Summary
Les macrophages jouent un rôle central dans l'homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les macrophages
Abstract
Les macrophages sont des acteurs essentiels dans la réponse immunitaire innée au défi infectieuse ou d'une blessure, les initiateurs de la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. Macrophage dysfonctionnement peut conduire à une incapacité de monter une réponse immunitaire appropriée et en tant que telle, a été impliqué dans de nombreux processus pathologiques, y compris les maladies inflammatoires de l'intestin. Les macrophages afficher phénotypes polarisés qui sont largement divisés en deux catégories. Macrophages activés Classiquement, activées par la stimulation avec IFNy ou LPS, jouent un rôle essentiel dans la réponse au défi alors que les macrophages bactérienne alternativement activés, activée par l'IL-4 ou d'IL-13, participer à des débris de balayage et le remodelage des tissus et ont été impliqués dans la résolution la phase de l'inflammation. Lors d'une réponse inflammatoire in vivo, les macrophages se trouvent au milieu d'un mélange complexe d'infiltrer les cellules immunitaires et peuvent participer en exacerbant ou résolvinel'inflammation g. Pour définir le rôle des macrophages in situ dans un modèle animal entier, il est nécessaire d'examiner l'effet de l'épuisement des macrophages à l'environnement complexe. Pour poser des questions sur le rôle du phénotype des macrophages in situ, phénotypiquement définis macrophages polarisés peuvent être dérivées ex vivo, à partir de ponctions de moelle osseuse et rajoutées à la souris, avec ou sans l'épuisement préalable des macrophages. Dans le protocole présenté ici clodronate liposomes contenant, par rapport aux témoins injectés PBS, ont été utilisés pour épuiser les macrophages du côlon au cours du sulfate de sodium dextran (DSS) de colite induite chez la souris. En outre, les macrophages ont été polarisées dérivée ex vivo et transféré à des souris par injection intraveineuse. Une mise en garde de cette approche est que les liposomes contenant du clodronate épuiser toutes les phagocytes professionnels, y compris les deux cellules dendritiques et les macrophages afin d'assurer l'effet observé par l'épuisement est macrophages spécifique, la reconstitution ophénotype f par transfert adoptif de macrophages est nécessaire. L'épuisement des macrophages systémique chez la souris peut également être obtenu par rétrocroisement souris sur un fond CD11b-DTR, qui est une excellente approche complémentaire. L'avantage du clodronate liposome contenant médiée par l'épuisement, c'est qu'il ne nécessite pas le temps et les frais engagés pour les souris et rétrocroisement il peut être utilisé chez la souris indépendamment de l'origine des souris (C57BL / 6, BALB / c, ou d'origine mixte ).
Protocol
1. Les macrophages appauvrissant la couche d'Utilisation clodronate liposomes contenant
- Les liposomes sont conservés à 4 ° C. Deux heures avant l'injection, retirez le clodronate contenant des liposomes, PBS contenant des liposomes, ou PBS stérile (commande d'injection) du réfrigérateur afin de leur permettre de s'acclimater à la température ambiante (18 ° C).
- Inverser les tubes contenant des liposomes 8-10 fois pour assurer une répartition avant même de charger 200 pi dans une seringue de 1 ml. Fixer une aiguille de calibre 26 vers le haut de la seringue.
- En utilisant votre main gauche, nuque la souris juste au-dessous des oreilles détenant assez de peau pour immobiliser la tête et des membres.
- Inclinez la souris de façon à sa tête est légèrement vers le sol afin organes internes s'éloigner du site d'injection, qui est situé dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen.
- Rouler la seringue entre les paumes de vos mains et la retourner 6 fois pour répartir uniformément la solution de liposomes avant l'injection. <li> Insérer l'aiguille dans la partie inférieure droite de l'abdomen de la souris à un angle de 30-40. Injecter 200 ul de solution de liposomes ou de PBS.
- Au cours d'une inflammation induite par le modèle, comme la colite induite par DSS, injecter souris 4 jours précédant l'apparition de l'inflammation expérimentale pour assurer l'épuisement des macrophages résidents et tous les 2 jours pendant le protocole d'épuiser nouveaux macrophages infiltrant.
- A la fin de l'expérience, ainsi que des analyses expérimentales prévues, éliminer les tissus à partir du site d'intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde pour confirmer l'épuisement des macrophages par coloration immunohistochimique.
