Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten
Abstract
Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung "Legionärskrankheit" ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die "Legionellen-enthaltenden Vakuolen" (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 "Effektor" transloziert Proteine in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02.
Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik.
Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung.
Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert .
Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.
Protocol
1. Die Vorbereitungen für LCV Isolation
- Streak aus Legionella pneumophila Herstellung DsRed-Express 13,14 Aktien aus Glycerin auf CYE-Agar-Platten mit 5 ug / ml Chloramphenicol (Cam) vier Tage vor LCV Isolation. Inkubieren der Bakterien bei 37 ° C
- Seed aus 1 x 10 7 D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin oder RAW264.7 murinen Makrophagen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen einen Tag vor Infektion. Verwenden Sie 10 ml HL5 Medium mit 20 ug / mL G418 für D. discoideum und inkubieren Sie die Amöben bei 23 ° C. Für RAW264.7 Makrophagen verwendet 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FCS (hitze-inaktiviert) und 1% Glutamin, und wachsen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Verwenden Sie mindestens drei 75 cm 2 Flaschen pro Probe und Infektion (mindestens 6 x 10 7 Zellen).
- Impfen eine Übernacht-Kultur mit L. pneumophila aus dem CYE Platte. Werfen Sie einen 15-ml-Reagenzglas mit 3 ml Medium AYEund 5 pg / ml Cam. Impfen mit 100 ul einer Bakteriensuspension eine OD 600nm von 0,1 ergeben. Inkubieren der Kultur über Nacht auf einem Overhead-Rotationsrad bei 37 ° C für 21-22 Stunden.
2. LCV Isolation
- Ändern Sie das Medium der D. discoideum Zellen zu entfernen, die Antibiotika, die mit der nach der Infektion beeinträchtigen würde.
- Messen Sie die OD der Übernacht-Kultur. Bakterien sollten ihren Höhepunkt Infektiosität bei einer OD 600nm von ≥ 3, die 2 x 10 9 Bakterien / ml entspricht erreicht.
- Infizieren die Zellen durch Zugabe von ca. 500 ul des L. pneumophila-Nacht-Kultur zu den wachsenden Zellen in 10 ml Medium HL5 (D. discoideum) oder 10 ml RPMI 1640 (Makrophagen). Dies entspricht einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50. Anschließend wird die Infektion durch Zentrifugation der Bakterien auf die Zellen bei 500 × g für 10 min synchronisiert. Die Zentrifugation wird gefolgtgefolgt von einer Inkubation des D. discoideum Zellen bei 25 ° C und die RAW264.7 Makrophagen bei 37 ° C und 5% CO 2 sind. Die Infektion der Zeit von 1 Stunde beinhaltet die Zentrifugationsschritt.
- Nach der Infektion entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal an extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Verwenden Sie eiskalten Zauberin Puffer für D. discoideum und eiskaltem PBS für RAW264.7 Makrophagen. In 3 ml HS-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Roche) ergänzt zu jedem Kolben und sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Pool die entsprechenden Proben in einem 15 ml Teströhrchen.
- Zur Homogenisierung der Probe Gebrauch 3 ml Kunststoff-Luer-Lock-Spritzen und die Kugel aus Edelstahl Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass Sie auf dem Eis zu arbeiten. Bevor Sie beginnen, waschen Sie den Ball Homogenisator mit destilliertem Wasser, um jede Verunreinigung zu vermeiden Waschmittel und spülen Sie es mit eiskaltem Puffer HS loszuwerden Luftblasen. Verwenden Sie das 8-Clearance um Kugel.
- Füllen Sie die ersten 3 ml in die Spritze auf und montieren Sie ihn auf the Homogenisator. Drücken Sie auf die Probe hin und her, neun Mal durch den Homogenisator. Tauschen Sie die Spritzen danach um eine Kontamination mit nicht-homogenisierte Material zu vermeiden. Sammeln und bündeln die homogenisierte Probe in einem 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 150 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Bevor Sie mit einer anderen Probe zerlegen und waschen den Ball Homogenisator.
