Summary
Makrofager spiller en sentral rolle i homeostase og patologi i mange vev. Protokollen som presenteres her beskriver metoder for å tappe makrofager
Abstract
Makrofager er kritiske aktører i det medfødte immunforsvaret mot infeksiøs utfordring eller skade, initiere det medfødte immunforsvaret og dirigerte ervervet immunrespons. Macrophage dysfunksjon kan føre til en manglende evne til å montere en hensiktsmessig immunrespons, og som sådan, har vært innblandet i mange sykdomsprosesser, inkludert inflammatoriske tarmsykdommer. Makrofager vise polariserte fenotyper som er grovt delt inn i to kategorier. Klassisk aktiverte makrofager, aktiveres ved stimulering med IFNγ eller LPS, spille en avgjørende rolle i respons til bakteriell utfordring mens alternativt aktiverte makrofager, aktiveres av IL-4 eller IL-13, delta i rusk scavenging og vev ombygging og har vært innblandet i oppløsning fasen av betennelse. Under en inflammatorisk respons in vivo, er makrofager funnet midt i en kompleks blanding av infiltrere immunceller og kan delta ved å forverre eller resolving betennelse. Å definere rollen makrofager in situ i en hel dyr modell, er det nødvendig å undersøke effekten av tappe makrofager fra komplekset miljøet. Å stille spørsmål om hvilken rolle macrophage fenotype in situ, kan fenotypisk definerte polariserte makrofager utledes ex vivo, fra benmargen aspirates og lagt tilbake til mus, med eller uten forutgående uttømming av makrofager. I protokollen som presenteres her klodronat-holdige liposomer, versus PBS injisert kontroller, ble brukt til å utarme colonic makrofager under dekstran natriumsulfat (DSS)-indusert kolitt i mus. I tillegg ble polarisert makrofager avledet ex vivo og overføres til mus ved intravenøs injeksjon. En påminnelse til denne tilnærmingen er at klodronat-holdige liposomer utarme alle profesjonelle fagocytter, inkludert både dendrittiske celler og makrofager, så for å sikre virkningen observert ved trykkavlastning er makrofag-spesifikk, rekonstituering of fenotype ved adoptiv overføring av makrofager er nødvendig. Systemisk macrophage uttømming i mus kan også oppnås ved tilbakekryssing mus på en CD11b-DTR bakgrunn, som er en utmerket komplementær tilnærming. Fordelen med klodronat-holdig liposome-mediert reduksjon er at den ikke krever tid og kostnader involvert i tilbakekryssing mus og den kan brukes i mus uavhengig av bakgrunn av mus (C57BL / 6, BALB / c, eller blandet bakgrunn ).
Protocol
1. Nedbrytende Makrofager Bruke klodronat-holdige Liposomer
- Liposomer lagres ved 4 ° C. To timer før injeksjonen, fjerne klodronat-holdige liposomer og PBS som inneholder liposomer, eller sterilt PBS (injeksjon kontroll) fra kjøleskapet for å tillate dem å akklimatisere seg til romtemperatur (18 ° C).
- Invertere rør som inneholder liposomer 8-10 ganger for å sikre en jevn fordeling før du legger 200 mL i en 1 ml sprøyte. Fest en 26 gauge kanyle til toppen av sprøyten.
- Bruk venstre hånd, Scruff musen like nedenfor ørene holder nok hud til å immobilisere hodet og lemmer.
- Vipp musen slik hodet er litt mot bakken slik indre organer bevege seg bort fra injeksjonsstedet, som ligger i nedre høyre kvadrant av abdomen.
- Rull sprøyten mellom håndflatene og invertere den 6 ganger for å fordele liposome løsningen jevnt før injeksjon. <li> Sett nålen i nedre høyre side av musen buken på et 30-40 graders vinkel. Injiser 200 mL av liposome løsning eller PBS.
- Under en indusert inflammasjon modell, som DSS-indusert kolitt, injisere mus 4 dager før utbruddet av eksperimentell betennelse å sikre uttømming av fastboende makrofager og hver 2 dager under protokollen å utarme nye infiltrere makrofager.