2. Dérivation des macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse
- La moelle osseuse de souris entre 8 et 12 semaines d'âge fournit le plus haut rendement de la moelle osseuse macrophages dérivés. Euthanasier la souris, posez-le sur le dos, et cerner ses pattes, étirant ses membres autant que possible.
- Travailler dans un stérile hood, enlever les fémurs et les tibias, coupant le muscle autant que possible.
- La moelle des os en utilisant Flush IMDM avec 10% FCS chargé dans une seringue de 5 ml munie d'une aiguille de calibre 26.
- Diluer la moelle osseuse aspire à 40 ml en IMDM avec 10% de FCS, les cellules de lieu dans un flacon de 75 cm2 de culture tissulaire, et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 4 heures. Cette étape supprime adhérentes des cellules mésenchymateuses ou des macrophages matures à partir de progéniteurs hématopoïétiques.
- Surnageant de culture contenant de transfert non-adhérentes progéniteurs dans un tube conique de 50 ml Falcon et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm.
- Resuspendre culot cellulaire dans 5 ml IMDM, 10% de SVF et de compter les cellules nucléées en diluant 1 suspension cellulaire dans 20 dans l'acide acétique. Cette procédure lyse toutes les cellules dont les globules rouges et les noyaux restants peuvent être comptées sur un hématimètre.
- Resuspendre les cellules à une concentration de 0,5 × 10 6 cellules / ml dans un milieu complet; IMDM, 10% de FCS, 150 monothioglycérol uM (MTG), et 10 ng / ml soit MCSF, GM-CSF, ou de l'IL-3. MCSF macrophages dérivés sont classiquement macrophages activés alors que les macrophages GM-CSF ou IL-3-dérivés sont alternativement activés.
- Remplacer moyenne au 4 e jour, la filature par les cellules non adhérentes et de les retourner dans le ballon, et à 7 jours, en rejetant les cellules non adhérentes.
- En outre, l'IFNy (10 ng / ml) ou de l'IL-4 (10 ng / ml) peuvent être ajoutés à des flacons contenant des cellules dérivées de MCSF au jour 7 de macrophages fausser à un. Classique activé ou d'un phénotype encore activé, respectivement Incuber les cellules pendant 3 jours de plus.
- Au jour 10, retirer le support et soulevez les cellules hors du flacon de culture tissulaire en utilisant la dissociation cellulaire tampon (Gibco-BRL). Placer 5 ml de tampon sur les cellules pendant 5 min à température ambiante (18 ° C) puis taper le côté du ballon avec le talon de la paume fermement plusieurs fois. Faire en sorte que les cellules ont soulevé du flacon en examinant le ballon sous uneMicroscope. Pipeter remis en suspension les cellules dans un tube de 15 ml conique Falcon et laver la fiole avec un supplément de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscine et centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 × g.
- Compter les cellules viables au moyen d'un hémocytomètre et remettre en suspension à une concentration de 10 7 cellules / ml dans du PBS stérile pH 7,4. Les macrophages sont prêtes pour l'injection à des souris.
- Réserve 1,0 × 10 6 macrophages pour l'évaluation du phénotype des macrophages. Macrophages activés Classiquement stimulées par les niveaux élevés de lipopolysaccharide sécrètent de l'oxyde nitrique et les niveaux d'IL-12p70 et basse de l'IL-10 par rapport aux macrophages activés alternativement. Macrophages activés alternativement expriment constitutivement YM1 et l'arginase I (Argi), qui peut être détecté par Western immunoblot.
3. Tranferring macrophages à des souris
- Remettre en suspension dans les macrophages du PBS stérile à une concentration de 10 7 cellules / ml. Cela permet pour un end'injection intraveineux de 10 6 macrophages dans un volume total de 100 pi, ce qui est un volume qui peut être en toute sécurité et confortablement injectées à des souris par la veine de la queue.
- Souris chaude avec un coussin chauffant ou sur les genoux de la chaleur pendant 5-10 min pour dilater la veine de la queue. Surveiller la souris en tout temps pour des signes d'hyperthermie.
- Transfert de la souris à un dispositif de retenue qui permet d'accéder aux veines de la queue.
- Tournez la queue 90 ° de sorte que la veine est orientée vers le haut. Les veines de fonctionner latéralement vers le bas des deux côtés de la queue et soit la veine peut être utilisé.
