Summary
이 문서 그대로의 고립과 정화하는 방법을 설명합니다
Abstract
기회 병원체 Legionella pneumophila도 따라서 중증 폐렴 'Legionnaires'병 "1 원인이 폐포 macrophages에 복제 아메바에 강한 세균이다. protozoan과 포유류의 phagocytes에서, L. pneumophila는 구체적이고 복제 허용 구획, "Legionella 함유 공포를"(LCV) 결성 보존 메커니즘을 고용합니다. LCV 형성은 호스트 세포에 많은 275으로 "이펙터"단백질 translocates 세균성 ICM / 도트 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)를 필요로합니다. effectors는 호스트 단백질뿐만 아니라 lipids를 조작하고 분비, endosomal 및 mitochondrial organelles 2-4와 통신합니다.
LCVs의 형성은 reductionist의 방식으로 이해하기 어려운 복잡한 강력하고 중복 프로세스를 나타냅니다. 통합 접근 방식은 종합적 경로의 세계적인 분석을 포함하여 LCV 형성을 이해하는 데 필요한ogen - 호스트 요소의 상호 작용과 그 시간적 및 공간적 역학. 이러한 목표를 향한 첫 단계로서 그대로 LCVs이 정화되고 proteomics와 lipidomics으로 분석했다.
조성과 병원균 함유 vacuoles 형성은 액체 크로마 토그래피 또는 대량 분석법에 결합하여 2-D 겔 전기 영동을 사용 proteomic 분석에 의해 조사되었다. 사회적 토양 아메바 Dictyostelium의 discoideum이나 포유 동물 phagocytes 중 격리 Vacuoles는 Leishmania 5, 리스테리아 6,은 Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 살모넬라균 9 Legionella SPP을 숨겨두고. 10. 그들은 예를 들어 전자 현미경은 LCV의 형태, 무결성 및 순도를 분석할 필요로하지만, 이러한 연구들에서 사용된 정화 프로토콜은 시간이 오래 걸릴 지루한입니다. 또한 이러한 프로토콜은 실내의 병원균 공포의 특정 기능을 이용하지richment.
여기에 제시된 방법은 시각을 채용하여 이러한 한계를 극복 형광 LCV 마커를 생산 discoideum 및 세균성 효과기 단백질 SidC을 대상으로하여 어떤 선택 (PtdIns (4) P) 4 - 인산 phosphatidylinositol에 3,11을 바인딩하여 LCV 막에 앵커. LCVs는 고전 Histodenz 밀도 기울기 원심 분리 12,13 (그림 1)에 의해 두 번째 단계에 따라 SidC와 자기 구슬로 결합된 이차 항체, 대한 친화력 - 정화 일차 항체를 이용한 immuno-자성 분리에 의한 첫 번째 단계에서 풍부하고 .
D.으로부터 격리된 LCVs의 프로테옴 연구 discoideum 13 전에 LCV 형성에 연루되지 않았 phagocytic vesicles, mitochondria, 응급실 및 잠돌군 Zz뿐만 아니라 여러 GTPases와 관련된 단백질을 포함한 560 개 이상의 숙주 세포 단백질을 발표했다. LCVs이 풍부하고 함께 정화프로토콜은 더욱 현미경 (immunofluorescence, 전자 현미경), 생화 학적 방법 (서양 얼룩) 및 proteomic이나 lipidomic 접근하여 분석할 수있다 여기서 설명했다.
Protocol
1. LCV 절연을위한 준비
- Legionella pneumophila는 LCV 절연 전에 5 μg / ML chloramphenicol (캠) 4 일 동안 CYE 한천 플레이트에 글리세롤 주식에서 DsRed-Express에서 13,14 생산 밖으로 행진. 37 세균을 품어 ° C.