- På slutten av forsøket, sammen med planlagte eksperimentelle analyser, fjerne vev fra stedet av interesse og fest med paraformaldehyde å bekrefte macrophage uttømming av immunhistokjemisk farging.
2. Utledning av polariserte Makrofager fra benmargen aspirates
- Benmarg fra mus mellom 8 og 12 ukers alder gir den høyeste avkastningen av beinmarg-deriverte makrofager. Avlive musa, lå den på ryggen, og peke ut labbene, strekker sine lemmer så langt som mulig.
- Arbeid i et sterilt hood, fjerne lårben og tibias, skjære bort så mye muskler som mulig.
- Flush marg fra knoklene som bruker IMDM med 10% FCS lastet inn i en 5 ml sprøyte utstyrt med en 26 gauge kanyle.
- Fortynn benmargen aspirates til 40 ml i IMDM med 10% FCS, sted celler i en 75 cm 2 vevskultur kolbe, og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 i 4 timer. Dette trinnet fjerner heftende mesenkymalceller eller modne makrofager fra blodkreft stamfedre.
- Transfer kultur supernatanten som inneholder ikke-heftende stamfedre til en 50 ml konisk Falcon rør og sentrifuger i 5 min ved 1200 rpm.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml IMDM, 10% FCS og telle kjerneholdige celler ved fortynning cellesuspensjon en i 20 i eddiksyre. Denne prosedyren lyses alle celler, inkludert røde blodceller og de resterende kjernene kan telles på en hemocytometer.
- Resuspender cellene ved en konsentrasjon på 0,5 × 10 6 celler / ml i full medium; IMDM, 10% FCS, 150 mikrometer monothioglycerol (MTG), og 10 ng / ml av enten MCSF, GM-CSF, eller IL-3. MCSF-deriverte makrofager er klassisk aktiveres makrofager, mens GM-CSF-eller IL-3-deriverte makrofager blir alternativt aktivert.
- Bytt medium på dag 4, spinning ned ikke-heftende celler og returnere dem til Kolben, og i dag 7, forkaster ikke-heftende celler.
- I tillegg kan IFNγ (10 ng / ml) eller IL-4 (10 ng / ml) legges til kolber inneholder MCSF-deriverte celler på dag 7 til skew makrofager til en klassisk aktivert eller en alternativt aktivert fenotype, henholdsvis. Inkuber cellene i 3 dager.
- På dag 10, fjerne media og løft celler ut av vevskultur kolben bruker Cell Dissosiasjon buffer (Gibco-BRL). Plasser 5 ml buffer på celler i 5 min ved romtemperatur (18 ° C) og deretter banke på siden av flasken med hælen på håndflaten din hardt flere ganger. Sørg for at cellene har løftet ut av kolben ved å undersøke kolben under enmikroskop. Pipet resuspendert celler inn i en 15 ml konisk Falcon rør og vask kolben med ytterligere 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool og spinn ned cellene i 5 min ved 300 × g.
- Telle levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer og resuspender i en konsentrasjon på 10 7 celler / ml i steril PBS pH7.4. Makrofager er klar for injeksjon i mus.
- Reserve 1.0 × 10 6 makrofager for vurdering av macrophage fenotype. Klassisk aktivert makrofager stimulert med lipopolysakkarid skiller høye nivåer av nitrogenoksid og IL-12p70 og lave nivåer av IL-10 i forhold til alternativt aktiverte makrofager. Alternativt aktiverte makrofager constitutively uttrykke YM1 og arginase I (Argi), som kan oppdages ved Vest immunoblotting.
3. Tranferring Makrofager i mus
- Resuspender makrofager i steril PBS ved en konsentrasjon på 10 7 celler / ml. Dette muliggjør en itravenous injeksjon av 10 6 makrofager i et totalt volum på 100 mL, som er et volum som kan være trygt og komfortabelt injisert i mus etter halen blodåre.
- Varm mus ved hjelp av en oppvarming puten eller varme lap for 5-10 min å strekke halen blodåre. Overvåk musen hele tiden etter tegn på hypertermi.
- Overfør musen til en begrensende enhet som gir tilgang til halen årer.
- Roter halen 90 ° slik at venen vender oppover. Vener kjøre sidelengs ned begge sider av halen og enten vene kan benyttes.