- Nettoyer le site d'injection avec un tampon imbibé d'alcool et lentement, injecter 100 ml (10 6 macrophages) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26 ou 28. Insérez l'aiguille avec le côté conique vers le haut et à un léger angle, presque parallèle à la veine.
- Si l'aiguille est insérée correctement aucune résistance devrait se faire sentir et la veine devrait devenir claire après l'injection. Si l'aiguille n'est pas dans laveine, la queue sera renflement. Si cela se produit, retirez l'aiguille et essayez à nouveau à proximité de la dernière tentative ou dans la veine des autres. Une nouvelle aiguille doit être utilisée pour chaque injection, la queue est dure et les aiguilles deviennent ternes rapidement lors de l'injection veine de la queue.
- Après l'injection, retirez l'aiguille, appliquer une légère pression au site d'injection jusqu'à ce que le saignement s'arrête, et de surveiller la souris pour un 5min supplémentaires pour veiller à ce que le saignement a cessé.
- Répéter les injections macrophages tous les 4 jours pour assurer une livraison continue des macrophages polarisés au cours de la procédure expérimentale.
- A la fin de l'expérience, ainsi que des analyses expérimentales, éliminer les tissus à partir du site d'intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde ou de formol pour confirmer la livraison effective des macrophages polarisés par coloration immunohistochimique.
4. Les résultats représentatifs
Le nombre et le phénotype des macrop résidentHages dans n'importe quel tissu donné dépend sur le tissu en cours d'examen et va changer lors de l'infection ou l'inflammation. De même, la capacité du clodronate liposomes contenant d'épuiser les macrophages à partir d'un tissu dépendra de la voie d'administration et la prestation efficace du tissu cible. L'injection intrapéritonéale des résultats des liposomes contenant du clodronate à une diminution de F4/80 + macrophages dans le côlon de la souris pendant DSS-colite induite en évidence par la coloration immunohistochimique pour le marqueur des macrophages, F4/80 (figure 1A). Coloration histologique peut également être utilisé pour déterminer les différences quantitatives en nombre des macrophages et du phénotype dans des coupes de tissus. Figure 1B montre qu'en moyenne 55% des macrophages est appauvri par le clodronate liposomes contenant par rapport à aucun épuisement détecté dans deux points de la souris lorsque les souris sont injectées avec PBS seul comme un contrôle de l'injection. Chaque valeur est déterminée par comptage F4/80 et Argi tachecellules éd positifs dans des coupes de tissus de série à partir de 6 souris à 3 points, en 3 sections par la souris avec comptage étant effectué par deux individus aveuglés à l'état expérimental. Ces résultats démontrent que les injections intra-péritonéales de liposomes clodronate épuiser les macrophages du côlon chez des souris.
Dérivation des macrophages de la moelle osseuse en présence de facteurs de croissance différents des macrophages rendements qui sont classiquement activés (MCSF-dérivé ou MCSF dérivé et traitée avec IFNy) ou encore activé (GM-CSF ou IL-3-dérivé ou MCSF dérivés et traitée avec de l'IL-4). Flushing moelle osseuse à partir de 2 fémurs et tibias 2 à partir d'une souris de 8 semaines donne généralement de 6 × 10 7 cellules nucléées par la souris et les rendements de 8 × 10 6 MCSF macrophages dérivés, 10 × 10 6 GM-CSF macrophages dérivés, ou 12 × 10 6 IL-3-macrophages dérivés. La figure 2A montre le nitrite et le rapport IL-12p70/IL-10 dans les macrophages supernatants traitée avec un lipopolysaccharide pendant 24 heures la figure 2B montre une analyse par transfert de type Western de 0,5 × 10 6 macrophages de MCSF + / -. IL-4 conditions de dérivation sondé avec des anticorps pour les marqueurs des macrophages activés, alternativement, des Argi YM1, ou avec la GAPDH comme un le chargement de contrôle. Ces données démontrent que la moelle osseuse macrophages dérivés peuvent être faussés à un phénotype polarisé au cours de dérivation.