- 1 × 10 7 종자 디 GFP-calnexin 또는 75cm 두 조직 문화에 RAW264.7 murine macrophages를 생산 discoideum 언젠가 전에 감염을 flasks. 20 μg / 디위한 ML G418처럼 10 ML HL5 매체를 사용하여 23 ° C.에 discoideum과 amoebae을 품어 RAW264.7 macrophages 10 % FCS (열 inactivated)과 1 %의 글루타민과 함께 보충 10 ML RPMI 1640 배지를 사용하고 37에서 세포 성장을 위해 ° C에서 5 % CO 2.에게 감염 및 샘플마다 적어도 세 75cm 2 flasks를 (최소 6 X 10 7 세포)를 사용합니다.
- L.과 하룻밤 문화의 예방 CYE 판에서 pneumophila. 예 중간 세 ML로 15 ML 테스트 튜브를 타고5 μg / ML의 캠. 0.1의 OD 600nm를 얻을 수있는 세균 현탁액을 100 μl와 예방. 21-22 시간 동안 37 ° C에서 오버헤드 회전 바퀴에서 하룻밤 문화를 품다.
2. LCV 절연
- D.의 매체를 변경 discoideum 세포는 다음과 같은 감염을 방해하는 것이 항생제를 제거합니다.
- 하룻밤 문화의 OD를 측정합니다. 박테리아는 2 X 10 9 박테리아 / ML에 해당 ≥ 3의 OD 600nm, 자신들의 절정 감염에 도달해야합니다.
- L.의 약 500 μl를 첨가하여 세포를 감염 10 ML HL5 매체 (D. discoideum) 또는 10 ML RPMI 1640 (macrophages)에 성장 세포에 pneumophila 하룻밤 문화. 이것은 50 감염의 다수 (방어)에 해당합니다. 그 후에는 감염이 10 분, 500 × g에서 세포 고정 박테리아의 원심 분리에 의해 동기화됩니다. 원심 분리는 다음에 있습니다D.의 배양에 의한 25 ° C와 ° C 5 % CO 2, 각각 37 RAW264.7 macrophages에서 discoideum 세포. 1 시간의 감염 시간은 원심 분리 단계가 포함됩니다.
- 감염 후 매체를 제거하고 세포 밖 박테리아를 제거하는 한 세포를 씻는다. D. 위해 얼음처럼 차가운 SorC 버퍼를 사용 discoideum 및 RAW264.7 macrophages를위한 얼음처럼 차가운 PBS. 각각의 플라스크에 단백 분해 효소 억제제 (로슈)로 보충 3 ML HS 버퍼를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수집합니다. 15 ML 테스트 튜브에 풀 대응하는 샘플.
- 샘플 사용 3 ML 플라스틱 Luer-잠금 주사기와 스테인리스 스틸 볼을 균 질기의 균질하십시오. 당신이 얼음에서 작동하는지 확인하십시오. 시작하기 전에, 어떤 세제 오염을 방지하고 기포를 제거하기 위해 얼음 추위 HS 버퍼로 플러시, 증류수로 볼 균 질기 씻는다. 8 μm의 통관 공을 사용합니다.
- 주사기 깨물어으로 처음 3 ML을 작성하는 일에 마운트전자 균 질기. 균 질기를 통해 앞뒤로 9 번 샘플을 누르십시오. - 균질하지 물질과 오염을 피하기 위해 나중에 주사기를 교환. 모아 15 ML 테스트 튜브에 균질 견본을 수영장과 미세한 분석을 위해 150 μl 채취. 다른 예제를 진행하기 전에 해체와 공 균 질기 씻는다.
- 4에서 얼음 뿌리에 30 분 또는 오버헤드-물레 (10-20 RPM)에 2퍼센트 CS 또는 FCS와 homogenate를 차단 ° C.