- Rengjør injeksjonsstedet med en spritserviett og sakte injiseres 100 mL (10 6 makrofager) ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 26 eller 28 gauge kanyle. Sett nålen med skråkant vendt opp og med en liten vinkel, nesten parallelt med venen.
- Hvis nålen er satt inn ordentlig ingen motstand skal kunne merkes og venen skal bli klart etter injeksjon. Hvis nålen ikke er ivene, halen vil bule. Hvis dette skjer, fjerner du nålen og prøve igjen proksimalt for siste forsøk eller i andre venen. En ny nål må brukes for hver injeksjon som halen er tøff og nålene blir kjedelig fort under halen blodåre injeksjon.
- Etter injeksjon, fjerne nålen, gjelder milde press på injeksjonsstedet inntil blødningen stopper, og overvåke musen for en ekstra 5min å sikre at blødningen har stoppet.
- Gjenta macrophage injeksjoner hver 4 dager for å sikre en kontinuerlig levering av polariserte makrofager under eksperimentelle prosedyren.
- På slutten av forsøket, sammen med eksperimentelle analyser, fjerne vev fra stedet av interesse og fikse med paraformaldehyde eller formalin for å bekrefte effektiv levering av polariserte makrofager ved immunhistokjemisk farging.
4. Representative Resultater
Antall og fenotype av bosatt macrophages i en gitt vev avhenger av vevet blir undersøkt og vil endre seg i løpet av infeksjon eller betennelse. Tilsvarende vil muligheten for klodronat-holdige liposomer å utarme makrofager fra en vev avhenger administrasjonsrute og effektiv levering til målvevet. Intraperitoneal injeksjon av klodronat-holdige liposomer resulterer i en reduksjon i F4/80 + makrofager i musen tykktarmen under DSS-indusert kolitt tydelig ved immunhistokjemisk farging for macrophage markør, F4/80 (figur 1A). Histologisk farging kan også brukes til å bestemme kvantitative forskjeller i macrophage nummer og fenotype i vevsdelene. Figur 1b viser at en gjennomsnittlig 55% av makrofager er oppbrukt etter klodronat-holdige liposomer sammenlignet med ingen uttømming påvist i mus kolon når mus blir injisert med PBS alene som en injeksjon kontroll. Hver verdi fastsettes ved å telle F4/80 og Argi beised positive celler i serie vevsdelene fra 6 mus på 3 poeng i 3 seksjoner per mus med telling utført av to personer blindet for eksperimentell tilstand. Disse resultatene viser at intraperitoneal injeksjon av klodronat liposomer utarme colonic makrofager i mus.
Utledning av makrofager fra benmarg i nærvær av ulike vekstfaktorer avkastning makrofager som er klassisk aktivert (MCSF-avledet eller MCSF-avledet og behandles med IFNγ) eller alternativt aktivert (GM-CSF eller IL-3-deriverte eller MCSF-avledet og behandlet med IL-4). Flushing beinmarg fra 2 lårben og 2 tibias fra en 8 ukers gammel mus gir vanligvis 6 × 10 7 kjerneholdige celler per mus og gir 8 × 10 6 MCSF-deriverte makrofager, 10 × 10 6 GM-CSF-deriverte makrofager, eller 12 × 10 6 IL-3-deriverte makrofager. Figur 2a viser nitritt og IL-12p70/IL-10 forholdet i macrophage supernatants behandlet med lipopolysakkarid i 24 timer figur 2B viser en typisk Western blot analyse av 0,5 × 10 6 makrofager fra MCSF + / -. IL-4 derivasjon forhold probed med antistoffer for alternativt aktivert macrophage markører, Argi og YM1, eller med GAPDH som en lasting kontroll. Disse dataene viser at benmargen-deriverte makrofager kan være skjev til en polarisert fenotype under derivasjon.
