Målet er at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af isolerede hjerter i forbindelse med fysiologiske forbelastning og afterload tryk. En biventrikulær arbejder kaninhjerte model præsenteres. Høj spatiotemporal opløsning fluorescensimagografi af NADH anvendes til at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af epikardiale væv.
Siden starten af Langendorff 1, forbliver isolerede perfunderede hjertet et fremtrædende værktøj til at studere hjertets fysiologi 2. Det er imidlertid ikke velegnet til studier af hjerte metabolisme, som kræver hjertet for at udføre arbejde inden for rammerne af fysiologisk forbelastning og afterload tryk. Neely indført ændringer af Langendorff teknik til at etablere passende venstre ventrikel (LV) preload og afterload pres 3. Modellen er kendt som den isolerede LV arbejds hjerte model og er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere LV ydeevne og metabolisme 4-6. Denne model er imidlertid ikke en korrekt indlæst højre ventrikel (RV). Demmy et al. første rapporterede en biventrikulær model som en modifikation af LV bearbejdning hjertet model 7, 8. De fandt, at slagvolumen, minutvolumen, og tryk udvikling forbedret i hjerter konverteret fra arbejde LV mode til biventrikulær arbejde tilstand 8 </sup>. En korrekt indlæst RV også mindsker unormale trykgradienter over skillevæg for at forbedre septal funktion. Biventrikulær arbejder hjerter har vist sig at opretholde aorta output, pulmonal flow, betyder aorta tryk, hjertefrekvens og myocardiale ATP-niveauer op til 3 timer 8.
Når man undersøger de metaboliske virkninger af myocardial skade, såsom iskæmi, er det ofte nødvendigt at identificere placeringen af det påvirkede væv. Dette kan gøres ved billeddannelse fluorescensen af NADH (reduceret form af nicotinamid-adenin-dinucleotid) 9-11 fundet et coenzym i store mængder i mitokondrierne. NADH fluorescens (fNADH) viser et næsten lineært omvendt forhold til lokale iltkoncentration 12 og giver et mål af mitokondriel redoxtrin 13. fNADH billeddannelse under hypoxiske og iskæmiske tilstande er blevet anvendt som et farvestof-fri metode til at identificere hypoksiske områder 14, 15 og til at overvåge udviklingen afhypoxiske betingelser over tid 10.
Formålet med fremgangsmåden er at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af biventrikulær arbejder hjerter i protokoller, som ændrer hastigheden af myocyt metabolisme eller inducere hypoxi eller skabe en kombination af de to. Hjerter fra New Zealand hvide kaniner blev forbundet til en biventrikulær arbejder hjerte-system (Hugo Sachs Elektronik) og perfunderet med modificeret Krebs-Henseleit-opløsning 16 ved 37 ° C. Aorta, LV, pulmonal arterie, og venstre og højre atrium tryk blev registreret. Elektriske aktivitet blev målt under anvendelse af en monofasisk virkningspotentiale elektrode. At afbilde fNADH, blev lys fra en kviksølvlampe filtreret (350 ± 25 nm) og anvendt til at belyse epicardiet. Emitterede lys blev filtreret (460 ± 20 nm) og afbildes ved hjælp af en CCD-kamera. Ændringer i epikardial fNADH af biventrikulær arbejder hjerter i forskellige pacinghastigheder præsenteres. Kombinationen af hjertet model fNADH billeddannelsetilvejebringer en ny og værdifuld eksperimentelle redskab til at studere akutte kardiale sygdomme inden for rammerne af realistiske fysiologiske betingelser.
Det isolerede Langendorff perfuseret hjerte er et fremtrædende værktøj til at studere kardial fysiologi 2. Det er især nyttigt ved undersøgelser af hjertearytmier, især dem som bruger fluorescensimagografi af transmembrane potentiale 20. En fordel er, at hele epicardiet af det isolerede hjerte kan observeres 21, 22. En anden fordel er, at i modsætning til blodet, er perfusion med en klar krystalloide pufferopløsning ikke interfererer med fluorescenssignaler. En begrænsning er, at Langendorff teknik ikke er velegnet til studier af hjerte metabolisme, hvilket ofte kræver hjertet for at udføre arbejde inden for rammerne af fysiologisk forbelastning og afterload tryk.