- 차단하기 SidC (희석 1:3000)에 반대하거나 LCV 막에 독점적으로 바인딩 기타 세균성 마커에 대한 친화력 - 정화 일차 항체를 사용하면. homogenate에 추가하기 전에 소용돌이 항체 솔루션입니다. 4 ° C.에 얼음 뿌리에서 1 시간 동안이나 오버헤드-물레 (10-20 RPM)에서 샘플을 품어
- 그동안 Histodenz 기울기를 준비합니다. 15 ML 기울기 당 시험관 하나의 샘플 세 75cm 2 flasks을 사용합니다. 전나무일, 튜브에 35 % Histodenz의 5.75 ML을 추가하고, 둘째, 조심스럽게 상위 10 % Histodenz 솔루션의 5.75 ML을 추가합니다. 이후 신중하게 1 시간 동안 다운 수평으로 튜브를 바칩니다.
- 차단 시약 및 일차 항체, 4 펠렛에 ° C 시료에서 15 분, 600 × g에서 원심 분리기와 homogenate의 부화 후. 뜨는을 무시하고 1.5 ML HS 버퍼에 펠렛을 resuspend. 신선한 15 ML 테스트 튜브에 샘플을 전송하고 나중에 미세한 분석을 위해 40 μl 샘플을 채취한다.
- 이차 항체와 펠렛을 품어 - 맥 염소 항 토끼 IgG 마이크로 비즈 (희석 1시 25분) - 흔드는 30 분을 4 ° C.에 그러는 동안, 맥 자석 홀더에 열을 올리고 0.5 ML HS 버퍼 그들을 평형.
- 그 후, 컬럼에 샘플을 적용합니다. 이후 현미경 분석을 통해 유동-150 μl를 수집합니다. 0.5 ML HS 버퍼로 열 세 번 씻는다.
- t에서 열 제거squirting 즉각 0.5 ML HS 버퍼와 그 자석과 eluate LCVs. 현미경 분석을 위해 20 μl 샘플을 가져가라. immuno-자성 분리에 의한 정화 단계는 1 인당 얻을 것으로 예상된다 × 10 7 D. 감염 discoideum 전지 약 1 × 10 6 그대로 LCVs에 대한 칠배로 흐름을 통해 13에 비해 eluate에 풍부합니다.
- 수직 위치로 Histodenz 기울기 튜브를 다시 넣어 조심스럽게 위에 eluate를로드합니다. 4에서 1 시간 동안 3,350 × g에서 튜브를 원심 ° C.
- 원심 분리 후 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 시험관의 바닥부터 1.5 ML 분수 가져가라. 여덟 개의 분수, 튜브의 바닥에서 각 수집합니다. 아무 보이는 레이어는 지속 Histodenz 기울기에서 관찰되지 않습니다. LCVs의 높은 수율은 대개 ~ 2의 비율로 분수 4 예상되고 1 회 × 10 5 손상 LCVs × 10 7amoebae 13 fected. LCVs의 마이너 수량이 각각 분수 3과 5도 존재한다. 따라서 정화 LCVs의 전체 수확량은 ~ 1 × 10 6 × 10 7 당 6 그대로 LCVs는 감염이 디 discoideum 세포 13. LCVs의 복구는 실온 (RT)에서 수행하고, LCVs는 몇 시간 동안 안정적으로 나타날 수 있습니다.
3. 수집된 샘플의 현미경 분석
- 폴리-L-라이신 코팅 coverslips으로 24도 평면 바닥 조직 배양 플레이트를 준비합니다.
- LCV 정화 플러스 24 잘 플레이트에 각 밀도 기울기 분율 150 μl 중에 촬영한 모든 시료를 피펫. 높은 Histodenz 농도를 희석하기 위해 각도에 0.5 ML HS 버퍼를 추가합니다. 그 후, 4에서 10 분 동안 600 × g에서 번호판을 원심 분리기 ° C. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 RT 20 분 4 % paraformaldehyde (PFA)로 샘플을 채운다. 고정 후 샘플 두번 씻는다. 우리D.위한 e SorC discoideum 및 RAW264.7 macrophages를위한 PBS.