Effektiv overføring av ex vivo avledet polariserte makrofager til en vev er avhengig av tilførselsvei og tilgang til vevet. Under DSS-indusert kolitt, makrofager injiseres intravenøst reise til området for betennelse og eventuelt aktiverte makrofager redusere sykdommens alvorlighetsgrad. Figur 3A viser det totale antallet makrofager og antall Argi + (alternativt aktivert) makrofager telles i histologiske seksjoner fra mus injisert med polarisert beinmarg-Avledet makrofager. Virkningen av overføring av polariserte makrofager til kolon under DSS-indusert kolitt er vist med sykdomsaktivitet indeksen, en additiv poengsum basert på vekttap, rektal blødning, og redusert avføring konsistens (Figur 3B). Disse resultatene viser at ex vivo avledet, adoptively overført makrofager kan trafikk til tykktarmen og effekten indusert betennelser. M1 makrofager ikke påvirke betennelse mens M2 makrofager redusere sykdomsaktivitet indeksen.
Figur 1. Klodronat-inneholder liposomer effektivt utarme F4/80 + og F480 + Argi + celler i mus kolon in vivo. En F2 generasjon av villtype mus på en blandet C57BL / 6 × 129Sv bakgrunn ble det gitt 5% DSS i 7 dager og injiserte IP med PBS (Control) eller klodronat som inneholder liposomer (klodronat) 4 dager før DSS behandlingog på dag 0, 2, 4 og 6 under DSS behandling. (A) Kolon ble fjernet, fikset, og deler ble farget av immunhistokjemi for modne makrofager (F4/80) og M2 macrophage markør, Argi. (B) Kvantitering av F4/80 + og Argi + makrofager. Positivt fargede celler ble talt med to personer blindet for eksperimentell tilstand på 40 × forstørrelse i 6 felt fra 3 seksjoner / mus og fra 6 mus / gruppe. * P <0.01.
Figur 2. MCSF-deriverte makrofager uttrykker en klassisk aktivert fenotype og MCSF-deriverte makrofager behandlet med IL-4 uttrykke en alternativt aktivert macrophage fenotype. (A) I tråd med en klassisk aktivert fenotype, MCSF-deriverte makrofager produserer høyere nivåer av nitrogenoksid i respons til lipopolysakkarid og kan måles ved Griess analysen, som oppdager sitt nedstrøms metabolitt, nitritt. De also gi en høyere IL-12p70/IL-10 ratio, som kan måles ved ELISA. * P <0.01 for n = 3. (B) I samsvar med en alternativt aktivert fenotype, MCSF-deriverte makrofager behandlet med IL-4 constitutively ekspress YM1 og Argi, som kan oppdages ved Vest immunoblotting. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Figur 3. Intravenøs injisert, ex vivo-avledet alternativt aktivert makrofager trafikk til tykktarmen og reduserer intestinal inflammasjon. En F2 generasjon av villtype mus på en blandet C57BL / 6 × 129Sv bakgrunn ble det gitt 5% DSS i sitt drikkevann i seks dager. M1 og M2 makrofager ble injisert IV på dag 0 og 4 under DSS behandling. (A) Kolon ble fjernet, fikset, og deler ble farget av immunhistokjemi for modne makrofager (F4/80) og en M2 macrophage markør (Argi).Kvantitering av makrofager for kontroll PBS injisert mus (C), ble musene injisert med M1 makrofager (+ M1) og mus injisert med M2 makrofager (+ M2) utføres ved å telle positivt fargede celler på 40 × forstørrelse i 6 felt fra 3 seksjoner / mus og fra 6 mus / gruppe. Telling ble utført av to personer blindet for eksperimentell tilstand. (B) sykdomsaktivitet ble overvåket og scoret daglig under behandling og er en additiv poengsum basert på vekttap, rektal blødning, og redusert avføring konsistens. * P <0,05 for n = 6 mus i 2 uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager er phagocytic celler som spiller en viktig rolle i immunforsvaret. De er ansvarlige for å initiere det medfødte immunforsvaret og dirigerte ervervet immunrespons. Vanligvis er klassisk aktiveres makrofager aktiveres ved IFNγ eller LPS og er ansvarlig for å eliminere patogener og montering en betennelsesreaksjon en. Motsatt er alternativt aktiveres makrofager aktiveres ved IL-4 eller IL-13 og spiller en rolle i rusk scavenging og vev remodeling under oppløsningen av betennelse en. Spesialiserte makrofager i tarmen beholde sin baktericide aktivitet, men ikke montere en pro-inflammatorisk respons to. Dette toleranse til gunstige flora og mat antigen tillater klarering av materiale som bryter med den epiteliale barriere uten å innlede en upassende og potensielt patologiske immunrespons tre. Aberrant colonic makrofag-funksjonen kan bidratil patologiske tilstander, inkludert inflammatoriske tarmsykdommer, irritabel tarm syndrom, og kolorektal kreft 3-5. Macrophage fenotype er avhengig av lokale mikromiljøet så definere sin rolle i helse eller sykdom kan være utfordrende. Protokollen er beskrevet her tillater macrophage uttømming fra komplekset in vivo miljø. I tillegg til å undersøke hvilken rolle macrophage fenotype in situ, kan fenotypisk definerte polariserte makrofager utledes ex vivo fra benmargen aspirates og adoptively overført til mus, med eller uten forutgående uttømming av makrofager.