Un transfert effectif de ex vivo des macrophages dérivés polarisées à un tissu dépend de la voie d'administration et l'accès à du tissu. Au cours de DSS-colite induite par les macrophages injecté par voie intraveineuse se rendre sur le site de l'inflammation et les macrophages alternativement activés réduire la sévérité de la maladie. Figure 3A montre le nombre total des macrophages et le nombre de macrophages Argi + (alternativement activé) comptés dans les coupes histologiques de souris injectées avec des polarisée moelle osseuseDérivé des macrophages. L'impact du transfert des macrophages polarisés au niveau du côlon au cours DSS-colite induite est représenté par l'indice activité de la maladie, un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué (figure 3B). Ces résultats démontrent que ex vivo dérivés, les macrophages adoptive transférés peuvent le trafic au niveau du côlon et de l'inflammation induite par l'impact. Macrophages M1 n'ont pas d'impact alors que l'inflammation des macrophages M2 réduire de façon significative l'indice d'activité de la maladie.
Figure 1. Le clodronate liposomes contenant effectivement épuiser F4/80 + et + F480 + Argi cellules dans deux points de souris in vivo. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × fond 129SV ont été donnés DSS 5% pendant 7 jours et IP injecté avec du PBS (contrôle) ou le clodronate liposomes contenant (clodronate) 4 jours avant le traitement au MASet aux jours 0, 2, 4, et 6 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et le marqueur des macrophages M2, Argi. (B) La quantification de F4/80 + et + de Argi macrophages. Cellules colorées positivement ont été comptés par deux individus aveuglés à l'état expérimental à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. * P <0,01.
Figure 2. MCSF macrophages dérivés exprimer un phénotype classique activé et MCSF macrophages dérivés traités avec de l'IL-4 exprimer un phénotype des macrophages activés alternativement. (A) Conformément à un phénotype classique activé, MCSF macrophages dérivés de produire des niveaux plus élevés d'oxyde nitrique en réponse aux lipopolysaccharides et peut être mesurée par le dosage de Griess, qui détecte son aval métabolite, le nitrite. Ils also produire un rapport plus élevé IL-12p70/IL-10, qui peut être mesurée par la méthode ELISA. * P <0,01 pour n = 3. (B) Conformément à un phénotype alternativement activée, MCSF macrophages dérivés traités avec de l'IL-4 YM1 expriment constitutivement et Argi, qui peut être détectée par immuno-Ouest. Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes avec des résultats similaires.
Figure 3. Injecté par voie intraveineuse, ex vivo dérivé alternativement activé la circulation des macrophages dans le côlon et réduire l'inflammation intestinale. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × 129SV fond ont été donnés 5 DSS% dans leur eau potable pendant six jours. Macrophages M1 et M2 ont été injecté par voie IV aux jours 0 et 4 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et un marqueur de macrophages M2 (Argi).La quantification des macrophages pour les souris injectées PBS contrôle (C), les souris injectées avec des macrophages M1 (M1 +) et des souris injectées avec des macrophages M2 (M2 +) ont été réalisées par comptage des cellules colorées positivement à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. Le comptage est effectué par deux individus aveuglés à l'état expérimental. (B) activité de la maladie a été contrôlée et a marqué tous les jours pendant le traitement et a réalisé un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué. * P <0,05 pour n = 6 souris dans 2 expériences indépendantes.
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Discussion
Les macrophages sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle important dans le système immunitaire. Ils sont responsables pour initier la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. En règle générale, les macrophages activés classique sont activés par IFNy ou LPS et sont responsables de l'élimination des pathogènes et le montage d'une réponse inflammatoire 1. A l'inverse, les macrophages activés alternativement sont activés par l'IL-4 ou d'IL-13 et de jouer un rôle dans les débris de balayage et le remodelage des tissus au cours de la résolution de l'inflammation 1. Macrophages spécialisés dans l'intestin conservent leur activité bactéricide mais ne pas monter un 2 réponse pro-inflammatoire. Cette tolérance à la flore bénéfique et permet d'antigène alimentaire pour le dédouanement du matériel que les violations de la barrière épithéliale, sans l'ouverture d'une réponse inappropriée et potentiellement pathologique immunitaire 3. Aberrant la fonction des macrophages du côlon peut contribuerà des conditions pathologiques, y compris les maladies inflammatoires de l'intestin, le syndrome du côlon irritable et de cancer colorectal 3-5. Phénotype des macrophages est dépendante de la micro-environnement local afin de définir leur rôle dans la santé ou la maladie peut être difficile. Le protocole décrit ici permet de l'épuisement des macrophages du complexe dans un environnement in vivo. En outre, d'examiner le rôle du phénotype des macrophages in situ, phénotypiquement définis macrophages polarisés peuvent être dérivées ex vivo à partir ponctions de moelle osseuse et adoptive transféré à des souris, avec ou sans l'épuisement préalable des macrophages.
