Summary
Den effektive solid-fase peptidsyntese av en functionalized bis-peptid trimer benytte et "sikkerhetsnett fange" cleavage prosedyren fra HMBA harpiks er beskrevet.
Abstract
I 1962 publiserte RB Merrifield den første prosedyren bruker fast-fase peptidsyntese som en roman rute til effektivt syntetisere peptider. Denne teknikken raskt viste seg fordelaktig over sin løsning-fase forgjenger i både tid og arbeidskraft. Forbedringer om natur solid støtte, de beskytter gruppene sysselsatte og koblingen metoder som benyttes i løpet av de siste fem tiårene har bare økt nytten av Merrifield opprinnelige system. I dag, pioner bruk av Boc-basert beskyttelse og base / nucleophile cleavable harpiks strategi eller Fmoc-basert beskyttelse og syrlig cleavable harpiks strategi, av RC Sheppard, blir mest brukt for syntesen av peptider 1.
Inspirert av Merrifield solide støttet strategien, har vi utviklet en Boc / tert-butyl fast-fase syntese strategi for montering av functionalized bis-peptider 2, som er beskrevet her. Bruken av fast-fase syntese sammenlignet to løsning-fase metodikk er ikke bare en fordel både i tid og arbeid som beskrevet av Merrifield 1, men også gir større letthet i syntesen av bis-peptid biblioteker. Den syntese som vi viser her inkorporerer en endelig cleavage scene som bruker en to-trinns "sikringen" mekanisme for å frigjøre functionalized bis-peptid fra harpiksen fra diketopiperazine formasjon.
Bis-peptider er stive, spiro-stige oligomerer av bis-aminosyrer som er i stand til å posisjonere funksjonalitet i en forutsigbar og designable måte, styrt av type og stereokjemi av monomere enheter og tilkobling mellom hver monomer. Hver bis-aminosyre er en stereochemically ren, syklisk stillaset som inneholder to aminosyrer (en karboksylsyre med en α-amin) 3,4. Vårt laboratorium undersøker nå potensialet av funksjonelle bis-peptider over et bredt spekter av områder, inkludert katalyse, protein-protein interaksjoner og nanomaterials.
Protocol
1. Oppsett
- Reaksjonen set-up for solid-fase syntese er en polypropylen filter patron eller glass reaktor som er koblet via polypropylen rør til en lukket filtrering kolbe under vakuum som vist i Figur 1. Reaksjonen kan blandes med en magnetisk oppsikt baren eller ved boblende nitrogen gjennom reaktoren.
- En gass manifold koblet til en Argon sylinder utstyrt med en tørking rør og olje bubbler anbefales også som det lar reaksjonen fartøy som skal finnes under en inert atmosfære og tillater fjerning av reagenser fra forseglede containere.
- Alle operasjoner er utført i en avtrekkshette og riktig personlig verneutstyr (beskyttelsesbriller, labfrakk og nitrilhansker) er påkrevd.
2. Legge Første Bis-Peptide Gå over Resin
- Vei 114 mg HMBA-AM Resin (0,88 mmol / g lasting, 100 mikromol) i 8 ml reaksjon fartøy og legge magnetisk oppsikt bar. Cap toppen av the fartøy med en gummi septum og purge røret med argon i minst 5 minutter.
- I mellomtiden, veier 117,3 mg av sammensatte 1 av Figur 3 (586,63 g / mol, 2eq) og 59,2 mg 1 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazole (MSNT, 296.0 g / mol, 2eq) til en 15 mL disponibel sentrifugerør og oppløses i 2 ml vannfri diklormetan (DCM). Legg 24 mL av 1-methylimidazole (NMI, 80,81 ml / mol, 3eq) til løsning og bland til det er helt oppløst.
- Overfør aktivert løsningen på reaksjonen fartøyet via sprøyte og la røre i henhold argon natten (~ 10 timer).
