Summary
Makrofager spelar en central roll i homeostas och patologi i många vävnader. Protokollet presenteras här beskriver metoder för förbruka makrofager
Abstract
Makrofager är viktiga aktörer i det medfödda immunsvaret mot infektiös utmaning eller skada, inleda det medfödda immunförsvaret och leda det förvärvade immunsvaret. Makrofag dysfunktion kan leda till oförmåga att montera en lämplig immunrespons och som sådan, har implicerats i många sjukdomsförlopp, inkluderande inflammatoriska tarmsjukdomar. Makrofager visa polariserade fenotyper som i stort sett delas in i två kategorier. Klassiskt aktiverade makrofager, aktiverade genom stimulering med IFNy eller LPS spelar en väsentlig roll i gensvar på bakteriell utmaning medan alternativt aktiverade makrofager, aktiverade med IL-4 eller IL-13, delta i skräp eliminerande och vävnadsombildning och har implicerats i lösningen fas av inflammation. Under ett inflammatoriskt svar in vivo, är makrofager mitt bland en komplex blandning av infiltrera immunceller och kan delta genom att förvärra eller resolving inflammation. För att definiera rollen av makrofager in situ i ett helt djurmodell, är det nödvändigt att undersöka effekten av förbruka makrofager från komplex miljö. Att ställa frågor om vilken roll makrofag fenotyp in situ, kan fenotypiskt definierade polariserade makrofager härledas ex vivo, från benmärgsaspirat och läggs tillbaka till möss, med eller utan föregående utarmning av makrofager. I protokollet som presenteras här klodronat-innehållande liposomer, mot PBS injicerade kontroller användes för att utarma colonic makrofager under dextran natriumsulfat (DSS)-inducerad kolit i möss. Dessutom har polariserade makrofager härledda ex vivo och överfördes till möss genom intravenös injektion. En nackdel med detta tillvägagångssätt är att klodronat-innehållande liposomer bryter alla professionella fagocyter, däribland både dendritiska celler och makrofager så att se till att effekten observerades av utarmning är makrofag-specifik, beredning of fenotyp genom adoptiv överföring av makrofager som är nödvändigt. Systemisk makrofag utarmning i möss kan också uppnås genom återkorsning möss på en CD11b-DTR bakgrund, vilket är ett utmärkt komplement. Fördelen av klodronat-innehållande liposommedierad utarmning är att den inte kräver tid och kostnad involverad i återkorsning möss och den kan användas i möss oberoende av bakgrunden till möss (C57BL / 6, Balb / c-, eller blandad bakgrund ).
Protocol
1. Utarmande Makrofager Använda Klodronat-innehållande liposomer
- Liposomer förvarades vid 4 ° C. Två timmar före injektion, ta bort klodronat-innehållande liposomer, PBS innehållande liposomer eller sterilt PBS (injektion kontroll) ur kylskåpet så att de kan anpassa sig till rumstemperatur (18 ° C).
- Invertera rören innehållande liposomer 8-10 gånger för att säkerställa en jämn fördelning före laddning 200 pl i en 1 ml spruta. Fästa en 26 gauge nål till toppen av sprutan.
- Med vänster hand, nackskinnet musen precis under öronen håller nog huden immobilisera huvudet och lemmar.
- Luta mus så att dess huvud är något mot marken så inre organ rör sig bort från injektionsstället, vilket är beläget i den nedre högra kvadranten av bukhålan.
- Rulla sprutan mellan handflatorna och vänd den 6 gånger för att fördela liposomlösningen jämnt före injektion. <li> Stick in nålen i det nedre högra sidan av musen buken i en 30-40 graders vinkel. Injicera 200 | il av liposomlösningen eller PBS.
- Under en inducerad inflammation modell, som DSS-inducerad kolit, injicera möss 4 dagar före debuten av experimentell inflammation för att säkerställa utarmning av inhemska makrofager och var 2 dagar under protokollet att tömma nya infiltrerar makrofager.
- Vid slutet av försöket, tillsammans med planerade experimentella analyser, ta bort vävnad från platsen av intresse och fixa med paraformaldehyd för att bekräfta makrofag utarmning av immunhistokemisk färgning.