- Sperren des Homogenats mit 2% FCS CS oder für 30 min auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C
- Nach der Blockierung verwenden Sie einen affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC (Verdünnung 1:3000) oder gegen jeden anderen bakteriellen Marker ausschließlich die Bindung an die LCV-Membran. Vortex der Antikörper-Lösung, bevor Sie es zum Homogenat. Inkubieren Sie die Probe für 1 Stunde auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C
- In der Zwischenzeit bereiten die Histodenz Gradienten. Verwenden Sie eine 15-ml-Reagenzglas pro Steigung und drei 75 cm 2-Kolben von einer Probe. TanneSt, 5,75 ml 35% Histodenz an das Rohr, und zweitens, vorsichtig 5,75 ml 10% Histodenz Lösung an der Spitze. Danach legen Sie es vorsichtig nach unten die Rohre horizontal für 1 Stunde.
- Nach der Inkubation des Homogenats mit dem Blockierungsreagenz und dem primären Antikörper, Zentrifuge bei 600 × g für 15 min bei 4 ° C bis Pellet die Probe. Überstand verwerfen und das Pellet in 1,5 ml HS-Puffer. Übertragen Sie die Proben in ein frisches 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 40 ul Probe für die mikroskopische Analyse später auf.
- Inkubieren Sie die Pellets mit dem sekundären Antikörper - MACS Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Mikro-Perlen (Verdünnung 1:25) - für 30 min auf einem Schüttler bei 4 ° C In der Zwischenzeit setzen die Spalten auf der MACS-Magnethalter und äquilibrieren sie mit 0,5 ml HS-Puffer.
- Anschließend gelten die Proben auf die Säule. Sammeln Sie 150 ul des Flow-Through für die anschließende mikroskopische Analyse. Die Säule wird dreimal mit 0,5 ml HS-Puffer.
- Entfernen Sie die Spalten aus ter Magnet und Eluat die leichte Nutzfahrzeuge mit 0,5 ml HS-Puffer durch unmittelbare spritzen. Werfen Sie einen 20 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Der Reinigungsschritt mittels Immuno-magnetische Trennung wird erwartet, dass pro 1 × 10 7 zu ergeben infiziert D. discoideum Zellen etwa 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge, die etwa das Siebenfache werden im Eluat gegenüber dem Durchfluss-13 angereichert.
- Setzen Sie die Histodenz Gradienten Rohre zurück in eine vertikale Position und laden Sie das Eluat vorsichtig an der Spitze. Zentrifugieren bei 3350 × g für 1 Stunde bei 4 ° C
- Nach der Zentrifugation nehmen 1,5 ml Fraktionen von unten beginnend von dem Reagenzglas mit Hilfe eines langen Pasteurpipette aus Glas. Insgesamt acht Fraktionen zu sammeln, die jeweils von der Unterseite des Rohres. Keine sichtbaren Schichten werden in der kontinuierlichen Histodenz Gefälle beobachtet. Die höchste Ausbeute von leichten Nutzfahrzeugen wird typischerweise in der Fraktion 4 in einem Verhältnis von ~ 2 × 10 5 erwarten intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 1 x 10 7betroffen Amöben 13. Kleinere Mengen von leichten Nutzfahrzeugen sind auch in den Fraktionen 3 und 5 vorhanden ist, beziehungsweise. Somit ist die Gesamtausbeute des gereinigten leichten Nutzfahrzeugen ~ 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 6 × 10 7 infiziert D. discoideum Zellen 13. Die Rückgewinnung von leichten Nutzfahrzeugen kann bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden, und die leichten Nutzfahrzeugen angezeigt mehrere Stunden lang stabil.
3. Mikroskopische Analysen der gesammelten Proben
- Bereiten Sie eine 24-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten mit Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser.