At højne relevansen af isolerede hjerte forberedelserne til metaboliske undersøgelser, Neely indført ændringer af Langendorff teknik til at etablere passende venstre ventrikel (LV) preload og afterload pres 3.Modellen er kendt som den isolerede LV arbejds hjerte model og er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere LV ydeevne og metabolisme 4-6. LV arbejde Hjertet model er overlegen i forhold til Langendorff model for funktionelle evalueringer, men det giver ikke en korrekt indlæst højre hjertekammer (RV). Demmy et al. første rapporterede en biventrikulær model (LV og RV) som en modifikation af LV bearbejdning hjertet model 7, 8. De fandt, at slagvolumen, minutvolumen, og tryk udvikling forbedret i hjerter konverteret fra arbejde LV mode til biventrikulær arbejde tilstand 8. En korrekt indlæst RV forbedrer også septal funktion ved at formindske unormale trykgradienter over septum. Biventrikulær arbejder hjerter har vist sig at opretholde aorta output, pulmonal flow, betyder aorta tryk betyder pulmonært blodtryk, hjertefrekvens og myocardial ATP og creatinphosphat niveauer op til 3 timer 8. Biventrikulær arbejder hjerte undersøgelser typisk bruge hjerter frabout små dyr, såsom rotter og kaniner, fordi minutvolumen og det påkrævede volumen af perfusat er meget mindre end for hjertet i større dyr. Imidlertid har biventrikulær arbejder hjerte undersøgelser er udført med hjerter fra svin, hjørnetand, og endda mennesker 23, 24.
Den metaboliske efterspørgsel af isolerede hjerter i biventrikulær arbejde tilstand er betydeligt højere end Langendorff perfusion. Det er vigtigt, at perfusatet opløsningen giver tilstrækkelig oxygen og metabolisk substrat støtte biventricular hjertefunktion. Standard krystalloide pufferopløsninger, såsom Krebs-Henseleit 16, 17, 25 eller Tyrodes 26, 27, har oxygen opløseligheder så høj som 5,6 mg / L. Når disse opløsninger beluftet med carbogen (en gasblanding af 95% O2 og 5% CO 2) og indeholder passende metabolisk substrat (glucose, dextrose og / eller natriumpyruvat), de er egnede til biventrikulær arbejder hjerter slå på normal sinus satser (ca. 180 bpm for en kanin).
Metaboliske efterspørgslen stiger for hurtige rytmer og mængden af ilt opløst i standard perfusates måske ikke være nok til fuldt ud at støtte en biventrikulær arbejder hjerte, der er ordregivende ved høje hastigheder. Krystalloide pufferopløsninger indeholdende erythrocytter eller blandede med helblod er blevet anvendt i arbejder hjerte præparater for at sikre tilstrækkelig oxygen til rådighed. Tidligere undersøgelser har vist, at tilsætning af erytrocytter med en Krebs-Henseleit-opløsning forbedret arbejdsmiljø hjertefunktion under stringente pacing protokoller og reducerede også forekomsten af ventrikulær fibrillering 16. En begrænsning ved hjælp af erythrocytter eller blandinger af helblod er, at hæmoglobin interfererer med bølgelængder, der anvendes til fluorescensimagografi 13. Andre substrater, såsom albumin, kan også tilsættes til perfusatet opløsninger at forlænge hjerte levedygtighed og reducere ødem 28.