2. Härledning av polariserat makrofager från Benmärgaspirat
- Benmärg från möss mellan 8 och 12 veckors ålder ger det högsta utbytet av benmärg-härledda makrofager. Euthanize musen, lägg det på ryggen, och sätta fingret på tassarna, sträcker sina armar och ben så långt som möjligt.
- Att arbeta i en steril hood, ta bort lårben och skenben, skär bort så mycket muskler som möjligt.
- Spolning märg från ben med användning IMDM med 10% FCS laddas in i en 5 ml spruta försedd med en 26 gauge nål.
- Späd benmärgsaspirat till 40 ml i IMDM med 10% FCS, celler plats i en 75 cm 2 vävnadsodlingskolv och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 4 timmar. Detta steg avlägsnar fastsittande mesenkymala celler eller mogna makrofager från hematopoetiska stamceller.
- Överföring odlingssupernatant innehållande icke vidhäftande progenitorer till en 50 ml koniskt Falcon-rör och centrifugera under 5 min vid 1200 varv per minut.
- Återsuspendera cellpelleten i 5 ml IMDM, 10% FCS och räkna celler med cellkärna genom spädning cellsuspension 1 i 20 i ättiksyra. Detta förfarande lyserar alla celler, inklusive röda blodkroppar och resterande kärnorna kan räknas på en hemocytometer.
- Återsuspendera celler vid en koncentration av 0,5 x 10 6 celler / ml i fullständigt medium; IMDM, 10% FCS, 150 | iM monotioglycerol (MTG) och 10 ng / ml av antingen mCSF, GM-CSF eller IL-3. MCSF makrofager är klassiskt aktiverade makrofager medan GM-CSF-eller IL-3-härledda makrofager alternativt aktiveras.
- Byt mediet vid dag 4, spinning ner icke vidhäftande celler och tillbaka dem till kolven och på dag 7, kasta ej vidhäftande celler.
- Dessutom kan IFNy (10 ng / ml) eller IL-4 (10 ng / ml) tillsättas till kolvar innehållande mCSF-härledda celler vid dag 7 till snedställda makrofager att en klassisk aktiveras eller en alternativt aktiverad fenotyp, respektive. Inkubera cellerna i ytterligare 3 dagar.
- Vid dag 10, avlägsnas media och lyfta cellerna bort från vävnadsodlingskolv med användning celldissociation buffert (Gibco-BRL). Placera 5 ml buffert på celler i 5 minuter vid rumstemperatur (18 ° C) och sedan slår sidan av kolven med hälen på handflatan ordentligt flera gånger. Säkerställa att cellerna har lyfts bort från kolven genom att undersöka kolv under enmikroskop. Pipettera återsuspenderades cellerna i en 15 ml koniskt Falconrör och tvätta kolven med ytterligare 10 ml av IMDM, 10% FBS. Pool och centrifugera ner cellerna under 5 min vid 300 x g.
- Räkna viabla celler med användning av en hemocytometer och återsuspendera i en koncentration av 10 7-celler per ml i steril PBS pH 7,4. Makrofager är färdig för injektion i möss.
- Boka 1,0 x 10 6 makrofager för bedömning av makrofager fenotyp. Klassiskt aktiverade makrofager stimulerade med lipopolysackarid höga utsöndrar nivåer av kväveoxid och IL-12p70 och låga nivåer av IL-10 jämfört med alternativt aktiverade makrofager. Alternativt aktiverade makrofager uttrycka konstitutivt YM1 och arginas I (Argi), som kan detekteras genom Western immunoblotting.
3. Tranferring Makrofager i möss
- Återsuspendera makrofager i steril PBS vid en koncentration av 10 7 celler / ml. Detta medger en itravenous injektion av 10 6 makrofager i en total volym av 100 | il, vilket är en volym som kan säkert och bekvämt injicerades i möss genom svansvenen.
- Varma möss med användning av en värmedyna eller värme varv under 5-10 min för att dilatera svansvenen. Övervaka musen vid alla tidpunkter för tecken på hypertermi.
- Överför musen till en återhållande enhet som tillåter åtkomst till svans venerna.