Le clodronate liposomes contenant de promouvoir des macrophages "suicide" et ont été utilisés pour épuiser les macrophages dans une variété de tissus 6. Les macrophages phagocytent clodronate contenant des liposomes, qui sont ensuite dégradées par des phospholipases lysosomiales libérant le clodronate dans la cellule et 12 induisant l'apoptose 12. Les liposomes doit être réparti uniformément dans la solution avant le chargement dans la seringue avant l'injection et à la souris, quelle que soit la voie d'administration ou le tissu cible. PBS injections et l'injection de PBS contenant des liposomes sont tenus contrôle quand appauvrissant les macrophages in vivo avec le clodronate liposomes contenant 7. PBS-liposomes contenant semble être un meilleur contrôle de PBS injections seul. Cependant, il est important de noter que tandis que certains rapports ont utilisé avec succès PBS contenant des liposomes comme un contrôle, nous, et d'autres, ont rapporté que PBS contenant des liposomes peut épuiser les macrophages dans certaines conditions expérimentales 8, 9. En outre, les liposomes seuls ont été signalés à inhiber la phagocytose temporairement 10. L'épuisement des macrophages par PBS-liposomes contenant peut être dépendant de pla capacité hagocytic et peuvent différer selon la souche de souris, le patrimoine génétique, de tissus et / ou l'état expérimental. L'utilisation de PBS contenant des liposomes comme un contrôle et leur effet sur l'épuisement des macrophages dans une application spécifique doit être déterminée expérimentalement. Par conséquent, nous recommandons que les liposomes à la fois PBS et PBS contenant être utilisés comme témoins au cours d'injection premières expériences.
Un examen critique de la conception d'expériences d'épuisement des macrophages est la voie d'administration de clodronate liposomes contenant. Nous avons réussi à cibler les macrophages du côlon chez des souris en utilisant une injection intrapéritonéale 8. D'autres ont utilisé l'administration intra-rectale ou intraveineuse injections 9, 11. L'administration intrarectale et intrapéritonéale ont tous deux été signalés à épuiser environ 50% des macrophages du côlon alors que l'injection par voie intraveineuse a été signalé à éliminer jusqu'à 90% des macrophages de la laminapropria 8, 9, 11. Nous avons choisi de réaliser des injections intrapéritonéales d'offrir le clodronate liposomes contenant en raison de la simplicité de la technique et parce que des études similaires à la nôtre ont utilisé avec succès cette voie d'administration 7. Toutefois, si des niveaux plus élevés d'épuisement dans le côlon sont nécessaires pour une expérience, une injection intraveineuse peut améliorer l'épuisement.
Voie d'administration est un facteur important de l'épuisement des macrophages dans les différents tissus. Injections intra-péritonéales ont été utilisés pour épuiser péritonéale, épiploon, les ganglions lymphatiques parathymic, le foie et les macrophages spléniques 12. Les injections intraveineuses ont été utilisées pour épuiser les macrophages dans le foie, la rate, et 12 la moelle osseuse. L'administration intraventriculaire de clodronate contenant des liposomes a été utilisé pour épuiser les macrophages périvasculaires et méningée du cervelet, le cerveau et la moelle épinière 12. Intratrachéaleet l'administration intranasale de clodronate contenant des liposomes ont été utilisés pour appauvrir les macrophages alvéolaires. Enfin, l'administration locale a été utilisée avec succès pour épuiser les macrophages testiculaires et vitréenne 12, 13. L'efficacité de l'épuisement des macrophages dans le tissu cible doit être déterminée expérimentalement et validée par la coloration des tissus par immunohistochimie (figure 1A) ou par cytométrie de flux. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'augmenter le taux de déplétion des macrophages. Les variables qui peuvent être optimisés pour augmenter l'épuisement comprennent la modification du tracé du clodronate contenant l'administration de liposomes, le montant du clodronate liposomes contenant par injection, et / ou la fréquence d'injection.