Under fluorescensimagografi intensiteten af excitationslyset skal være høj, og lysfordeling skal være ensartet. At opnå ensartet belysning er ikke altid let på grund af krumningen af den epikardiale overflade. I vore undersøgelser. Vi billede fNADH ved filtrering lys (350 ± 25 nm) fra en kviksølvlampe En togrenet fiberoptisk lysleder anvendes til at dirigere det ultraviolette lys på epikardiale overflade. Ensartet belysning kan opnås ved passende positionering af de to output rørringe. UV LED lyskilder kan også anvendes, som vi har vist i figur 3. LED-kilder er relativt billig, så multiple kilder kunne inkorporeres i et billeddannende system. Lysdioder kan også tændes og slukkes ved høje hastigheder for at synkronisere excitationslyset med billede købet.
Fotoblegning af NADH bør minimeres 29 ved at reducere den tid væv belysning. Dette kan gøres ved at cykle belysningen til og fra med en elektronIC lukker og en lampe eller med en LED-belysning og en controller. Hvis belysning er synkroniseret med den cardiale cyklus, derefter fNADH billedoptagelse kan være begrænset til diastole, som ville reducere bevægelsesartifakt i fluorescenssignaler. Trigning belysning og billedoptagelse med et tryksignal, som LV-tryk, ville være en måde at gøre dette.
I vores undersøgelser har vi observeret, at ændringer i fNADH per tidsenhed kan være mere end 5x højere i 400 bpm end på 200 bpm. Dette indikerer, at hurtige rytmer hæve redoxtilstanden af hjertet. Hvorvidt dette er forårsaget af hypoxia eller manglende evne af myocytter at oxidere NADH til NAD + hurtigt nok til at undgå akkumulering af NADH er stadig et ubesvarede spørgsmål.
Udførelsen af en biventrikulær arbejde hjerte forberedelse er betinget af flere faktorer. En af de vigtigste er at fastsætte passende preload og afterload pres for at efterligne den fysiologiskevilkår, der er under efterforskning. Især skal LV afterload (aorta tryk) justeres til at repræsentere systemisk tryk. Hvis den er for høj, vil LV ikke være i stand til at overvinde trykket, hvilket resulterer i regurgitation. Trykket, der er for lav, vil påvirke koronar perfusion. LV forbelastning tryk (venstre atrielt tryk) bør også justeres for at tilvejebringe en ende diastoliske slutvolumen, der er passende for den eksperimentelle protokol.
fNADH billeddannelse af levende væv er en etableret måde fluorescensimagografi 13. Dets anvendelse til hjertevæv blev illustreret af Barlow og chance, når de rapporterede markante stigninger i fNADH inden for regionalt iskæmisk væv efter ligering af en koronarkar 14. Deres fNADH billeder blev optaget på film ved hjælp af en Fairchild oscilloskop kamera og UV flashfotografering. Coremans et al. uddybes dette koncept ved hjælp af NADH fluorescens / UV reflektans forhold til målee den metaboliske tilstand epicardiet af Langendorff blod-perfusionerede rottehjerter 30. En videofluorimeter blev brugt til billedbehandling og data blev optaget med en videooptager. Senere, Scholz et al. anvendes en spektrograf og fotodiodesæt at måle gennemsnitlige fNADH fra et stort område af LV. Denne fremgangsmåde reducerede virkningerne af epikardielle fluorescens heterogeniteter og lokale variationer i omløb samtidig med at afsløre makroskopiske arbejdsrelaterede variationer af fNADH 31. Denne fremgangsmåde svarer til computerressourcer gennemsnitlige fNADH niveauer for en region af interesse på tværs af alle rammer af en fNADH billeddannende datasæt, som illustreret i figur 2. Som vi har præsenteret i denne artikel, nutidens teknologi giver high-speed CCD-kameraer og digitalt styret high-power UV spotlights. Disse teknologier gør det muligt for spatiotemporal dynamik fNADH og hjerte-metabolisme, der skal undersøges fra mange nye perspektiver. Den relativt lave omkostninger af optik og lyskilde gør fNADH billeddannelse en nyttig tilbehør til konventionelle kardiale optiske kortlægningssystemer. 9, 32
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01-HL095828 til MW Kay).
Chemical | Company | Catalogue Number |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911-500G |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968-500G |
NaPyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256-25G |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418-100G |