- Rotera svansen 90 °, så att ven är vänd uppåt. Vener springa i sidled nedåt båda sidor av svansen och båda ven kan användas.
- Rengör injektionsstället med en kompress med alkohol och långsamt injicera 100 ^ (10 6 makrofager) med en 1 ml spruta med en 26 eller 28 gauge nål. Sätt in nålen med avfasningen uppåt och med en liten vinkel, nästan parallellt med venen.
- Om nålen ordentligt inget motstånd ska kännas och ven bör bli klart efter injektion. Om nålen är inte iven, svansen kommer bula. Om detta inträffar, ta ut nålen och försök igen proximalt till den sista försök eller i den andra venen. En ny nål ska användas för varje injektion eftersom svansen är tuff och nålar bli matt snabbt under svansveninjektion.
- Efter injektion, ta ut nålen, tryck lätt på injektionsstället tills blödningen upphör och övervaka musen för ytterligare 5 min för att säkerställa att blödningen har slutat.
- Upprepa makrofag injektioner var 4 dagar för att säkerställa en kontinuerlig leverans av polariserade makrofager under den experimentella proceduren.
- Vid slutet av försöket, tillsammans med experimentella analyser, ta bort vävnad från platsen av intresse och fixa med paraformaldehyd eller formalin för att bekräfta effektiv leverans av polariserade makrofager med immunhistokemisk färgning.
4. Representativa resultat
Antalet och fenotyp bosatta macrophages i varje given vävnad beror på den vävnad som undersöks och kommer att förändras under infektion eller inflammation. På liknande sätt kommer förmågan hos klodronat-innehållande liposomer för att utarma makrofager från en vävnad bero på administreringsvägen och effektiv avgivning till målvävnaden. Intraperitoneal injektion av klodronat-innehållande liposomer i en minskning i F4/80 + makrofager hos mus kolon under DSS-inducerad kolit uppenbar genom immunhistokemisk färgning för makrofag markör, F4/80 (figur 1A). Histologisk färgning kan också användas för att bestämma kvantitativa skillnader i makrofag antal och fenotyp i vävnadssnitt. Figur 1B visar att i genomsnitt 55% av makrofager är uttömda av klodronat-innehållande liposomer jämfört med ingen utarmning detekteras i mus-kolon när möss injiceras med PBS enbart som en injektion kontroll. Varje värde bestäms genom att räkna F4/80 och Argi fläckared positiva celler i seriella vävnadssnitt från 6 möss vid 3 punkter, i 3 sektioner per mus med att räkna utförs av två personer förblindade experimentell tillstånd. Dessa resultat visar att intraperitoneala injektioner av klodronat liposomer bryter colonic makrofager i möss.
Härledning av makrofager från benmärg i närvaro av olika tillväxtfaktorer utbyten makrofager som klassiskt aktiveras (mCSF-härledda eller mCSF-härledd och behandlades med IFN-y) eller alternativt aktiveras (GM-CSF eller IL-3-härledda eller mCSF-härledd och behandlade med IL-4). Flushing benmärg från 2 lårben och 2 skenben från en 8 veckor gammal mus normalt ger 6 x 10 7 celler med cellkärna per mus och avkastning 8 × 10 6 mCSF makrofager, 10 × 10 6 GM-CSF-härledda makrofager, eller 12 × 10 6 IL-3-härledda makrofager. Figur 2A visar nitrit och IL-12p70/IL-10 förhållandet i makrofag supernatants behandlades med lipopolysackarid under 24 timmar Figur 2B visar en typisk Western blot-analys av 0,5 x 10 6 makrofager från mCSF + / -. IL-4 härledning betingelser sonderades med antikroppar för alternativt aktiverade makrofager markörer, Argi och YM1, eller med GAPDH såsom en lastning kontroll. Dessa data visar att benmärg makrofager kan luta åt en polariserad fenotyp under härledning.