- Pipettieren Sie jede Probe während des LCV Reinigung plus 150 ul jeder Dichtegradienten Fraktion in die 24-Well-Platte aufgenommen. Fügen Sie 0,5 ml HS-Puffer in jede Vertiefung, um die hohe Histodenz Konzentration zu verdünnen. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fixieren Sie die Proben mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. Nach der Fixierung waschen die Proben zweimal. Unse Zauberin für D. discoideum und PBS für RAW264.7 Makrophagen.
- Montieren Sie die Proben von GFP-Expression Calnexin D. discoideum, auf verschiedenen Stufen während LCV Isolation, direkt auf Glas-Folien mit zB Vectashield genommen.
- Inkubieren der Proben von RAW264.7 Makrophagen, auf verschiedenen Stufen während der Transporter genommen, mit Blocking-Lösung (1% BSA in PBS) für 10 min bei RT. Verwenden Sie ein Anti-SidC primären Antikörpers an das leichte Nutzfahrzeuge Fleck und inkubieren für 1h in einer feuchten Kammer bei RT (affinitätsgereinigt Kaninchen-Anti-SidC; 1:1000 in Blocking-Puffer). Anschließend waschen Sie die Proben dreimal mit PBS. Inkubation mit einem sekundären Antikörper (zB Anti-Kaninchen-Cy5; 1:200 in Blocking-Lösung) für 30 min in einer feuchten und dunklen Kammer bei RT. Schließlich, waschen Sie die Proben dreimal mit PBS und montieren sie auf Glas-Folien mit zB Vectashield.
- Morphologie, Integrität und die Menge der leichten Nutzfahrzeugen von GFP-Expression isoliert Calnexin D. discoideum oder RAW264.7 Makrophagen werden durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den angemessenen Filtern ausgestattet analysiert.
4. Repräsentative Ergebnisse
Die Qualität und die Ausbeute an dem LCV Reinigung durch Immunaffinitätschromatographie Trennung und Dichtegradientenzentrifugation kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 1) befolgt werden. Eine Übersicht der Proben während des LCV isoliert von D. gesammelt discoideu m oder Makrophagen gezeigt (Abb. 2). Das Homogenat von L. pneumophila-infizierten Fresszellen zeigt intakte leichte Nutzfahrzeuge, sondern auch eine Menge von Zelltrümmern und extrazellulären Bakterien. Nach dem Pelletieren der Probe, ist das Bild ähnlich dem Homogenat, manchmal ein wenig dichter. Da intakte leichte Nutzfahrzeuge auf die Säule haften bleiben sollte, enthält die Durchströmung meist extrazellulären Bakterien und Zelltrümmer. Nach der Elution der Probe aus der Säule enthält das Eluat intakte leichte Nutzfahrzeuge in großen Mengen. In unseren Händen, das LCV purificati auf scheint wirksamer D. discoideum als für Makrophagen. In D. discoideum die Erreger Vakuolen erscheinen runder und die Ausbeute an isoliertem leichten Nutzfahrzeugen um mehr als 10 mal höher im Vergleich zu Makrophagen (Abb. 3). In intakten Makrophagen LVCs mit verschiedenen Antikörpern gefärbt erscheinen auch mehr unregelmäßig geformt.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der LCV Isolation. A) Isolierung von leichten Nutzfahrzeugen durch Immuno-magnetische Trennung mit Hilfe eines affinitätsgereinigten Antikörper gegen das bakterielle Protein-Effektor SidC, lokalisieren sich ausschließlich auf die LCV-Membran. Eine sekundäre MACS Mikro bead-gekoppelter Antikörper und einen Magneten verwendet, um leichten Nutzfahrzeugen von Zelltrümmern zu isolieren. B) Nach Immuno-magnetische Trennung leichten Nutzfahrzeugen werden durch Histodenz Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Leichte Nutzfahrzeuge werden in Fraktion 4 angereichert.