- Fjern septum og tøm reaksjonsblandingen. Vask harpiksen med DCM (5x) og dimetylformamid (DMF) (5x). Utfør "metyl rødt test" beskrevet i kapittel 10.1 for å vurdere graden av harpiks lasting. Dersom resin forblir rødt under metyl rødt test skritt da 2,2 og 2,3 bør gjentas. En gul farge, som indikerer en negativ metyl rødt test, er foretrukket;kan imidlertid siden eventuelle gjenværende hydroksylgrupper vil være begrenset i neste trinn, en litt positivt resultat (lys oransje kvae farge) være akseptabelt.
3. Deprotection av First Bis-peptid og Samtidig Resin Capping
- Tilsett 1 mL DCM til reaksjonen fartøyet deretter tilsett 1 ml 33% hydrogenbromid i eddiksyre dropwise over 30 sekunder (boblende oppstår) og la det røre i 15 minutter. Tøm og vaske harpiks med DCM (5x) deretter gjenta prosessen når mer.
- Vask harpiksen med DCM (5x) da DMF (5x). Nøytralisere harpiksen ved å vaske to ganger med en 5% v / v løsning av N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) i DMF vask deretter med DCM (5x) og DMF (5x) igjen. Utfør "metyl rødt test" og "chloranil test" omtalt i avsnitt 10.1 og 10.2. Resultater skal være negativt for metyl rødt test og positivt for chloranil testen.
4. Coupling Boc / TBU-beskyttet functionalized Bis-Amino Acid
- Gjeninnføre en inert atmosfære til harpiksen som inneholder reaksjon fartøy ved å vaske tre ganger med vannfritt DCM deretter legge en septum og argon linje. Rydd og vask båten ved å legge 1-2 ml av vannfri DCM og la oppsikt i 30 sekunder da drenering fartøyet til argon linjen bubbler begynner å stige. Gjør dette minst en gang.
- Forbered en løsning av 0,15 M functionalized bis-amino acid (3eq) og 245 mg 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (hOAT, 136,11 g / mol, 18eq) i 2 mL 02:01 DCM: DMF i en flamme tørket test tube etter argon atmosfære. Legg 47 mL av diisopropylcarbodiimide (DIC, 156,6 ml / mol, 3eq) og rør i 90 minutter.
- Legg 35 mL DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) i 666 mL vannfri DMF til harpiks og la røre i 5 minutter.
- Overfør pre-aktivert bis-aminosyre løsning reaksjon fartøy via sprøyte og la røre natten.
- Tapp reaksjonsblandingen og vask to ganger med vannfri DCM mens under argon.
- Å fremme nedleggelsen av diketopiperazine, legge til en 0.25 M løsning av hOAT (136,11 g / mol, 10eq) og DIC (156,6 ml / mol, 10eq) i en 4 mL 01:01 DCM: DMF og la røre i henhold argon i 1 time.
- Fjern septum og tøm reaksjonsblandingen. Vask harpiksen med DCM (5x) og DMF (5x). Hvis ønskelig, utføre "chloranil test" omtalt i avsnitt 10.2.
5. Deprotection av Boc / TBU-beskyttet functionalized Bis-Amino Acid
- Tilsett 2 ml av en løsning av 95:5 trifluororacetic syre (TFA): triisopropylsilane (TIPS) til reaksjonen fartøyet og la den røre i 1 time. Tøm og vask harpiksen i ca 30 sekunder med DCM (5x) og gjenta prosessen en gang til.
- Vask harpiksen med DCM (5x) da DMF (5x). Nøytralisere harpiksen ved å vaske to ganger med en 5% v / v løsning av DIPEA i DMF deretter vaske DCM (5x) og DMF (5x) igjen. Hvis ønskelig, utføre "chloranil test" omtalt i avsnitt 10.2.
7. Functionalizing BIS-Peptide Prolidine End
- Den prolidine enden av den voksende bis-peptid kan acylated uavhengig eller sammen gjennom en diketopiperazine. I tillegg kan dette ende stå beskyttes, som vil bli spaltes sistnevnte, affording den frie aminosyren. Hvis ønskelig, utføre "chloranil test" omtalt i avsnitt 10.2 for å vurdere kobling effektivitet.