Effektiv överföring av ex härrör vivo polariserade makrofager till en vävnad är beroende av administreringssättet och tillgång till vävnaden. Under DSS-inducerad kolit, injiceras makrofager intravenöst resa till platsen för inflammation och alternativt aktiverade makrofager minskar sjukdomens svårighetsgrad. Figur 3A visar det totala antalet makrofager och antalet Argi + (alternativt aktiveras) makrofager räknat i histologiska snitt från möss som injicerats med polariserad benmärgMakrofager. Effekten av överföring av polariserade makrofager till kolon under DSS-inducerad kolit visas av sjukdomsaktivitetsindex, en additiv poäng baserad på viktminskning, rektal blödning och minskad avföringens konsistens (figur 3B). Dessa resultat visar att ex vivo härledd adoptivt överförda makrofager kan trafik till tjocktarmen och effekten inducerad inflammation. M1 makrofager inte påverkar inte inflammation medan M2 makrofager avsevärt minska index sjukdomsaktiviteten.
Figur 1. Klodronat-innehållande liposomer effektivt bryter F4/80 + och F480 + Argi ^ celler i mus-kolon in vivo. En F2-generationen av möss av vildtyp på en blandad C57BL / 6 x 129Sv bakgrund gavs 5 procent DSS i 7 dagar och injicerades IP med PBS (kontroll) eller klodronat-innehållande liposomer (klodronat) 4 dagar före behandlingen DSSoch på dagarna 0, 2, 4 och 6 under DSS behandlingen. (A) Kolon togs bort, fasta och snitt färgades med immunhistokemi för mogna makrofager (F4/80) och M2 makrofag markörer Argi. (B) Kvantifiering av F4/80 + och Argi + makrofager. Positivt färgade celler räknades genom två individer blind för experimentella tillstånd vid 40 gångers förstoring i 6 fält från 3 sektioner per mus och från 6 möss per grupp. * P <0,01.
Figur 2. MCSF makrofager uttrycka en klassiskt aktiveras fenotyp och mCSF makrofager behandlade med IL-4 uttrycka en alternativt aktiverad makrofag fenotyp. (A) I överensstämmelse med en klassiskt aktiverad fenotyp, mCSF makrofager producerar högre nivåer av kväveoxid som svar på lipopolysackarid, och kan mätas genom Griess-analysen, som detekterar sin nedströms metabolit, nitrit. De also producera en högre IL-12p70/IL-10 förhållande, vilket kan mätas genom ELISA. * P <0,01 för n = 3. (B) I överensstämmelse med en alternativt aktiverad fenotyp, vilket mCSF makrofager behandlade med IL-4 konstitutivt uttrycker YM1 och Argi, kan detekteras genom Western immunoblotting. Data är representativa för 3 oberoende experiment med liknande resultat.
Figur 3. Intravenös injicerade, ex vivo-härledda alternativt aktiverade makrofager trafik till kolon och minska tarminflammation. En F2 generationen vildtypmöss på en blandad C57BL / 6 × 129Sv bakgrunden fick 5% DSS i dricksvattnet i sex dagar. M1 och M2 makrofager injicerades IV på dag 0 och 4 under DSS behandlingen. (A) Kolon togs bort, fasta och snitt färgades med immunhistokemi för mogna makrofager (F4/80) och en M2 makrofag markör (Argi).Kvantifiering av makrofager för kontroll injicerade PBS möss (C), injicerades mössen med M1 makrofager (+ M1) och möss injicerade med M2 makrofager (+ M2) utförs genom att räkna positivt färgade celler vid 40 gångers förstoring i 6 fält från sektioner 3 / mus och från 6 möss per grupp. Räkning utfördes genom två individer blind för experimentell betingelse. (B) Sjukdom aktivitet övervakades och fick dagligen under behandling och är en tillsats poäng baserad på viktminskning, rektal blödning och minskad avföring konsekvens. * P <0,05 för n = 6 möss i 2 oberoende försök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofager är fagocytiska celler som spelar en viktig roll i immunsystemet. De är ansvariga för initiering av medfödda immunresponsen och rikta den förvärvade immunresponsen. Vanligtvis är klassiskt aktiverade makrofager aktiveras genom IFNy eller LPS och ansvarar för att eliminera patogener och montering ett inflammatoriskt svar 1. Omvänt är alternativt aktiverade makrofager, aktiverade med IL-4 eller IL-13 och spelar en roll i skräp eliminerande och omformning av vävnader under upplösningen av inflammation 1. Specialiserade makrofager i tarmen bibehåller sin bakteriedödande aktivitet men inte montera en pro-inflammatoriskt svar 2. Denna tolerans till förmån för flora och mat antigen möjliggör för avslut av material som bryter mot epitelbarriären utan att inleda ett olämpligt och potentiellt patologiska immunsvar 3. Aberrant kolon makrofagfunktion kan bidratill patologiska tillstånd, inklusive inflammatoriska tarmsjukdomar, colon irritabile, och kolorektal cancer 3-5. Makrofag fenotyp är beroende av den lokala mikromiljön så definiera sin roll i hälsa eller sjukdom kan vara en utmaning. Det protokoll som beskrivits här möjliggör makrofag utarmning från komplexet in vivo-miljö. Förutom att undersöka betydelsen av makrofager fenotyp in situ, kan fenotypiskt definierade polariserade makrofager härledas ex vivo från benmärg aspirat och adoptivt överföras till möss, med eller utan föregående utarmning av makrofager.
