקת במהלך הניסויים הראשוניים.
שיקול מכריע בעיצוב דלדול ניסויים מקרופאג היא הדרך של מתן clodronate המכיל ליפוזומים. יש לנו מטרה בהצלחה מקרופאגים הגס בעכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal 8. אחרים השתמשו הממשל intrarectal או זריקות תוך ורידי 9, 11. הממשל Intrarectal ו intraperitoneal שניהם דווח לרוקן כ -50% מקרופאגים הגס ואילו הזרקה תוך ורידית דווחה לרוקן עד 90% של מקרופאגים מ Laminapropria 8, 9, 11. בחרנו לבצע זריקות intraperitoneal לספק clodronate המכיל ליפוזומים בשל הפשטות של הטכניקה וגם בגלל מחקרים דומים לשלנו השתמשו בהצלחה בדרך זו של הממשל 7. עם זאת, אם רמות גבוהות יותר של דלדול במעי הגס נדרשים לצורך הניסוי, הזרקה תוך ורידית עשוי לשפר את דלדול.
מסלול של הממשל הוא שיקול חשוב עבור דלדול מקרופאג ברקמות שונות. זריקות Intraperitoneal שימשו כדי לרוקן הצפק, omentum, צומת parathymic הלימפה, הכבד, הטחול מקרופאגים 12. זריקות תוך ורידי שימשו כדי לרוקן מקרופאגים בכבד, הטחול, מח העצם 12. הממשל תוך חדרי של clodronate המכילים ליפוזומים נעשה שימוש כדי לרוקן מקרופאגים perivascular ו meningeal מן המוח הקטן, המוח, וחוט השדרה 12. Intratrachealמינהל אפי של clodronate המכילים ליפוזומים שימשו כדי לרוקן מקרופאגים מכתשיים. לבסוף, הממשל המקומי שימש בהצלחה לכלות מקרופאגים האשכים vitreal 12, 13. היעילות של דלדול מקרופגים ברקמת המטרה צריכה להיקבע באופן ניסיוני ומאומתים על ידי מכתימה רקמות ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 1 א) או על ידי cytometry הזרימה. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להגביר את קצב דלדול מקרופגים. המשתנים יכול להיות מותאם על מנת להגדיל את דלדול כוללות שינוי תוואי ממשל-clodronate המכיל liposome, כמות clodronate המכיל ליפוזומים בכל הזרקה, ו / או תדירות ההזרקה.
שיקול חשוב בפרשנות של הנתונים כאשר באוזון מקרופאגים עם clodronate המכיל ליפוזומים הוא שכל phagocytes מקצועיים מתרוקנים, כולל תאים דנדריטים. על מנת להבטיח כיהאפקט הביולוגי הוא מקרופאג תלוי, ניסויים הכינון מחדש משלימים נדרשים. הפקת מקרופאגים מ aspirates מח עצם הוא כלי שימושי עבור ניסויים הכינון מחדש, כמו גם חוקרים מחקר פונקציה מקרופגים. השתמשנו בהצלחה פרוטוקול במבחנה לחקור את התפקיד של מסלול PI3K איתות הפעלה חלופית של מקרופאגים 14. יש שני שלבים קריטיים בתהליך הגזירה. ראשית, דלדול צעד דבקות הוא חיוני כדי להסיר תאים חסיד מן aspirates מח עצם, או לזהם תאים mesenchymal היווצרות הדם או תאים בוגרים. שנית, פנוטיפ מקרופאג חייבת להיות מאושרת לפני השימוש בהם הליכי הניסוי. שינוי לפרוטוקול זה היא כי מודלים גנטיים שונים יכול לשמש הגזירה מקרופאג והרכבתה מחדש, המתיר חקירת התפקיד של גנים ספציפיים על הפנוטיפ פונקציה מקרופאג ו במבחנהD in vivo. עבור ניסויים הכינון מחדש, הזרקה תוך ורידית היא מצב שכיח ביותר של משלוח מקרופאג אבל הן בכמות התאים ותדירות הזרקה יכול להיות מותאם במיוחד במחקר מסוים. רטרו מסלול זריקות ניתן להשתמש הכינון מחדש, ויש לספק תוצאות דומות. ראוי לציין, מקרופאגים מגויסים לאתרים של דלקת הפנוטיפ שלהם עשויים להשתנות בתגובה אותות microenvironment שלהם. לבסוף, העברת המאמץ עשוי להיות מספיק כדי לספק מקרופאגים לרקמות היעד אך מוקדם של דלדול רקמות מקרופאגים תושב עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר הקמתה של מקרופאגים שהועברו adoptively.
הפרוטוקול המובא כאן יש מספר יתרונות על פני השיטות הקיימות. שיטה חלופית כדי לרוקן מקרופאגים היא באמצעות אבלציה מותנה המהונדס בעכבר, CD11b-DTR 15. בעכבר זה, דיפטריה האנושי רעלן (DT) הקולטן באה לידי ביטוי תחת שליטה oו האמרגן מקרופאג ספציפי CD11b. זה מקנה רגישות הזרקת רעלן DT גורם דלדול מקרופאג 15. למרות דלדול מקרופאג אחוז גדול יותר במודל זה, clodronate המכיל ליפוזומים מציע שני יתרונות חשובים. Clodronate המכיל הזרקת liposome ניתן להשתמש כדי לרוקן מקרופאגים ב זן כל העכבר. מקרופאגים ניתן מדולדל של עכברים מהונדסים גנטית ללא הזמן והעלות הנדרשת backcrossing שנדרש להשתמש בשיטת CD11b-DTR העכבר. מאותה סיבה, מקרופאגים ניתן מדולדל מעכברים על רקע כלשהו, וזה שיקול חשוב אם המודל נחקר דורש רקע ייחודי או מעורבים. כמו כן, הניסויים העברה באמצעות המאמצים לשעבר מקרופאגים ב vivo הנגזרים משורת העכבר ימנע בעיות alloreactivity.
פרוטוקולים שתוארו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של שאלות מחקר. השתמשנו הטכניקות מזרח ללמוד את התפקיד של מקרופאגים של דלקת במעי הגס. Clodronate המכיל liposome בתיווך דלדול מקרופאג והעברת המאמצת של מקרופאגים ניתן להשתמש כדי לכוון מספר רב של רקמות. העברת מקרופאג המאמצת ניתן מקרופאגים מחדש מדולדל או מאקרופאגים ישירים לאתרים של דלקת במודלים גנטיים או מושרה של דלקת. פרוטוקול זה גם מספק פלטפורמה לבחינת הרפוי ממוקדות מקרופאג במודלים של מחלת שבו מקרופאגים או הקיטוב שלהם הקשורים לפתולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי "מענק סיוע למחקר" מ קרוהן קוליטיס קרן של קנדה LMS, אשר נתמכת על ידי האגודה הקנדית לגסטרואנטרולוגיה / הקנדי איגוד הבריאות של מחקר / קרוהן ו קוליטיס קרן פרס החוקר חדש בקנדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
