Den effektive solid-fase peptidsyntese av en functionalized bis-peptid trimer benytte et "sikkerhetsnett fange" cleavage prosedyren fra HMBA harpiks er beskrevet.
I 1962 publiserte RB Merrifield den første prosedyren bruker fast-fase peptidsyntese som en roman rute til effektivt syntetisere peptider. Denne teknikken raskt viste seg fordelaktig over sin løsning-fase forgjenger i både tid og arbeidskraft. Forbedringer om natur solid støtte, de beskytter gruppene sysselsatte og koblingen metoder som benyttes i løpet av de siste fem tiårene har bare økt nytten av Merrifield opprinnelige system. I dag, pioner bruk av Boc-basert beskyttelse og base / nucleophile cleavable harpiks strategi eller Fmoc-basert beskyttelse og syrlig cleavable harpiks strategi, av RC Sheppard, blir mest brukt for syntesen av peptider 1.
Inspirert av Merrifield solide støttet strategien, har vi utviklet en Boc / tert-butyl fast-fase syntese strategi for montering av functionalized bis-peptider 2, som er beskrevet her. Bruken av fast-fase syntese sammenlignet to løsning-fase metodikk er ikke bare en fordel både i tid og arbeid som beskrevet av Merrifield 1, men også gir større letthet i syntesen av bis-peptid biblioteker. Den syntese som vi viser her inkorporerer en endelig cleavage scene som bruker en to-trinns "sikringen" mekanisme for å frigjøre functionalized bis-peptid fra harpiksen fra diketopiperazine formasjon.
Bis-peptider er stive, spiro-stige oligomerer av bis-aminosyrer som er i stand til å posisjonere funksjonalitet i en forutsigbar og designable måte, styrt av type og stereokjemi av monomere enheter og tilkobling mellom hver monomer. Hver bis-aminosyre er en stereochemically ren, syklisk stillaset som inneholder to aminosyrer (en karboksylsyre med en α-amin) 3,4. Vårt laboratorium undersøker nå potensialet av funksjonelle bis-peptider over et bredt spekter av områder, inkludert katalyse, protein-protein interaksjoner og nanomaterials.
Den syntetiske tilnærmingen presenteres her gir en metode for syntese av functionalized bis-peptider fra bis-aminosyre byggesteinene som bruker vanlige SSD-fase peptidsyntese teknikker. Monomer syntese av disse "Pro4" byggeklosser fra trans-4-hydroxyproline 3 er svært skalerbar og har blitt vellykket gjennomført til hydantoin scenen på en 600 mmol (234 g) skala (upublisert). Når monomerer er i hånd, gir bruk av solid-fase teknikker en raskere metode for bis-peptidsyntese enn vår nåværende løsning-fase metodikk 4 ved å eliminere behovet for reaksjonen arbeids-ups og mellomliggende renselser.
Hovedutfordringen i fast-fase syntese er diagnostisering syntetisk fremgang og problemløsning siden ingen mellomprodukter blir isolert. Dette har ført til utvikling av mange kolorimetriske tester inkludert de å finne ut om frie aminer (Kaiser Test 10) eller gratis hydroxyls (Methyl Red Test 7) er utsatt på harpiks. Dessverre er det mest brukte Kaiser Test 10 ikke gjelder generelt i vår fast-fase syntese skyldes nesten utelukkende bruk av sekundære aminer eller aminer festet til en kvarternær karbon. Andre alternativer for vurdering på HMBA harpiks omfatte test splittelsene som bruker en nucleophile eksempel hydrazin 11, kvantitativ Fmoc spalting overvåket av UV / Vis 1,11, og fangst og analysere innkommende aktivert forbindelser.
En annen oversett problem i fast-fase syntese er den repeterende natur syntetiske skritt som kreves av operatøren. Med dette er tankene, forfatterne sterkt anbefaler bruk av et regneark eller sjekkliste når du utfører noen manuell fast-fase peptidsyntese.
Den så lett i bruk bis-peptider for fast-fase syntese forhold til vanlige α-aminosyrer inkluderer potensialet for vanskeligere koblinger grunn steric hindrance, behovet for on-resin diketopiperazine nedleggelser, og samtidig deprotections (BOC / TBU; Cbz / TBU). En annen så lett ligger i å oppnå kvantitativ utgivelse fra harpiksen å bruke denne "sikringen" metode i forhold til mer konvensjonelle midler. Med disse faktorene i bakhodet, er det meget mulig at ytterligere optimalisering av denne metoden kan oppnås og dagens innsats er i gang i vår gruppe for å forbedre metoden presentert her.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dr. Zachary Z. Brown og Jennifer Alleva for den første utviklingen av dette fast fase syntese teknikk og Matthew FL Parker for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet støttes av Forsvarets Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) og Horst Witzel Fellowship Award støttet av Cephalon, Inc.
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
HMBA-Am Resin | NovaBiochem | 855018 | |
MSNT | NovaBiochem | 851011 | |
NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
Anhydrous DCM | Acros | 34846 | Carcinogenic |
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
Anhydrous DMF | Acros | 34843 | Flammable, Toxic |
HOAt | GenScript | C01568 | |
DIC | Acros | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
TIPS | Acros | 21492 | Flammable, Toxic |
Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
NMP | Acros | 36438 | Toxic |
DMAP | NovaBiochem | 851055 | Toxic |
Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher | D1281 | |
SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
LCMS | Agilent | 1200 Series | |
Semi-Prep LC | Hewlett Packard | 1100 Series | |
Lyophilizer | Labconco | 7934027 | |
Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
Argon | Airgas | AR PP300CT |