Klodronat-innehållande liposomer främja makrofag "självmords" och har använts för att utarma makrofager i en mängd vävnader 6. Makrofager fagocyterar klodronat-innehållande liposomer, vilka därefter bryts ned av lysosomala fosfolipaser frikopplar klodronat i cellen och inducera apoptos 12 12. Liposomer måste fördelas jämnt i lösning innan lastning i sprutan och innan injektion i musen, oberoende av administreringsväg eller målvävnad. PBS injektioner och injektion av PBS-innehållande liposomer krävs styr när utarmning av makrofager in vivo med klodronat-innehållande liposomer 7. PBS-innehållande liposomer verkar vara en bättre kontroll än PBS injektioner ensam. Det är dock viktigt att notera att medan vissa rapporter har med framgång använt PBS innehållande liposomer som en kontroll, vi, och andra, har rapporterat att PBS-innehållande liposomer kan tömma makrofager i vissa experimentella förhållanden 8, 9. Dessutom har liposomer enbart rapporterats hämma fagocytos temporärt 10. Makrofag utarmning av PBS-innehållande liposomer kan vara beroende av phagocytic förmåga och kan variera beroende på musstam, genetisk bakgrund, vävnad och / eller experimentella villkor. Användning av PBS-innehållande liposomer som en kontroll och deras effekt på makrofag utarmning i en specifik tillämpning måste bestämmas experimentellt. Därför rekommenderar vi att både PBS och PBS-innehållande liposomer användas som injektion kontroller under första experiment.
En kritisk faktor vid utformning av experiment makrofag utarmning är administrationsvägen av klodronat-innehållande liposomer. Vi har framgångsrikt riktat kolon makrofager hos möss med hjälp av intraperitoneal injektion 8. Andra har använt intrarektal administrering eller intravenös injektion 9, 11. Intrarektal och intraperitoneal administrering har både rapporterats att utarma cirka 50% av kolon makrofager medan intravenös injektion har rapporterats att utarma upp till 90% av makrofager från lamellenpropria 8, 9, 11. Vi valde att utföra intraperitoneala injektioner för att leverera klodronat innehållande liposomer på grund av enkelheten i tekniken och eftersom studier som liknar vår har med framgång använt denna administreringsväg 7. Om högre nivåer av utarmning i tjocktarmen krävs för ett experiment, kan intravenös injektion förbättra utarmning.
Administreringsväg är en viktig faktor för makrofager utarmning i olika vävnader. Intraperitoneala injektioner har använts för att utarma peritoneal, omentum, parathymic lymfkörtel, lever, mjälte och makrofager 12. Intravenösa injektioner har använts för att utarma makrofager i levern, mjälten och benmärgen 12. Intraventrikulär administrering av klodronat-innehållande liposomer har använts för att utarma perivaskulära och meningeala makrofager från lillhjärnan, hjärnan, och ryggmärgen 12. Intratrakealoch intranasal administrering av klodronat-innehållande liposomer har använts för att utarma alveolära makrofager. Slutligen har lokal administrering med framgång använts för att utarma testikulära och vitreal makrofager 12, 13. Effekten av makrofag utarmning i en målvävnad måste bestämmas experimentellt och valideras genom färgning vävnader genom immunhistokemi (figur 1 A) eller genom flödescytometri. I vissa fall kan det vara nödvändigt att öka makrofager avskrivningsbeloppet. De variabler som kan optimeras för att öka utarmning inkluderar ändra sträckningen av klodronat som innehåller liposomer administration, mängden klodronat-innehållande liposomer per injektion och / eller frekvens av injektion.