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Abbildung 2. Proben, die während LCV Reinigung gesammelt. Bilder aus Homogenat, Pellet-, Durchfluss-und Eluat aus D. discoideum oder Makrophagen dargestellt sind. Die Proben zeigen, L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin-Signal (grün, oben) oder in Makrophagen mit einem Anti-SidC Antikörper (Cyan, unteres Bild) gefärbt. Bars, 10 um.
Abbildung 3. Gereinigtes leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum oder Makrophagen. Die Proben zeigen Fraktion 4 nach Histodenz Dichtegradientenzentrifugation von L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in (a) D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin (grün) oder (B) in Makrophagen mit einem Anti-Antikörper SidC (Cyan) gefärbt. Bars, 10 um.
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Discussion
Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkomplizierte Methode, die bei der Anreicherung von leichten Nutzfahrzeugen mit hoher Reinheit führt. Wichtig ist, dass der Protease-Inhibitor im Homogenisierungspuffer für RAW264.7 Makrophagen erforderlich, jedoch optional von D. discoideum 13.
Im Prinzip kann das Protokoll für andere Pathogene oder Wirtszellen angenommen werden, solange eine bestimmte, selektiv lokalisiert Marker vorhanden ist, die für die Trennung Schritt benötigt. Idealerweise ist die deutliche Markierung bakteriellen Ursprungs, transportiert in die Vakuole Membran, eineND selektiv Lokalisierung gibt. Zielt auf eine Wirtszelle Marker wahrscheinlich zu der unerwünschten Co-Reinigung des Erregers Vakuole mit anderen Host-Kompartimenten.
Sobald ein unverwechselbares Marker des Erregers Vakuole identifiziert wird, muss eine geeignete polyklonaler oder monoklonaler Antikörper erhöht werden. Für jeden primären Antikörper die Konzentration und die Blockierungsreagenz sollten optimiert werden, wie Blockierungsreagenzien andere als FCS könnte besser geeignet sein (zB BSA, de-lipidierten Milch, andere im Handel erhältliche Blockierungsreagenzien).
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Infektiosität des Erregers. Die Bakterien zur Infektion verwendet werden, sollten in ihrer infektiösen Stadium sein. L. pneumophila, z. B. muss der post-exponential/early stationären Wachstumsphase in flüssiger Kultur gezüchtet werden. Unter diesen Bedingungen sind die Bakterien auch morphologisch einheitlichen (~ 2 x 0,5 Mikrometer), wie die Bakterien auf Agarplatten gezüchtet CYE entgegengesetzt. Darüber hinaus antibiotics gegebenenfalls in Zellkulturmedium muss vor einer Infektion zu niedrig Infektiosität und Schädigung der Bakterien zu vermeiden entfernt werden. Um eine negative Wirkung auf die Aufnahme Leistungsfähigkeit zu vermeiden, sollten die Phagozyten eine Konfluenz von etwa 80% (nicht mehr) zum Zeitpunkt der Infektion erreicht. Schließlich, obwohl eine Inkubationszeit von 1 h ist die Standard-Infektion Zeit für L. pneumophila, was eine eher homogene und stabile Population von leichten Nutzfahrzeugen, können auch andere Zeitpunkte für Proteom-oder biochemische Untersuchungen an LCV Formation 13 gewählt werden.
Wenn das obige Verfahren für eine bestimmte Pathogen-Wirtszelle Paar aufgebaut ist, ist es auch möglich, bakteriellen Mutanten und / oder verschiedenen Wirtszellen, einschließlich D. testen discoideum definierten Deletionsmutanten. Im Allgemeinen können Erreger Vakuolen mit diesem Protokoll gereinigt durch verschiedene Methoden, einschließlich Mikroskopie (Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie), biochemischen Assays (Western Blot) analysiert werden, wie wirll als Proteomik und Lipidomik. Für die letztgenannten Methoden ist es ratsam, mit den Verantwortlichen der Proteomik / Lipidomik Analyse die Pufferbedingungen, Probenmengen und Downstream Processing von gereinigtem Erreger Vakuolen zu koordinieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medical Infektion Genomics"-Initiative unterstützt ( 0315834C).
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