- D.을 표현 GFP-calnexin에서 샘플을 탑재 직접 예 Vectashield를 사용하여 유리 슬라이드에 LCV 절연, 동안 여러 단계에서 찍은 discoideum.
- RT 10 분 차단 용액 (1 % PBS에서 BSA)과 함께 LCV 분리하는 동안 여러 단계에서 찍은 RAW264.7 macrophages에서 샘플을 품어. (; 버퍼를 차단에서 1:1000 친화력 - 정화 토끼 반 SidC) LCVs를 착색하고 RT에 젖은 챔버에서 1 시간 동안 부화 방지 SidC 일차 항체를 사용합니다. 그 후, PBS로 샘플을 세 번 씻는다. RT에서 습식 및 어두운 실내에서 30 분, 이차 항체 (솔루션을 차단에서 1:200 예 : 안티 토끼 Cy5)로 품어. 마지막으로, PBS와 함께 샘플을 세 번 씻고 예 Vectashield를 사용하여 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
- GFP-calnexin으로부터 격리 LCVs의 형태, 무결성 및 수량 표현 디 말요coideum 또는 RAW264.7 macrophages에서는 적절한 필터가 장착된 형광 현미경으로 분석된다.
4. 대표 결과
immuno-친화성 분리 및 밀도 기울기 원심 분리에 의한 LCV 정화의 품질과 수율은 형광 현미경 (그림 1) 뒤에는 수 있습니다. 샘플 개요 디에서 LCV 격리 수집된 discoideu m 또는 macrophages는 (그림 2) 표시됩니다. L.의 homogenate pneumophila에 감염된 phagocytes 그대로 LCVs를 보여줍니다뿐만 아니라, 세포 파편 및 세포외 박테리아의 많은. 샘플을 pelleting 후 이미지가 가끔 비트 밀도 homogenate와 비슷합니다. 그대로 LCVs이 칼럼에 충실해야한다고 이후 흐름을 통해 주로 세포외 박테리아와 세포 부스러기가 포함되어 있습니다. 칼럼에서 샘플을 eluting 후 eluate는 대량의 손상 LCVs가 포함되어 있습니다. 우리 손에서 LCV purificati 에 디에 대한 더 효과적인 것 같습니다 macrophages에 비해 discoideum. D. 년 discoideum 병원체 vacuoles은 둥글게 만드는 표시 및 격리된 LCVs의 수율은 macrophages (그림 3)와 비교하여 10 회 이상 높다. 그대로 macrophages의 여러 항체 물들일 LVCs도 더욱 불규칙 모양의 나타납니다.
LCV 절연의 그림 1. 도식 개요. LCV 막에 독점적으로 현지화, 세균성 효과기 단백질 SidC 대한 친화력 - 정제 항체를 이용한 immuno-자성 분리에 의한 LCVs의) 분리. 이차 맥에서 마이크로 비드 결합 항체와 자석은 세포 파편으로부터 LCVs를 분리하는 데 사용됩니다. B) immuno-자성 분리 LCVs 후 추가 Histodenz 밀도 기울기 원심 분리에 의해 정화된다. LCVs은 분획 4에서 풍부합니다.
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그림 2. 샘플 LCV 정화 수집된. homogenate, 펠렛에서 이미지 플로우 스루와 D로부터 eluate discoideum 또는 macrophages가 그려져있다. 샘플 L. 표시 pneumophila 디의 DsRed-익스프레스 (빨간색)를 생산 GFP-calnexin 신호 (녹색, 위쪽 패널) 또는 방지 SidC 항체 (시안, 낮은 패널) 물들일 macrophages의 생산 discoideum. 바, 10 μm의.
그림 3. D.부터 LCVs 투석을 discoideum 또는 macrophages. 샘플은 L.의 Histodenz 밀도 기울기 원심 분리 후 분획 4를 표시 pneumophila는 (A) 라에서 DsRed-익스프레스 (빨간색)를 생산 GFP-calnexin 신호 (녹색)를 제작 discoideum 또는 (b) 항 SidC 항체 (시안) 물들일 macrophages 인치 바, 10 μm의.
