Den effektiva fast fas peptidsyntes av en funktionaliserad bis-peptid trimer använder en "säkerhetsspärr" klyvning proceduren från HMBA harts beskrivs.
År 1962 publicerade RB Merrifield det första förfarandet med fast fas peptidsyntes som en ny väg för att effektivt syntetisera peptider. Denna teknik visade sig snabbt fördelaktig jämfört med sin lösning fas föregångare i både tid och arbete. Förbättringar när det gäller karaktären av fast stöd skyddsgrupperna används och kopplingen metoder som används under de senaste fem decennierna har bara ökat nyttan av Merrifield ursprungliga system. Idag pionjär användningen av en Boc skydds-och bas / nukleofil klyvbara harts strategi eller Fmoc skydds-och surt spjälkbar harts strategi med RC Sheppard, används oftast för syntes av peptider 1.
Inspirerat av Merrifields burna fasta strategi, har vi utvecklat en Boc / tert-butyl-syntes i fast fas strategi för montering av funktionaliserade bis-peptider 2, vilken beskrivs häri. Användningen av fastfassyntes jämfört to lösningsfas metod är inte bara fördelaktigt både i tid och arbetskraft som beskrivits av Merrifield 1, men också tillåter större lätthet vid syntesen av bis-peptidbibliotek. Syntesen som vi visar här innehåller ett slutligt klyvning steg som använder en två-stegs "säkerhet fånga" mekanism för att frigöra funktionaliserade bis-peptiden från hartset genom diketopiperazin bildas.
Bis-peptider är styva, spiro-stege oligomerer av bis-aminosyror som är i stånd att positionera funktionalitet på ett förutsägbart och modifierbara sätt, som styrs av den typ och stereokemin av monomerenheterna och anslutningen mellan varje monomer. Varje bis-aminosyran är en stereokemiskt ren, cyklisk byggnadsställning som innehåller två aminosyror (en karboxylsyra med en α-amin) 3,4. Vårt laboratorium undersöker för närvarande möjligheterna av funktionella bis-peptider inom en mängd olika områden inklusive katalys, protein-protein interaktioner och nanomaterials.
Den syntetiska metoden som presenteras häri ger en metod för syntes av funktionaliserade bis-peptider från bis-amino-block syra byggnadsmaterial med användning av gemensamma fast-fas-peptidsyntestekniker. Monomeren Syntesen av dessa "Pro4" byggstenarna från trans-4-hydroxiprolin 3 är skalbar och har med framgång slutförts på hydantoin scenen på en 600 mmol (234 g) skala (opublicerad). När monomererna är i hand, ger användning av fastfastekniker en snabbare metod för bis-peptidsyntes än vår nuvarande lösningen fas metodik 4 genom att eliminera behovet för reaktion work-ups och mellanliggande reningar.
Den främsta utmaningen i fast fas syntes diagnostisera syntetiskt framsteg och problemlösning eftersom inga mellanprodukter isoleras. Detta har lett till utvecklingen av många kolorimetriska tester inklusive att identifiera om fria aminer (Kaiser Test 10) eller fri hydroxietoxiYLS (metylrött test 7) är exponerade på hartset. Olyckligtvis är det vanligen använda Kaiser-testet 10 inte allmänt tillämpbar i vår fast fas-syntes på grund av den nästan exklusiv användning av sekundära aminer eller aminer bundna till ett kvaternärt kol. Andra alternativ för en bedömning av HMBA harts inkluderar tester klyftor med en nukleofil, såsom hydrazin 11, kvantitativ Fmoc klyvning övervakas av UV / Vis 1,11 och fånga och analysera inkommande aktiverade föreningar.
En annan förbisedd fråga i fastfassyntes är repetitiva karaktär av syntetiska steg som krävs av operatören. Med detta i åtanke, författarna rekommenderar användningen av en kalkylblad eller checklista när du utför någon manuell fast fas peptidsyntes.
Den svårighet i att använda bis-peptider för fastfas-syntes jämfört med vanliga α-aminosyror innefattar potentialen för svårare kopplingar på grund av steriskt hindrance, behovet av på-harts diketopiperazin förslutningar, och samtidiga deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). En annan svårighet ligger i att uppnå kvantitativa frisättning från hartset med denna "säkerhetsspärr"-metoden jämfört med mer konventionella metoder. Med dessa faktorer i åtanke, är det mycket möjligt att ytterligare optimering av denna metod kan uppnås och nuvarande insatser pågår i vår grupp för att förbättra den metod som presenteras här.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Zachary Z. Brown och Jennifer Alleva för den inledande utvecklingen av denna fastfassyntes teknik och Matthew FL Parker för värdefulla diskussioner. Detta arbete stöds av Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) och Horst Witzel Fellowship Award stöds av Cephalon, Inc.
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
HMBA-Am Resin | NovaBiochem | 855018 | |
MSNT | NovaBiochem | 851011 | |
NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
Anhydrous DCM | Acros | 34846 | Carcinogenic |
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
Anhydrous DMF | Acros | 34843 | Flammable, Toxic |
HOAt | GenScript | C01568 | |
DIC | Acros | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
TIPS | Acros | 21492 | Flammable, Toxic |
Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
NMP | Acros | 36438 | Toxic |
DMAP | NovaBiochem | 851055 | Toxic |
Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher | D1281 | |
SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
LCMS | Agilent | 1200 Series | |
Semi-Prep LC | Hewlett Packard | 1100 Series | |
Lyophilizer | Labconco | 7934027 | |
Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
Argon | Airgas | AR PP300CT |