8. Deprotection av Fmoc og Acylation av kvartærtiden End of the Bis-Peptide
- En 2 ml løsning av 20% piperidine i DMF er lagt til og reaksjonen er blandet i 20 minutter. Tøm og vaske harpiks med DMF (5x) og gjenta prosessen en gang til.
- Vask harpiksen med DCM (5x) da DMF (5x).
- Forbered en 0.15 M løsning av aminosyre (3eq) i 2 ml av N-methylpyrrolidone (NMP) med 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) og 104,5 mL DIPEA (174,19 ml / mol, 6eq) og bland godt. Legg til reaksjon fartøy og la røre i 6 timer.
- Vask harpiksen med DCM (5x) da DMF (5x).
9. Fjern Boc Gruppe fra Resin Bundet aminosyre og Cleave fra Resin
- Tilsett 2 ml av en 1:01 TFA: DCM løsning reaksjonen fartøyet og la det røre i 30 minutter. Tøm og vaske harpiks med DCM (5x) deretter gjenta prosessen når mer.
- Vask og tøm harpiks for 30 sekunder med DCM (5x) da DMF (5x).
- Tilsett 2 ml av en løsning av 10% DIPEA i vannfri DMF og la røre 24-48 timer.
- Samle reaksjonsblandingen i pre-veid rund bunn kolbe. Overføring 30 mL av denne løsningen til 450 mL av THF i en LC-MS hetteglass og sende til analyse. Vask harpiksen med ytterligere alikvoter av DMF og samle inn den runde bunnen kolben deretter fjerne væske i vacuo.
10. Rensing av Bis-Peptide
- Løs råolje bis-peptid i en minimal mengde dimethyl sulfoxide (100-250 mL) og overføring til HPLC hetteglass innsatsen. Plasser Sett inn autosampler av semi-prepitive HPLC system (Hewlett Packard 1100 Series) utstyrt med en XTerra Prep MS C18 5 mikrometer 7.8x150 mm kolonne og en 100 mL injeksjon loop.
- Utføre flere 50 mL injeksjoner av prøven ved hjelp av en gradient program på 5-95% acetonitril i vann med 0,1% maursyre over 30 minutter, mens overvåking på 274 nm. Samle produktet toppen i en pre-veid disponibel sentrifugerør og fryse tørt med en lyophilizer. Forsiktighet bør utvises med første løp som en liten forskyvning i topp oppholdstid i forhold til analytiske lcms er vanligvis observert.
11. Vurderingsformer
- METHYL RED TEST 7: Fjern ~ 1 mg tørr harpiks via engangspipette og skyll i 4 ml reaksjon fartøy. Legg til en løsning av 20 mg metyl rødt, 50 mL N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), og 5 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) i 500 mL vannfri DCM og la rør i 5-10 min. Tøm og vask harpiks med DCM til filtratet blir fargeløs. Positiv indikasjon er resin perlene resterende oransje eller rød.
- CHLORANIL TEST 12: Transfer ~ 1 mg tørr harpiks i et lite hetteglass via engangspipette. Tilsett 3 dråper både en 0,8 mm chloranil i DMF løsning og 2% acetaldehyd i DMF løsning og la sitte i romtemperatur i 5-10 minutter. Positiv indikasjon er resin perlene blir blå / lilla.
- AKTIVERING TRAP TEST: Aktivert forbindelser under syntesen kan vurderes ved å overføre et lite beløp (5-10 mL) av aktivert løsning til en væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) hetteglass som inneholder 50 mL av pyrrolidine. Bland for hånd i noen sekunder (solutipå bør bli gul) så tynn ut med 450 mL av tetrahydrofuran (THF) og sende til LC-MS analyse.
- ANALYTISK LC-MS: Den endelige produktet og aktiverte mellomprodukter kan vurderes ved hjelp av en HP 1200 series LC-MS systemet utstyrt med en Waters Xterra MS C18 3,5 mikrometer 4,6 mm x 150 mm kolonne og en gradient system av 5-95% acetonitril i vann med 0,1% maursyre over 30 minutter.