En viktig faktor i tolkningen av data när tömda makrofager med klodronat innehållande liposomer är att alla professionella fagocyter är uttömda, inklusive dendritiska celler. För att säkerställa att enbiologisk effekt makrofag-beroende, är kompletterande rekonstitution experiment som krävs. Härrör makrofager från benmärg aspirat är ett användbart verktyg för rekonstitution försök samt forskning undersöka makrofagfunktion. Vi har med framgång använt detta protokoll för in vitro-studier för att undersöka rollen av PI3K signalväg i den alternativa aktivering av makrofager 14. Det finns två kritiska steg i härledningen processen. För det första är vidhäftningen utarmning steg avgörande för att avlägsna adherenta celler från benmärgsaspirat, antingen kontaminerande mesenkymala celler eller mogna hematopoietiska celler. För det andra bör makrofag fenotyp bekräftas innan deras användning i experimentella procedurer. En modifiering av detta protokoll är att olika genetiska modeller kan användas för makrofag härledning och rekonstituering som medger undersökning av rollen av specifika gener i makrofag-fenotyp och funktion in vitro end. in vivo. För rekonstitution experiment är intravenös injektion är den vanligaste sättet för makrofag leverans men både cell mängd och frekvens injektion kan optimeras för en särskild undersökning. Retro-orbital injektioner kan användas för beredning och bör ge liknande resultat. Att notera är makrofager rekryteras till inflammationsställen och deras fenotyp kan ändras som svar på signaler från deras mikromiljö. Slutligen kan adoptiv överföring vara tillräcklig för att avge makrofager till en målvävnad, men innan uttömning av inhemska vävnadsmakrofager kan vara nödvändigt för att tillåta fastställandet av adoptivt överförd makrofager.
Protokollet som presenteras här har ett antal fördelar jämfört med befintliga metoder. En alternativ metod att tömma makrofager är att använda det villkorade ablation transgena möss, CD11b-DTR 15. I denna mus, är den humana difteritoxin (DT)-receptorn uttrycks under kontroll oF makrofag-specifika CD11b promotor. Detta ger toxin känslighet och DT injektion orsakar makrofag utarmning 15. Men andelen makrofag utarmning är större i denna modell, erbjuder klodronat-innehållande liposomer två viktiga fördelar. Klodronat-innehållande liposomen injektion kan användas för att utarma makrofager i någon musstam. Makrofager kan utarmas från genetiskt modifierade möss utan den tid och kostnader som krävs för återkorsning som krävs för att använda CD11b-DTR musen metoden. Av samma anledning kan makrofager vara uttömda från möss på någon bakgrund, vilket är en viktig faktor om modellen utreds kräver ett unikt eller blandad bakgrund. På samma sätt undviker adoptiv transfer experiment med ex vivo makrofager från en mus linje några problem med alloreaktivitet.
De protokoll som beskrivs här kan användas till en mängd olika frågeställningar. Vi har använt eese tekniker för att studera rollen av makrofager i inflammation i kolon. Klodronat-innehållande liposommedierad makrofag utarmning och adoptiv överföring av makrofager kan användas för att rikta ett stort antal vävnader. Makrofag adoptiv transfer kan användas för att rekonstruera utarmade makrofager eller direkta makrofager till webbplatser för inflammation i genetiska eller inducerbara modeller av inflammation. Detta protokoll ger också en plattform för att undersöka makrofagriktat läkemedel vid sjukdomstillstånd modeller där makrofager eller deras polarisering förknippas med patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en "Grant till förmån för forskning" från Crohns och kolit Foundation of Canada till LMS, som stöds av en kanadensisk Association of Gastroenterology / kanadensiska Association of Health Research / Crohns och kolit Foundation of Kanada New Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
|||
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