Une considération importante dans l'interprétation des données lorsque les macrophages qui appauvrissent la couche avec le clodronate liposomes contenant, c'est que tous les phagocytes professionnels sont épuisés, y compris les cellules dendritiques. Pour veiller à ce qu'uneffet biologique est macrophages dépendant, des expériences de reconstitution complémentaires sont nécessaires. Issu de macrophages ponctions de moelle osseuse est un outil utile pour des expériences de reconstitution ainsi que la fonction des macrophages de recherche de l'enquête. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour des études in vitro explorant le rôle de la voie de la PI3K de signalisation dans l'activation des macrophages de remplacement 14. Il ya deux étapes cruciales dans le processus de dérivation. Tout d'abord, étape de déplétion adhésion est essentielle pour éliminer les cellules adhérentes de ponctions de moelle osseuse, soit contaminer les cellules mésenchymateuses ou des cellules hématopoïétiques matures. Deuxièmement, le phénotype des macrophages doivent être confirmés avant leur utilisation dans des procédures expérimentales. Une modification de ce protocole est que les différents modèles génétiques peuvent être utilisées pour la dérivation des macrophages et la reconstitution, permettant enquête sur le rôle de gènes spécifiques dans le phénotype des macrophages et de la fonction in vitro uned in vivo. Pour des expériences de reconstitution, l'injection intraveineuse est le mode le plus commun de la prestation des macrophages, mais la quantité de cellules et de la fréquence d'injection peuvent être optimisés pour une étude spécifique. Rétro-orbitaires injections peuvent être utilisés pour la reconstitution et devrait donner des résultats similaires. Fait à noter, les macrophages sont recrutés à des sites d'inflammation et leur phénotype peut être changé en réponse aux signaux de leur microenvironnement. Enfin, le transfert adoptif peut être suffisante pour fournir des macrophages à un tissu cible, mais l'épuisement préalable des macrophages tissulaires résidants peuvent être nécessaires pour permettre l'établissement des macrophages adoptive transférés.
Le protocole présenté ici a un certain nombre d'avantages par rapport aux méthodes existantes. Une autre méthode pour épuiser les macrophages est d'utiliser l'ablation conditionnelle de la souris transgénique, CD11b-DTR 15. Dans cette souris, la toxine de l'homme contre la diphtérie (DT) récepteur est exprimé sous la commande of le promoteur CD11b macrophages spécifique. Cela confère sensibilité à la toxine et l'injection provoque une déplétion des macrophages DT 15. Bien que l'épuisement des macrophages pourcentage est supérieur dans ce modèle, le clodronate liposomes contenant offre deux avantages importants. Le clodronate contenant injection de liposomes peuvent être utilisés pour épuiser les macrophages dans toute souche de souris. Les macrophages peuvent être épuisées à partir de souris génétiquement modifiés sans le temps et le coût requis pour rétrocroisement qui est nécessaire pour utiliser la méthode de la souris CD11b-DTR. Pour la même raison, les macrophages peuvent être épuisées à partir de souris sur n'importe quel fond, qui est une considération importante si le modèle objet d'une enquête nécessite une expérience unique ou mixte. De même, les expériences de transfert adoptif utilisant ex vivo des macrophages dérivés d'une lignée de souris permet d'éviter les problèmes avec alloréactivité.
Les protocoles décrits ici peuvent être appliqués à une variété de questions de recherche. Nous avons utilisé eese des techniques pour étudier le rôle des macrophages dans l'inflammation dans le côlon. L'épuisement des macrophages clodronate contenant des liposomes médiation et le transfert adoptif de macrophages peuvent être utilisées pour cibler un grand nombre de tissus. Transfert des macrophages adoptive peut être utilisé pour reconstituer les macrophages épuisés ou des macrophages aux sites d'inflammation dans les modèles génétiques ou inductible de l'inflammation. Ce protocole prévoit également une plate-forme pour l'examen des macrophages thérapies ciblées dans les modèles de maladies où les macrophages ou leur polarisation sont associés à la pathologie.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une «subvention à l'aide de la recherche» de la maladie de Crohn et la colite Fondation du Canada pour LMS, qui est soutenu par une Association canadienne de gastroentérologie / Association canadienne de la Santé s de recherche / maladie de Crohn et la colite Fondation des Prix du Canada de nouveau chercheur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | ||
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 | |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 | |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 | |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA | |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 | |
Table 1. Specific reagents used in this protocol. |
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References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