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Discussion
이전에 다음 ID로 출판 메소드와는 달리,이 프로토콜은 두 단계 먼저 immuno-마그네틱 방식에 의한 LCVs의 분리, 둘째, 밀도 기울기 원심 분리에 의한 LCVs의 정화를 기준으로합니다. LCV 절연 쉽게 fluorescently 분류 박테리아와 GFP 생산 세포 또는 항체 염색법 중 하나를 사용하는 형광 현미경, 다음에 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 높은 순도와 LCVs의 농축에 결과 단순 스트레이트 포워드 방법입니다. 중요한 것은, 균질화 버퍼에 테아제 억제제는 RAW264.7 macrophages 필요하지만, D.의 discoideum 13 선택 사항입니다.
원칙적으로 프로토콜은 분리 단계에 필요한되는, 구체적이고 선택적으로 현지화 표식이 존재하는만큼, 다른 병원균이나 호스트 세포를 위해 채택됩니다. 이상적으로, 별개의 마커는 세균성 원산지 공포 막으로 운반이다차 선택적으로 거기 현지화. 다른 숙주 세포의 구획과 병원체 공포의 공동 정화 바람직하지의 숙주 세포 마커 가능성 결과를 타겟팅.
병원체 공포의 독특한 마커가 확인되면 적절한 polyclonal 또는 단클론 항체가 제기되어야한다. FCS 이외의 시약이 더 적절할 수도 차단으로 모든 일차 항체의 경우 농도 및 차단 시약은, 최적화되어야합니다 (예 : BSA, 드 lipidated 우유, 기타 상용 차단 시약).
또 하나 중요한 포인트는 병원체의 감염이다. 감염에 사용되는 박테리아는 가장 infective 단계에 있어야합니다. 기사 pneumophila, 예를 들어도, 액체 문화 post-exponential/early 고정 성장 단계로 성장해야합니다. 이러한 조건에서 박테리아는 또한, (~ 2 X 0.5 μm의) morphologically 교복 등 CYE 한천 플레이트에서 자란 박테리아에 반대입니다. 또한, antibioti아마도 세포 배양 매체에서 사용되는 CS는 세균에 대한 낮은 감염 및 손상을 방지하기 위해 감염 전에 제거해야합니다. 이해 효율성에 부정적인 영향을 피하기 위해 phagocytes 감염시 (자세한되지 않음) 약 80 %의 confluency에 도달해야합니다. 마지막으로, 1 시간의 잠복기가 L.위한 표준 감염 시간이 있지만 pneumophila는 LCVs의 비교적 동질하고 강력한 인구하였으며, 다른 시간 포인트 LCV 형성 13 proteomic이나 생화학 공부를 선택할 수 있습니다.
위의 메서드가 특정 병원체 - 숙주 세포 쌍 위해 설립되면, 그것은 디를 포함한 세균의 돌연변이 변종 및 / 또는 다른 호스트 세포를 테스트하는 것도 가능합니다 discoideum은 삭제 돌연변이를 정의. 일반적으로이 프로토콜과 함께 정화 병원체 vacuoles는 우리로서 현미경 (형광 및 전자 현미경), 생화학 assays (서양 얼룩) 포함한 다양한 방법에 의해 분석할 수proteomics 및 lipidomics 같은됩니다. 후자의 방법을 들어, proteomics / lipidomics 분석 버퍼 조건, 샘플 금액과 병원체 vacuoles 투석의 다운 스트림 처리 담당자와 협력하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리 연구실의 연구는 맥스 폰 Pettenkofer 연구소, 루드비히 Maximilians 대학 뮌헨, 독일 연구 재단 (DFG, HI 1511/3-1)와 Bundesministerium FÜR Bildung 깨물어 Forschung (BMBF) "의료 감염 지노 믹스"이니셔티브에 의해 지원되었다 ( 0315834C).
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