12. Representative Resultater
Et eksempel på både råolje (figur 4) og renset (figur 5) lcms spor tilbys. Purified Avlingene av ca 10% er forventet å bruke metodene som er skissert ovenfor.
Figur 1. Diagram of Experimental Set-Up for Fastfase Synthesis.
Figur 2.Relevant Nomenklatur for Bis-aminosyrer / Bis-peptider.
Figur 3. Overall Syntetisk Scheme. Klikk her for å se større figur .
Figur 4a. HPLC Spor av rå Product på 274 nm.
Figur 4b. MS spekteret av rå Produktet Peak.
Figur 5a. HPLC Spor av Purified Product på 274 nm.
Figur 5b. MS spekteret av renset produkt Peak.
Discussion
Den syntetiske tilnærmingen presenteres her gir en metode for syntese av functionalized bis-peptider fra bis-aminosyre byggesteinene som bruker vanlige SSD-fase peptidsyntese teknikker. Monomer syntese av disse "Pro4" byggeklosser fra trans-4-hydroxyproline 3 er svært skalerbar og har blitt vellykket gjennomført til hydantoin scenen på en 600 mmol (234 g) skala (upublisert). Når monomerer er i hånd, gir bruk av solid-fase teknikker en raskere metode for bis-peptidsyntese enn vår nåværende løsning-fase metodikk 4 ved å eliminere behovet for reaksjonen arbeids-ups og mellomliggende renselser.
Hovedutfordringen i fast-fase syntese er diagnostisering syntetisk fremgang og problemløsning siden ingen mellomprodukter blir isolert. Dette har ført til utvikling av mange kolorimetriske tester inkludert de å finne ut om frie aminer (Kaiser Test 10) eller gratis hydroxyls (Methyl Red Test 7) er utsatt på harpiks. Dessverre er det mest brukte Kaiser Test 10 ikke gjelder generelt i vår fast-fase syntese skyldes nesten utelukkende bruk av sekundære aminer eller aminer festet til en kvarternær karbon. Andre alternativer for vurdering på HMBA harpiks omfatte test splittelsene som bruker en nucleophile eksempel hydrazin 11, kvantitativ Fmoc spalting overvåket av UV / Vis 1,11, og fangst og analysere innkommende aktivert forbindelser.
En annen oversett problem i fast-fase syntese er den repeterende natur syntetiske skritt som kreves av operatøren. Med dette er tankene, forfatterne sterkt anbefaler bruk av et regneark eller sjekkliste når du utfører noen manuell fast-fase peptidsyntese.
Den så lett i bruk bis-peptider for fast-fase syntese forhold til vanlige α-aminosyrer inkluderer potensialet for vanskeligere koblinger grunn steric hindrance, behovet for on-resin diketopiperazine nedleggelser, og samtidig deprotections (BOC / TBU; Cbz / TBU). En annen så lett ligger i å oppnå kvantitativ utgivelse fra harpiksen å bruke denne "sikringen" metode i forhold til mer konvensjonelle midler. Med disse faktorene i bakhodet, er det meget mulig at ytterligere optimalisering av denne metoden kan oppnås og dagens innsats er i gang i vår gruppe for å forbedre metoden presentert her.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Zachary Z. Brown og Jennifer Alleva for den første utviklingen av dette fast fase syntese teknikk og Matthew FL Parker for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet støttes av Forsvarets Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) og Horst Witzel Fellowship Award støttet av Cephalon, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMBA-Am Resin | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
| Anhydrous DCM | Acros Organics | 34846 | Carcinogenic |
| 33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
| Anhydrous DMF | Acros Organics | 34843 | Flammable, Toxic |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Flammable, Toxic |
| Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toxic |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toxic |
| Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
| Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | D1281 | |
| SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | 1200 Series | |
| Semi-Prep LC | Hewlett-Packard | 1100 Series | |
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
References
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E.
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S.
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