Klodronat som inneholder liposomer fremme makrofag "selvmord" og har blitt brukt til å utarme makrofager i en rekke vev 6. Makrofager phagocytose klodronat-holdige liposomer, som senere blir degradert av lysosomale phospholipases frigjøre klodronat inn i cellen og induserende apoptose 12 12. Liposomer skal være jevnt fordelt i løsningen før du legger inn i sprøyten og før injeksjon i mus, uavhengig av administrasjonsmåte eller målvevet. PBS injeksjoner og injeksjon av PBS som inneholder liposomer kreves kontrollerer når tappe makrofager in vivo med klodronat-holdige liposomer 7. PBS som inneholder liposomer synes å være en bedre kontroll enn PBS injeksjoner alene. Det er imidlertid viktig å merke seg at mens noen rapporter har med hell brukt PBS-holdige liposomer som en kontroll, vi, og andre, har rapportert at PBS-holdige liposomer kan utarme makrofager i noen eksperimentelle forhold 8, 9. I tillegg har liposomer alene er rapportert å hemme fagocytose midlertidig 10. Macrophage uttømming av PBS-holdige liposomer kan være avhengig av phagocytic evne og kan variere i henhold til mus stamme, genetisk bakgrunn, vev, og / eller eksperimentelle tilstand. Bruken av PBS som inneholder liposomer som en kontroll og deres effekt på macrophage utarming i en spesifikk applikasjon må bestemmes eksperimentelt. Derfor anbefaler vi at både PBS og PBS-holdig liposomer brukes som sprøyterom kontroller under innledende eksperimenter.
En kritisk faktor i utformingen macrophage utarming eksperimenter er ruten for administrasjon av klodronat som inneholder liposomer. Vi har med hell målrettet colonic makrofager i mus med intraperitoneal injeksjon 8. Andre har brukt intrarectal administrasjon eller intravenøs 9 injeksjoner, 11. Intrarectal og intraperitoneal administrasjon har begge blitt rapportert å utarme ca 50% av colonic makrofager mens intravenøs injeksjon er rapportert å utarme opptil 90% av makrofager fra lamina8 propria, 9, 11. Vi valgte å utføre intraperitoneal injeksjonene for å levere klodronat-holdige liposomer på grunn av enkelheten i teknikk og fordi studier ligner vår har med hell brukt denne tilførselsvei 7. Men hvis høyere nivåer av uttømming i tykktarmen er nødvendig for et eksperiment, kan intravenøs injeksjon forbedre trykkavlastning.
Administrasjonsvei er en viktig faktor for macrophage uttømming i ulike vev. Intraperitoneal injeksjoner har blitt brukt til å utarme peritoneal, omentum, parathymic lymfeknute, lever og milt makrofager 12. Intravenøse injeksjoner har blitt brukt til å utarme makrofager i lever, milt og benmarg 12. Intraventrikulær administrering av klodronat-holdige liposomer har blitt brukt til å utarme perivaskulær og meningeal makrofager fra lillehjernen, cerebrum og ryggmarg 12. Intratrakealog intranasal administrering av klodronat-holdige liposomer har blitt brukt til å utarme alveolære makrofager. Endelig har lokal forvaltning blitt brukt til å utarme testiklene og vitreal makrofager 12, 13. Effekten av macrophage uttømming i en målvevet må bestemmes eksperimentelt og validert ved farging vev ved immunhistokjemi (figur 1A) eller ved flowcytometri. I noen tilfeller kan det være nødvendig å øke macrophage uttømming rate. De variabler som kan optimaliseres for å øke uttømming inkludere å endre ruten for klodronat som inneholder liposome administrasjon, mengden av klodronat-holdige liposomer per injeksjon, og / eller hyppigheten av injeksjon.
Et viktig hensyn i tolkning av data når nedbrytende makrofager med klodronat-holdige liposomer er at alle profesjonelle fagocytter er tømt, inkludert dendrittiske celler. For å sikre at enbiologisk effekt er makrofag-avhengige, er komplementære Rekonstitusjon eksperimenter nødvendig. Stammer makrofager fra benmargen aspirates er et nyttig verktøy for rekonstituering eksperimenter samt forskning undersøker makrofag-funksjon. Vi har med hell brukt denne protokollen for in vitro-studier som utforsker rolle PI3K signalveien i den alternative aktivering av makrofager 14. Det er to viktige steg i utledningen prosessen. Først er etterlevelse uttømming steg avgjørende for å fjerne heftende celler fra benmargen aspirates, enten forurensende mesenchymale celler eller modne blodkreft celler. Andre bør macrophage fenotype bekreftes før deres bruk i eksperimentelle prosedyrer. En modifikasjon av denne protokollen er at ulike genetiske modeller kan brukes til makrofag derivasjon og rekonstituering tillater gransking av hvilken rolle spesifikke gener i macrophage fenotype og funksjon in vitro end in vivo. For rekonstituering eksperimenter, er intravenøs injeksjon den vanligste måten å macrophage levering men både celle kvantitet og injeksjon frekvens kan optimaliseres for en bestemt studie. Retro-orbitale injeksjoner kan brukes til tilberedning og bør gi lignende resultater. Av notatet, er makrofager rekruttert til områder av betennelse og deres fenotype kan endres som følge av signaler fra mikromiljøet deres. Endelig kan adoptiv overføring være tilstrekkelig til å levere makrofager til en målvevet men før uttømming av fastboende vev makrofager kan være nødvendig å tillate etablering av adoptively overført makrofager.
Protokollen presenteres her har en rekke fordeler fremfor eksisterende metoder. En alternativ metode for å utarme makrofager er ved hjelp av betinget ablasjon transgene mus, CD11b-DTR 15. I denne musen, er den menneskelige difteri toksin (DT) reseptoren uttrykkes under kontroll of makrofag-spesifikk CD11b promoter. Dette gir toksin følsomhet og DT injeksjon fører macrophage uttømming 15. Selv om andelen macrophage uttømming er større i denne modellen, og tilbyr klodronat-holdige liposomer to viktige fordeler. Klodronat-holdig liposome injeksjon kan brukes til å utarme makrofager i noen mus belastning. Makrofager kan bli tømt fra genmodifiserte mus uten den tiden og kostnadene som kreves for tilbakekryssing som kreves for å bruke CD11b-DTR mus metode. Av samme grunn, kan makrofager bli tømt fra mus på alle bakgrunn, som er et viktig hensyn hvis modellen som undersøkes krever et unikt eller blandet bakgrunn. Tilsvarende unngår adoptivforeldrene overføring eksperimenter med ex vivo avledet makrofager fra en mus linje noen problemer med alloreactivity.
Protokollene er beskrevet her kan brukes til en rekke problemstillinger. Vi har brukt thESE teknikker for å studere rollen til makrofager i betennelse i tykktarmen. Klodronat-holdig liposome-mediert macrophage uttynning og adoptivforeldre overføring av makrofager kan brukes til å målrette et stort antall av vev. Macrophage adoptiv overføring kan brukes til å Rekonstituer utarmet makrofager eller direkte makrofager til nettsteder av betennelse i genetiske eller induserbar modeller av betennelse. Denne protokollen gir også en plattform for å undersøke macrophage målrettede behandlingsformer i sykdom modeller hvor makrofager eller deres polarisering er forbundet med patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en "Grant i Aid for forskning" fra Crohns og kolitt Foundation of Canada til LMS, som støttes av en kanadisk Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health Research / Crohns og kolitt Foundation of Canada New Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S.
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
